Summary
Vi tilpasset et sæt protokoller til måling af reaktive ilt arter (ROS), som kan anvendes i forskellige amøber og pattedyrs cellulære modeller for kvalitative og kvantitative undersøgelser.
Abstract
Reaktive ilt arter (ROS) omfatter en række af reaktive og kortlivede, oxygenholdige molekyler, som er dynamisk interkonverterede eller elimineres enten katalytisk eller spontant. På grund af de korte levetid af de fleste ROS og mangfoldigheden af deres kilder og subcellulære lokaliseringer kan et komplet billede kun opnås ved omhyggelige målinger ved hjælp af en kombination af protokoller. Her præsenterer vi et sæt af tre forskellige protokoller hjælp OxyBurst Grøn (OBG)-coatede perler eller dihydroethidium (DHE) og Amplex UltraRed (AUR), kvalitativt og kvantitativt at overvåge forskellige ROS i professionelle fagocytter såsom Dictyostelium. Vi optimeret perler belægning procedurer og brugte OBG-belagte kugler og levende mikroskopi til dynamisk visualisere intraphagosomal ROS generation på enkelt celle niveau. Vi identificerede lipopolysaccharid (LPS) fra E. coli som en potent stimulator for ROS generation i Dictyostelium. Desuden har vi developed realtid, medium-throughput analyser anvender DHE og AUR til kvantitativ måling af intracellulær superoxid og ekstracellulær H 2 O 2 produktion, hhv.
Introduction
Reaktive oxygenarter (ROS) er involveret i en lang række biologiske processer, såsom værtsforsvar signalering, væv udvikling og respons på skade samt forhøjet blodtryk og cancer. Den velundersøgte phagosomal NADPH oxidase maskiner er dedikeret til hurtig ROS generation, der er kendt som den oxidative burst, til at dræbe bakterier indtages i neutrofiler 'phagosomes 1. Desuden blev lækage af elektroner som et biprodukt af mitokondrie respiratoriske kæde tidligere troede at kun ansvarlig for en ureguleret kilde af ROS. Men for nylig blev det identificeret som en vigtig mekanisme til at bidrage til intraphagosomal drab af bakterier i musemakrofager 2. I de senere år har den sociale amøbe, Dictyostelium, bliver en magtfuld og populær model til at studere celle iboende mekanismer i medfødt immunrespons. Faktisk Dictyostelium og menneskelige fagocytter deler et overraskende højt niveau af beskyttelse i molecular machineries ansvarlige for bakterier sensing, engulfment og dræbte 3,4. De homologer af proteiner og enzymer i forbindelse med produktionen af ROS eller afgiftning såsom NADPH oxidaser, katalaser, superoxid dismutases, kan findes i både human-og Dictyostelium. Som bedst undersøgte amøber Dictyostelium præsenterer flere unikke fordele i forhold til pattedyr-modelsystem. De vokser ved stuetemperatur uden behov for CO 2, med en fordoblingstid på 8-10 timer. De kan nemt holdes som adhærente eller suspensionskulturer. Hertil kommer, takket være deres fuldt sekventeret og kommenteret haploidgenom, samt til nem genetisk manipulation har Dictyostelium blive et meget attraktivt eksperimentel model organisme.
I tidligere undersøgelser, forskellige chlorerede og fluorerede derivater af fluorescein (kollektivt kendt som OxyBurst Green, OGB) der udsender fluorescens efter oxidation af ROS, er blevet anvendt som en ROS reporter. Celle-permeant esterified derivater bruges til at måle cytoplasmatisk ROS, mens celle-impermeabel dextran-eller protein-koblede derivater bruges til at måle ekstracellulære ROS. Navnlig har OGB BSA-belagte kugler allerede blevet anvendt til at påvise phagosomal produktionen af ROS i pattedyrceller 5. Imidlertid kan mikropladelæseren tilgang kun give et gennemsnit ROS-generering kurven fra en population af celler. Med den nuværende protokol, ved hjælp af Dictyostelium, en professionel phagocyt og optimerede eksperimentelle betingelser, vi får en stabil og effektiv fagocytose uden conjugating nogen opsonin på perlerne. DHE har været anvendt i forskellige modelsystemer, såsom pattedyr neutrofiler og makrofager, for at påvise produktionen af ROS 6-9. I mellemtiden er der nogle kontroverser over specificitet og sensitivitet af metoden 8,10. Som en forbedret version af Amplex Red, fluorescensintensitet AUR er mindre følsomme over for pH-værdi, hvilket gør det mere egnet til at måleROS i ikke-neutrale eller svagt sure miljøer. AUR er for nylig blevet anvendt i flere pattedyrsystemer 11,12, men er ikke blevet rapporteret endnu dens anvendelse i nonmammalian modeller, som ofte kræver svagt surt vækstmedier,. Desuden er der ingen offentliggjorte protokol til kvantitativt og dynamisk måle ROS produktion og lokalisering i den sociale amøbe Dictyostelium.
