Summary
Nós adaptamos um conjunto de protocolos para a medição de espécies reativas de oxigênio (ROS) que podem ser aplicados em vários modelos celulares ameba e mamíferos para estudos qualitativos e quantitativos.
Abstract
Espécies reativas de oxigênio (ROS) compreendem uma gama de moléculas reativas e de curta duração contendo oxigênio, que são dinamicamente interconvertidos ou eliminados ou cataliticamente ou espontaneamente. Devido aos curtos períodos de vida da maioria ROS ea diversidade de suas fontes e localizações subcelulares, um quadro completo só pode ser obtida por meio de medições cuidadosas usando uma combinação de protocolos. Aqui, apresentamos um conjunto de três protocolos diferentes usando OxyBurst Green (OBG) revestida de contas, ou dihydroethidium (DHE) e Amplex Ultrared (AUR), para monitorar qualitativa e quantitativamente vários ROS em fagócitos profissionais, como Dictyostelium. Nós otimizamos os processos de revestimento contas e miçangas OBG revestidos usados e microscopia ao vivo para visualizar dinamicamente intraphagosomal geração ROS no nível de uma única célula. Foram identificados lipopolissacarídeo (LPS) de E. coli como um potente estimulador para a geração de ROS em Dictyostelium. Além disso, nós dtempo real eveloped, ensaios de médio rendimento, utilizando DHE e AUR para medir quantitativamente superóxido intracelular e extracelular H 2 O 2 a produção, respectivamente.
Introduction
Espécies reativas de oxigênio (ROS) estão envolvidos em uma ampla variedade de processos biológicos, tais como a defesa do hospedeiro, a sinalização, o desenvolvimento do tecido e resposta à lesão, bem como hipertensão e câncer. O phagosomal NADPH oxidase máquinas bem estudado é dedicado a geração de ROS rápida, conhecida como a explosão oxidativa, para matar as bactérias ingeridas em phagosomes dos neutrófilos 1. Além disso, o vazamento de elétrons como um subproduto da cadeia respiratória mitocondrial foi previamente pensado para ser responsável apenas por uma fonte não regulamentada de ROS. Mas, recentemente, foi identificado como um mecanismo importante para contribuir para a matança intraphagosomal de bactérias nos macrófagos do rato 2. Nos últimos anos, a ameba social Dictyostelium, tornou-se um modelo poderoso e popular para o estudo de células mecanismos intrínsecos da resposta imune inata. De fato, Dictyostelium e fagócitos humanos partilham uma surpreendentemente alto nível de conservação em molecular máquinas responsáveis por bactérias sentindo, imersão e matando 3,4. Os homólogos de proteínas e enzimas relacionadas com a produção de ROS e toxinas, tais como oxidase de NADPH, catalases, superóxido dismutase, pode ser encontrado em humanos e Dictyostelium. À medida que a ameba melhor estudada, Dictyostelium apresenta várias vantagens únicas sobre sistema modelo de mamíferos. Eles crescer à temperatura ambiente, sem a necessidade de CO 2, com um tempo de duplicação de 8-10 horas. Eles podem ser facilmente mantidas como culturas aderentes ou em suspensão. Além disso, graças ao seu genoma haplóide completamente seqüenciado e anotado, e para a manipulação genética fácil, Dictyostelium tornou-se um modelo muito atraente organismo experimental.