Målet med den præsenterede sæt af protokoller er at give en nem og alsidig løsning til at overvåge forskellige ROS og deres lokalisering, og yderligere giver indsigt i ROS-relaterede cellulære mekanismer. For OBG analysen, brugte vi levende mikroskopi til at overvåge hele processen med phagosomal ROS generation efter optagelse af OBG-belagte kugler fra Dictyostelium celler og tilvejebragt en ny tilgang til at studere den mekanisme af intraphagosomal drab af bakterier. Vi har optimeret medium-throughput DHE og AUR assays i Dictyostelium at måle intracellulær Superoxide og ekstracellulære H 2 O 2-produktion, henholdsvis ved hjælp af LPS som en potent ROS stimulator. Bemærk, at LPS blev for nylig vist at forøge den baktericide aktivitet af Dictyostelium fremad fagocyteres bakterier 13. Desuden behandling med DEDTC og katalase udtrykkeligt bekræftet, at disse to metoder, der specifikt måler forskellige typer og subcellulære lokaliseringer af realkreditobligationer i Dictyostelium. Endelig kan OGB assay tilpasset vedhængende fagocytisk celle, ved yderligere opsoniserende perlerne med ligander for fagocytiske receptorer af dyreceller. I princippet kan DHE og AUR assays også finjusteres til målinger i vedhængende eller nonadhærente celle under passende eksperimentelle betingelser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1.. Visualisering og Kvalitativ måling af ROS Produktion i Phagosomes
De OBG-belagte kugler bør være forberedt på forhånd. De perler overtrækningsprocedurer og agaroverlejring teknik er tilpasset fra offentliggjorte referencer 5,14.
- Tilsæt 1 ml suspension af 3,0 mM carboxylerede silicaperler (ca. 1,8 x 10 9 perler) i et 1,5 ml rør, vaske perlerne 3x med 1 ml PBS ved hurtig spin og vortex.
- Resuspendere perlerne i 1 ml PBS indeholdende 25 mg / ml cyanamid (for at aktivere de carboxylerede silicaperler kovalent binder prelabeled BSA), inkuberes på et hjul i 15 min.
- Vask 3x med 1 ml koblingsbuffer (0,1 M natriumborat, pH 8,0) ved hurtig centrifugering (centrifuge ved fuld hastighed i en bordplade mini centrifuge i 5 sek eller alternativt centrifugeres ved 2.000 xg i 1 min i en bordplade centrifuge), og vortexing at fjerne overskydende cyanamid.
- Bland de vaskede kugler med 500 pi coupling buffer indeholdende 1 mg OxyBurst Grøn (OBG) H2HFF (dihydro-2 ', 4,5,6,7,7'-hexafluorofluorescein)-BSA, fylde rør med nitrogen gas fra en standard gas kan, før capping, og inkuber på et hjul i 14 timer (natten over) ved stuetemperatur i mørke.
- Vask perlerne 2x med 1 ml af quenching-buffer (250 mM glycin i PBS) for at fjerne uomsat OGB og to gange med koblingsbuffer at fjerne quenching-buffer ved hurtig centrifugering og vortexbehandling.
- Tilsæt 1 ml koblingsbuffer indeholdende 50 ug Alexa Fluor 594 succinimidylester at konjugere til BSA. Fyld røret med nitrogen før capping, og inkuberes på et hjul i 1,5 timer ved stuetemperatur i mørke.
- Vask perlerne 3x med 1 ml quenching puffer ved hurtig centrifugering og hvirvelbehandling for at standse reaktionen, og derefter vaske perlerne 3x med 1 ml PBS ved hurtig centrifugering og vortexbehandling.