Em estudos anteriores, vários derivados clorados e fluorados de fluoresceína (conhecidos coletivamente como OxyBurst verde, OBG) que emitem fluorescência após a oxidação por ROS, têm sido usados como um repórter ROS. Cell-permeante esterified derivados são usados para medir citoplasmática ROS, enquanto dextrano ou derivados acoplados à proteína de células-impermeabilizante são usados para medir ROS extracelular. Em particular, grânulos de OBG-ASB revestidas já tiverem sido usadas para detectar a produção de ROS phagosomal em células de mamíferos 5. No entanto, a abordagem baseada em leitor de microplacas só pode dar uma curva de geração de ROS em média de uma população de células. Com o presente protocolo, usando Dictyostelium, um dos fagócitos profissionais e condições experimentais otimizadas, obtemos fagocitose estável e eficiente, sem conjugar qualquer opsonina sobre as contas. DHE tem sido usada em vários sistemas de modelos, tais como os neutrófilos e macrófagos de mamífero, para detectar a produção de ROS 6-9. Enquanto isso, existem algumas controvérsias sobre a especificidade e sensibilidade do método 8,10. Como uma versão melhorada de Amplex Red, a intensidade de fluorescência de AUR é menos sensível ao pH, o que torna mais adequado para medirROS em ambientes não-neutras ou fracamente ácidas. AUR foi recentemente aplicado em vários sistemas de mamíferos 11,12, mas a sua utilização em modelos não mamíferos, o que muitas vezes necessitam de meios de crescimento ligeiramente ácido, não tem sido relatado ainda. Além disso, não existe um protocolo publicado quantitativamente e dinamicamente medir a produção e localização ROS na ameba Dictyostelium sociais.
O objetivo do conjunto de protocolos apresentados é fornecer uma solução fácil e versátil para monitorar vários ROS e sua localização, e ainda dar insights sobre os mecanismos celulares relacionados com o ROS. Para o ensaio de OBG, usamos a microscopia ao vivo para acompanhar todo o processo de geração de ROS phagosomal após a captação de contas OBG revestidos por células Dictyostelium, e forneceu uma nova abordagem para estudar o mecanismo de matar intraphagosomal de bactérias. Nós otimizamos de médio rendimento DHE e AUR ensaios em Dictyostelium, para medir Superox intracelularide e H 2 O 2 extracelular produção, respectivamente, utilizando LPS como um potente estimulador de ROS. Observe que o LPS foi recentemente demonstrado que o aumento da actividade bactericida de Dictyostelium direcção bactérias ingeridas 13. Além disso, o tratamento com DEDTC e catalase confirmado explicitamente que estes dois métodos de medir especificamente diferentes tipos e localizações subcelulares de ROS em Dictyostelium. Finalmente, o ensaio de OBG pode ser adaptado a qualquer célula fagocítica aderente, por opsonizantes ainda mais os grânulos com ligandos para receptores de células fagocíticas animais. Em princípio, os ensaios de DHE e AUR pode ser também para medições em qualquer célula aderente ou não aderente em condições experimentais apropriadas aperfeiçoá-lo.
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Protocol
1. Visualização e medição qualitativa de ROS Produção em Fagossomos
As contas OBG revestidos deve ser preparado com antecedência. Os processos de revestimento miçangas e técnica agar são adaptados a partir de referências publicadas 5,14.
- Adicionar 1 ml de suspensão de 3,0 mM esferas de sílica carboxiladas (cerca de 1,8 x 10 9 esferas) em um tubo de 1,5 ml, lavar as contas 3x com 1 ml de PBS por centrifugação rápida e centrifugação.
- Ressuspender as pérolas em 1 ml de PBS contendo 25 mg / ml de cianamida (para activar as esferas de sílica carboxiladas para ligar covalentemente prelabeled BSA), incubar numa roda durante 15 min.
- Lavar 3x com 1 ml de tampão de acoplamento (borato de sódio 0,1 M, pH 8,0) por centrifugação rápida (centrífuga à velocidade máxima de um tampo de mesa mini-centrifuga-se durante 5 segundos, ou, alternativamente, centrifugar a 2.000 g durante 1 min numa centrífuga de bancada) e vórtex para remover o excesso de cianamida.