- Endelig resuspendere perlerne i 1 ml PBS med 2 pi af 10% w / v azid til langtidsopbevaring. Mål concentration af perler i suspensionen med et hæmocytometer (normalt omkring 1-2 x 10 9 perler / ml), fyldes røret med nitrogen før capping, og opbevares ved 4 ° C i mørke.
- Belægningen effektivitet OGB fluorescein kan testes ved at kontrollere emissionsspektret ved hjælp af excitation ved 500 nm. Når oxideres af H 2 O 2 i nærvær af peberrodsperoxidase (HRP), fluorescensintensiteten af oxiderede perler ved spidsværdien (538 nm), er 11-12x højere end nonoxidized overtrukne perler.
- Harvest eksponentielt voksende Dictyostelium celler fra en 10 cm petriskål, tallerken forskellige tætheder af celler på 3 cm retter med en optisk klar plast eller glas bund, og dyrke dem natten over. Vælg de retter, der er omkring 80% sammenflydende til eksperimentet. En detaljeret protokol til dyrkning Dictyostelium celler er blevet offentliggjort 15..
- Udskift dyrkningsmediet med LoFlo medium (LF medium), inkuberes i2 timer før forsøget for at nedsætte det ekstracellulære og intraendosomal autofluorescens af HL5C dyrkningsmediet.
- Sideløbende smelte 10 ml 1,5% bacto agar i LF medium, hæld agar på en flad overflade (dvs. en glasplade på 10 cm x 10 cm) for at danne en agar-lag omkring 1 mm tyk, vente 10-15 min at størkne. Skær agarlag i 2 cm x 2 cm firkanter og plads i LF medium til senere brug.
- Mellemtiden forbereder spinning-disk eller bredt felt mikroskop, indstille temperaturen af de miljømæssige kammer ved 22 ° C og justere indstillingerne for dette eksperiment. (Se yderligere kommentarer i diskussionen).
- Efter 2 timer af inkubation, sug LF medium fra 3 cm skål, men cellemonolaget bør stadig være dækket af en tynd film af medium. Fortynd de coatede perler til 1,5 x 10 7 perler / ml og tilsættes 10 pi på cellelaget.
- Tag en firkantet agar plade, dræne overskydende væske, men beholde våd. Forsigtigt sat the agar ligge oven på cellelaget. Flyt ikke agar kvadrat, når den ligger på cellerne. Agaroverlaget bruges til at øge kontakten mellem perler og celler, hvorved optagelse bedre, og det er også let komprimerer celler, holde dem bedre i brændplanet af målet.
- Sæt låget på skålen, læg den på mikroskop scenen, og automatisk tage billeder i den røde, grønne og fase-kanaler hver 1 min i 2 timer eller længere.
- Vælg og fokusere på cellulære begivenheder, der indeholder hele processen med fagocytose. Flet de optimerede 3 kanaler og samle billederne i en film med professionel billedbehandling software. Kvantificere fluorescensintensiteter af hver enkelt udvalgt perler i røde og grønne kanaler, og forholdet mellem grøn / rød vil afspejle den dynamiske phagosomal ROS produktion af cellerne.
2. Kvantitative og Medium-throughput Måling af intracellulære superoxidproduktion
- Saml one 80% sammenflydende fad af Dictyostelium i 10 ml HL5C medium. Centrifuge Dictyostelium cellerne ved 850 xg i 5 min, omhyggeligt og fuldstændigt aspirer overskydende medium. Resuspender cellerne i SS6.4 buffer [0,12 M sorbitol i Sorensen buffer (14,69 mM KH 2 PO 4 og 6,27 mM Na 2 HPO 4), pH 6,4], tælle celler og fortyndes til en endelig tæthed på 6 x 10 6 celler / ml (se yderligere kommentarer i diskussionen).
- Der tilsættes 50 pi cellesuspension i hver brønd i en hvid uigennemsigtig plade med 96 brønde (se yderligere kommentarer i diskussionen).
- Fortynd DHE lager (30 mM i DMSO) 500 fold med SS6.4, pipette 50 ul fortyndet DHE i hver brønd med en multikanalpipette hvis nødvendigt. Slutkoncentrationen af DHE er 30 uM. Reaktionen starter straks.
- Stimuli eller inhibitorer kan tilsættes på dette tidspunkt, eller på andre tidspunkter i henhold til specifikke behov.
- Brug slutpunktet "top læsning & #34, tilstanden af en fluorescens mikropladeaflæser med fluorescens excitation / emission på 522 nm/605 nm, læse hver 2 min til 1 time, medium shake 5 sek / min ved 22 ° C.
3. Kvantitative og High Throughput Måling af Extracellular H 2 O 2 Produktion
- Følg de samme trin som beskrevet i 2.1 og 2.2.
- Forbered fortyndet HRP ved tilsætning af 5 pi HRP lager (100 E / ml i destilleret vand) i 10 ml SS6.4, vortex eller invertere røret for at blande godt og holde på is til senere brug. Den fortyndede HRP løsning er på 0,05 U / ml.
- Forbered AUR reaktionsblandingen ved at blande AUR lager (10 mM AUR i DMSO) og fortyndet HRP-opløsning i SS6.4 puffer til de endelige koncentrationer på 6,25 uM, og 0.005 U / ml. Som et eksempel, til fremstilling af reaktionsblandingen i 40 reaktioner, bland 1600 pi SS6.4 med 400 pi fortyndet HRP og 2,5 pi AUR stamopløsning.
- Tilsæt 50 ul af AUR mixTure i hver brønd med en multikanalpipette, hvis nødvendigt. Nu reaktionen starter.
- Stimuli eller inhibitorer kan tilsættes på dette tidspunkt, eller på andre tidspunkter i henhold til specifikke behov.
- Brug slutpunktet "top læsning" mode af en fluorescens mikro plade læser, med fluorescens excitation / emission på 530 nm/590 nm, læse hver 2 min til 1 time, medium shake 5 sek / min ved 22 ° C.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den generation af ROS i phagosomes kan visualiseres kvalitativt og dynamisk ved mikroskopi (File S1). Den røde fluorescens, der udsendes af Alexa Fluor 594 er pH-ufølsom og forbliver konstant i phagosomal miljø, mens oxidation af OBG øger sin fluorescens i den grønne kanal. Emissionsspektret af in vitro-oxideret og nonoxidized OGB-belagte kugler er sammenlignet i figur 1B, der viser en betydelig stigning i intensitet efter oxidation. For at lette visualisering af live-begivenheder, er de to kanaler lagt sammen, og farven skifter fra rød til orange under fagocytose af vildtype ax2 celler i 1 min på optagelse. Stigningen i grøn fluorescens indikerer ROS generation muligvis direkte i phagosome. Ved anvendelse af en mikropladelæser, medium-throughput kvantitativ måling af intracellulær superoxid og ekstracellulære H er vist 2 O 2-produktion i Figure 2C og 3B, hhv. Basal ROS produktion fra ax2 celler, muligvis fra regelmæssig oxido-reduktive stofskifte, der kan måles. Når cellerne stimuleret med LPS, er signalerne for ROS, steget betydeligt i begge assays. Derudover er der i DHE assay, faldet i blå fluorescens (dihydroethidium) og en forøgelse af rød fluorescens (ethidium) signaler er omvendt korreleret, som forventet. Lokaliseringen af ROS produktion målt ved både DHE og AUR analyser bekræftes i figur 2D og figur 3C, hhv. Tilsætning af DEDTC (a membranpermeerende superoxiddismutase (SOD)-hæmmer) 16 steg DHE signal og faldt AUR signal i en dosisafhængig måde, hvilket indikerer, at DEDTC forårsagede akkumulering af SOD substrat superoxid og udtømningen af SOD-produkt H 2 O 2 forventes fra reaktionen vist i figur 2A. Alternatively ved tilsætning af katalase (en membran impermeabel H 2 O 2 quencher) intracellulære superoxid signal fra DHE assay blev ikke påvirket, mens den ekstracellulære H 2 O 2 signal fra AUR assay faldt på en dosis-afhængig måde.
Figur 1. Princip og brug af OBG (OxyBurst Grøn) assay. A) OGB fluorescein og Alexa Fluor 594 er kovalent koblet til overfladen af 3 um silicaperler via BSA. Fluorescensemissionen fra OBG fluorescein angiver oxidering af ROS, mens signalet fra Alexa Fluor 594 hjælper lokalisere perlerne og tjener som kontrol til fluorescens kvantificering. B) In vitro test til coating effektivitet. H 2 O 2 og HRP anvendes til at oxidere de overtrukne perler i vitro. Under spændendetion ved 500 nm, de oxiderede perler viser en signifikant emission top ved 538 nm i forhold til den for nonoxidized perler med en intensitet forhold på mindst 11-12 gange.
Figur 2. Princip og brug af DHE (Dihydroethedium) assay. A) Resumé af de biokemiske reaktioner i relation til DHE og AUR analyser. B) i cytosolen, den membranpermeerende DHE har excitation og emission topper ved 370/420 nm, hhv. Som et resultat af oxidation af superoxid, ethidium er i stand til at indskyde i nukleart og mitokondrie-DNA, og har skiftet excitation og emission toppe ved 522/605 nm. Fluorescensintensiteten ethidium svarer til mængden af superoxid produktion inde i cellerne. C) Et repræsentativt eksperiment viser, at når de stimuleres med LPS, den dynamiske superoxid produktion fra Ax2 celler er væsentlig højere end det basale niveau fra stimulerede Ax2 celler, og på baggrund af reaktionen i buffer. Faldet i blå fluorescens og en forøgelse af rød fluorescens er omvendt korreleret som forventet. D) Ved behandling med forskellige koncentrationer af DEDTC (en membranpermeerende superoxid dismutase hæmmer), hældningen (RFU / min) ethidium produktionen stiger på en dosis- afhængig måde, mens behandling med katalase (en membran impermeabel H 2 O 2 quencher) ikke påvirker superoxid produktion. Klik her for at se større figur .
Figur 3. Princip og brug af AUR (Amplex UltraRed) assay. A) Membranen impermeabel AUR can oxideres til dets fluorescerende resorufin form AUR-ox ved H 2 O 2 i nærvær af en peroxidase (excitation og emission toppe ved 530 og 590 nm). Fluorescensintensitet AUR-ox svarer til mængden af H 2 O 2 produceret uden for cellerne. B) Et repræsentativt eksperiment viser, at når de stimuleres med LPS, den dynamiske H 2 O 2-produktion fra Ax2 celler er væsentlig højere end den basale niveau fra stimulerede ax2 celler og baggrunden reaktion. C) Ved behandling med forskellige koncentrationer af DEDTC eller katalase, hældningen (RFU / min) af AUR-ox-produktionen falder i en dosisafhængig måde, på grund af hæmning af H 2 O 2 produktion fra intracellulær superoxid og udtømning af ekstracellulær H 2 O 2, hhv. Klik her for at se størrefigur.
File S1. Film af dynamisk phagosomal ROS produktion i Dictyostelium celler. Den time-lapse film blev indspillet i 40 min ved levende mikroskopi, ved hjælp af en 60X forstørrelse. Under første minut efter optagelse ved fagocytose, fluorescens OBG fluoresceinmærkede coatede perler ændret fra rød til orange, hvilket indikerer, at ROS sandsynligvis blev produceret direkte inde i phagosomes. Klik her for at se film .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Sammenlignet med de tidligere beskrevne fremgangsmåder, OGB assayet dynamisk visualiserer processen phagosomal ROS-generering på enkelt celle niveau, i stedet for at måle en gennemsnitlig ROS signal fra en population af celler. Sådanne befolkning-gennemsnitsperioder metoder tendens til at tilsløre vigtige oplysninger forårsaget af asynkrone fagocytose. Vi har med held tilpasset DHE og AUR assays til Dictyostelium og optimeret protokollerne. Vigtigst er det, vi specificerede typer og subcellulære lokaliseringer af ROS målt ved disse to analyser. Tilsammen hele sættet af ROS måling protokoller for Dictyostelium giver et nyttigt og kraftfuldt system til at studere ROS-relaterede cellulære mekanismer, såsom medfødte immunitet, celledifferentiering og intracellulær signalering.
For OBG analysen, udarbejdelse af coatede perler er afgørende for succes i forsøget. På grund af kompleksiteten af receptor-medieret fagocytisk optagelse i pattedyrn celle, skal opsoniseret (f.eks IgG'er) til at udløse indtagelse partiklerne. Lav optagelse effektivitet i pattedyrceller alvorligt begrænser visualisering af enkelte begivenheder phagosomal ROS generation. Satsen for fagocytose i Dicytostelium er blevet observeret til at være 10-20 gange højere end i en makrofag 17, og med den nuværende protokol, vi opnåede robust og effektiv fagocytose uden conjugating nogen opsonin på perlerne. Dette er ikke kun forenkler perle-coating procedure, men reducerer risikoen for oxidation af OGB fluoresceinfarvestoffet under manipulation. Da OGB fluorescein kan oxideres ved hjælp af lys og oxygen, reagenset skal beskyttes mod udsættelse for omgivende lys og luft så meget som muligt (f.eks bruge aluminiumsfolie til at dække rør og fylde røret med nitrogen eller en anden inert gas), især for langtidsopbevaring.
For levende billeddannelse, kan cellerne være belagt på forskellige retter med optisk cLear bunde. Mens Dictyostelium klæber lidt bedre til plast, de fleste pattedyrceller (se nedenfor) holde lige så godt til glas. Et andet vigtigt skridt for optimal billeddannelse er at udruge Dictyostelium celler i LF medium (lav fluorescens baggrund) i mindst 2 timer før du fortsætter til de billeddannende trin. Fordi baggrund grønne fluorescenssignal dyrkningsmediets (HL5C) skal være udtømt fra deres endosomale rum for at undgå interferens med signalet genereret fra oxiderede overtrukne perler. Vi anbefaler også stærkt at udføre mindst én pilot eksperiment for at optimere indstillingerne for mikroskop (f.eks laser intensitet, eksponeringstid, etc.), især for den grønne kanal. Perlerne konstant udsender stærk rød fluorescens under hele eksperimentet, men den grønne fluorescens forøges ved reaktion med ROS umiddelbart efter fagocytose og plateauer inden for 5-10 min. Derfor er det bedre at justere indstillingerne for green kanal nær slutningen af forsøget, når den grønne fluorescens fra de fleste af perlerne kan være fuldt visualiseres. Når indstillingerne er optimeret, gemme den til fremtidige eksperimenter for at opnå reproducerbare resultater.
Under OBG analysen, bør raske celler fortsætte deres tilfældig motilitet og ikke runde op. Ellers er dette et tegn på cellebeskadigelse, som kan være forårsaget enten af tørring af agaroverlaget eller overdreven laserintensitet. Derfor holde tilstrækkelig væske på agaroverlaget for varigheden af hele eksperimentet og også holde laser intensitet og eksponeringstid så lavt som muligt.
I AUR og DHE analyser, hældningen på fluorescens læsning kurver viser en dosisafhængig sammenhæng med mængden af celler, der anvendes i hver brønd inden for et bestemt interval. For at opnå de mest reproducerbare resultater, er det vigtigt at anvende identiske antal af celler for hver betingelse for et eksperiment. Desudensom følge af variationer i cellestørrelse mellem de forskellige celletyper, er det stærkt antydet, at under pilotforsøg, er forskellige fortyndinger testes for at opnå en cellemonolag efter binding ved brøndbunden. For Dictyostelium AX2 celler, 3 x 10 5 celler danner et monolag, og denne celledensitet gælder også for mange andre Dictyostelium vildtype-og mutantstammer. For at opnå nøjagtige celletal, er det bedst at tælle efter centrifugering, ikke før, da centrifugering og pellet resuspension trin kan medføre nogle celletab. Vi anvender en automatiseret celletæller at tælle efter resuspendere cellepelleten (virker bedst med celledensiteter over 6 x 10 6 celler / ml), derefter præcist fortynde celleprøver til 6 x 10 6 celler / ml.
For DHE og AUR analyser, kan lave signaler skyldes brug af nonoptimal 96-brønds plader, og derfor anbefaler vi at bruge hvide uigennemsigtige plader med 96 brønde. Sammenlignet med sort eller transparentENT plader, er det erobrede fluorescerende signal forstærkes af overvejelser om den hvide overflade, hvilket øger signal-til-støj-forhold. Ulempen af hvide uigennemsigtige plader er, til tider, kan stærke fluorescerende signaler sive ind tilstødende brønde. Men ved hjælp af 100 ul reaktion volumen og den beskrevne probekoncentration, vi ikke afsløre eventuelle utætte signal i både DHE og AUR analyser. Desuden anbefaler vi at udføre nogle pilotforsøg til optimering af fluorescens følsomhed pladelæser. Tager SynergyMX pladelæser som et eksempel, følsomhed 100 og 70 fungerer bedst for DHE og AUR assay hhv. Desuden er det vigtigt at overvåge den specifikke excitations-og emissionsspektre af betingelserne for forsøget, med celler. Faktisk har vi observeret en forskydning af den maksimale udledning for AUR til 590 nm i forhold til de 581 nm, der er nævnt af producenten. Endelig har vi fået en anelse bedre resultater ved spændende ved 530 nm i stedet for 568nm foreslået af producenten.
Sammenlignet med en AUR stamopløsning DHE stamopløsning er meget mere tilbøjelige til oxidation, selv når det beskyttes mod lys ved -20 ° C. Således er det bedre at bruge DHE lager inden for 10 dage efter opløsning af pulveret. Hvis farven af stamopløsningen skifter fra grå til lilla eller pink, kassere det og forberede frisk fra pulver 18.
I AUR analysen, kan både AUR og HRP blive taget op af macropinocytosis. Derfor fluorescerende signal, der resulterer fra oxidering af H 2 O 2 kan også delvist genereres inde i macropinosomes. Men da AUR og HPR ikke trænge cellemembraner signalet måles inde i macropinosomes af AUR assayet er stadig topologisk ækvivalent med et ekstracellulært signal, i modsætning til et signal, der frembringes i cytosolen.
Baseret på en række indledende test for både DHE og AUR assays,fremgår det vigtigt at anvende en simpel buffer, der ikke indeholder glucose eller andre biologiske medier komponenter, fordi de stærkt interferere med begge analyser og resultere i en høj kulturgenstandsspor fluorescenssignal. Derfor bruger vi Sorensen fosfat buffer suppleret med 0,12 M sorbitol, en ufordøjelig osmolyt bruges til at sætte en osmolaritet svarende til den Dictyostelium dyrkningsmediet 19. Bemærk, at det høje indhold af iso-osmotisk buffere anvendes til mammale celler, såsom PBS salt, er til skade for Dictyostelium.
De protokoller, der præsenteres her, kan ikke måle alle mulige ROS, såsom hypochlorit, hydroxyl radikaler og singlet oxygen, og deres subcellulære lokaliseringer. En mere omfattende billede af ROS generation er stadig begrænset af tilgængeligheden og udvikling af specifikke prober.
Dette sæt protokoller kan nemt tilpasses til andre celler, herunder pattedyrceller fagocytter med følgende modification. For eksempel i OGB assay medium uden FCS og phenolrødt kan anvendes til at opnå en lav baggrundsfluorescens. I DHE og AUR assays kan PBS-buffer kan anvendes i stedet for SS6.4, og antallet af celler udpladet i hver brønd for at opnå en sammenflydende lag kan tilpasses ved trial and error, efter deres størrelse. Koncentrationerne af HRP AUR og DHE kan også optimeres i pilotforsøg for at opnå de mest følsomme resultater. Dog bør de mulige negative virkninger af DMSO testes ved anvendelse af forhøjede koncentrationer af AUR og / eller DHE reagenser. Vi har testet DHE og AUR assays held med en anden protozo, Acanthamoeba castellanii og med en mus BV2 microglia cellelinje. Desuden kan DHE og AUR assays også anvendes til at måle ROS-generering under værtspatogene interaktioner, for eksempel under infektion Dictyostelium eller Acanthamoeba af Mycobacteria marinum.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklæret.
Acknowledgments
Vi er taknemmelige for Drs Karl-Heinz Krause og Vincent Jaquet for hjælp og rådgivning til at etablere disse protokoller, og takker også Christoph Bauer og Jérôme Bosset fra Bioimaging Platform for NCCR og Dr. Navin Gopaldass for deres tekniske support. Forskningen er støttet af en ProDoc tildeling af den schweiziske National Science Foundation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| REAGENTS | |||
| OxyBURST Green H2HFF BSA | Invitrogen | O-13291 | |
| Alexa Fluor 594 | Invitrogen | A-20004 | |
| Carboxylated silica beads | Kisker Biotech | PSi-3.0COOH | |
| HL5C medium | ForMedium | HLC0102 | |
| LoFlo medium | ForMedium | LF1001 | |
| Bacto agar | BD | 204010 | |
| Dihydroethidium | Sigma | 37291-25MG | |
| Amplex UltraRed | Invitrogen | A36006 | |
| Horseradish peroxidase | Roche | 10108090001 | |
| Diethyldithiocarbamate (DEDTC) | Sigma | D3506-100G | |
| Catalase | Sigma | C9322-1G | |
| Cyanamide | Sigma | 187364-25G | |
| Lipopolysaccharides | Sigma | L2630-25G | |
| EQUIPMENT | |||
| ibidi μ-Dish 35 mm, high | ibidi | 81156 | Bottom made of optically clear plastic |
| MatTek dish 35 mm | MatTek corporation | P35G-1.5-14-C | Bottom made of a glass coverslip |
| Scepter Cell Counter | Merck Millipore | PHCC00000 | |
| White 96 well plate | Nunc | 236108 | |
| Centrifuge | SORVALL | Legend RT | |
| Microplate reader | BioTek | Synergy Mx | |
References
- Bedard, K., Krause, K. H. The NOX family of ROS-generating NADPH oxidases: physiology and pathophysiology. Physiol. Rev. 87, 245-313 (2007).
- West, A. P., et al. TLR signalling augments macrophage bactericidal activity through mitochondrial ROS. Nature. 472, 476-480 (2011).
- Fey, P., Gaudet, P., Pilcher, K. E., Franke, J., Chisholm, R. L. dictyBase and the Dicty Stock Center. Methods Mol. Biol. 346, 51-74 (2006).
- Basu, S., et al. dictyBase 2013: integrating multiple Dictyostelid species. Nucleic Acids Res. 41, 676-683 (2013).
- VanderVen, B. C., Yates, R. M., Russell, D. G. Intraphagosomal measurement of the magnitude and duration of the oxidative burst. Traffic. 10, 372-378 (2009).
- Cohn, C. A., Simon, S. R., Schoonen, M. A. Comparison of fluorescence-based techniques for the quantification of particle-induced hydroxyl radicals. Part. Fibre Toxicol. 5, 2 (2008).
- Snyrychova, I., Ayaydin, F., Hideg, E. Detecting hydrogen peroxide in leaves in vivo - a comparison of methods. Physiol. Plant. 135, 1-18 (2009).
- Rodrigues, J. V., Gomes, C. M. Enhanced superoxide and hydrogen peroxide detection in biological assays. Free Radic. Biol. Med. 49, 61-66 (2010).
- Chen, J., Rogers, S. C., Kavdia, M. Analysis of Kinetics of Dihydroethidium Fluorescence with Superoxide Using Xanthine Oxidase and Hypoxanthine Assay. Ann. Biomed. Eng. , (2012).
- Lee, C. W., Chen, Y. C., Ostafin, A. The accuracy of Amplex Red assay for hydrogen peroxide in the presence of nanoparticles. J. Biomed. Nanotechnol. 5, 477-485 (2009).
- Guimaraes-Ferreira, L., et al. Short-term creatine supplementation decreases reactive oxygen species content with no changes in expression and activity of antioxidant enzymes in skeletal muscle. Eur. J. Appl. Physiol. 112, 3905-3911 (2012).
- Peng, D., et al. Glutathione peroxidase 7 protects against oxidative DNA damage in oesophageal cells. Gut. 61, 1250-1260 (2012).
- Walk, A., et al. Lipopolysaccharide enhances bactericidal activity in Dictyostelium discoideum cells. Dev. Comp. Immunol. 35, 850-856 (2011).
- Fukui, Y., Yumura, S., Yumura, T. K. Agar-overlay immunofluorescence: high-resolution studies of cytoskeletal components and their changes during chemotaxis. Methods Cell Biol. 28, 347-356 (1987).
- Fey, P., Kowal, A. S., Gaudet, P., Pilcher, K. E., Chisholm, R. L. Protocols for growth and development of Dictyostelium discoideum. Nat. Protoc. 2, 1307-1316 (2007).
- Bloomfield, G., Pears, C. Superoxide signalling required for multicellular development of Dictyostelium. J. Cell. Sci. 116, 3387-3397 (2003).
- Dieckmann, R., Gopaldass, N., Escalera, C., Soldati, T. Autophagosomes and Phagosomes. Methods in Molecular Biology. Deretic, V. 445, Humana Press. Totowa, NJ. 317-328 (2008).
- Amir, Y., Edward, O. -A., Utpal, B. A protocol for in vivo detection of reactive oxygen species. Proto. Exch. , (2008).
- Neuhaus, E. M., Soldati, T. A myosin I is involved in membrane recycling from early endosomes. J. Cell Biol. 150, 1013-1026 (2000).