- Misturar os grânulos foram lavados com 500 mL de coupling tampão contendo 1 mg de verde OxyBurst (OBG) H2HFF (di-hidro-2 ', 4,5,6,7,7'-hexafluorofluorescein)-BSA, encher o tubo com gás azoto a partir de um padrão de gás pode antes de nivelamento, e incubar numa roda, durante 14 horas (durante a noite) à temperatura ambiente no escuro.
- Lave as contas 2x com 1 ml de tampão de têmpera (250 mM de glicina em PBS) para remover não reagiu OBG, e duas vezes com tampão de acoplamento para remover o tampão de têmpera por centrifugação rápida e centrifugação.
- Adicionar 1 ml de tampão de ligação contendo 50 ng de Alexa Fluor 594 éster de succinimidilo para conjugar a BSA. Encher o tubo com azoto antes de nivelamento, e incubar em uma roda durante 1,5 horas à temperatura ambiente no escuro.
- Lave as contas 3x com 1 ml de tampão de têmpera por centrifugação rápida e vortex para parar a reacção, em seguida, lavar as contas 3x com 1 ml de PBS por centrifugação rápida e centrifugação.
- Finalmente, voltar a suspender as pérolas em 1 ml de PBS com 2 mL de 10% w / v de azida para o armazenamento a longo prazo. Medir a concentration de grânulos em suspensão com um hemocitómetro (geralmente cerca de 1-2 x 10 9 contas / ml), encher o tubo com azoto antes de nivelamento, e armazenar a 4 ° C no escuro.
- A eficiência do revestimento da fluoresceína OBG pode ser testada, verificando o espectro de emissão com excitação a 500 nm. Quando oxidado por H 2 O 2 na presença de peroxidase de rábano (HRP), a intensidade de fluorescência de grânulos oxidadas, no pico de emissão (538 nm), é de 11-12x maior que a dos grânulos revestidos não oxidados.
- Colheita crescimento exponencial células Dictyostelium de um prato 10 centímetros Petri, placa diferentes densidades de células em três centímetros pratos com um plástico opticamente transparente ou com fundo de vidro, e cultivá-las durante a noite. Escolha os pratos que são cerca de 80% confluentes para o experimento. Um protocolo detalhado para o cultivo de células de Dictyostelium foi publicada em 15 de.
- Substituir o meio de cultura com meio loflo (médio LF), incubar2 horas antes da experiência, a fim de diminuir a autofluorescência extracelular e intraendosomal do meio de cultura HL5C.
- Em paralelo, o material fundido 10 ml de 1,5% de agar bacto em meio LF, verter o agar sobre uma superfície plana (isto é, uma placa de vidro de 10 cm x 10 cm), a fim de formar uma camada de agar de cerca de 1 mm de espessura, para esperar 10-15 min a solidificar. Cortar a camada de agar em 2 cm x 2 centímetros quadrados e coloque no meio LF para uso posterior.
- Enquanto isso, prepare a fiação de disco ou grande microscópio de campo, definir a temperatura da câmara ambiental a 22 ° C e ajustar as configurações para este experimento. (Veja os comentários adicionais na discussão).
- Após 2 horas de incubação, aspirar o meio LF a partir dos 3 cm de disco, mas a monocamada de células deve ainda ser coberto por uma fina película de meio. Dilui-se os grânulos revestidos a 1,5 x 10 7 esferas / ml, e adicionar 10 ul para a camada de células.
- Pegue uma folha de agar quadrado, drenar o excesso de líquido, mas manter molhado. Com cuidado, coloque ªe agar quadrados no topo da camada de células. Não mova o quadrado agar quando se está deitado sobre as células. O agar é utilizado para aumentar o contato entre esferas e células, melhorando assim a absorção, e também ligeiramente comprime as células, mantendo-as melhor no plano focal da objetiva.
- Coloque a tampa sobre o prato, coloque-o no palco microscópio e, automaticamente, tirar fotos nos canais vermelho, verde e fase a cada 1 min de 2 horas ou mais.
- Selecione e focar em eventos celulares que contêm todo o processo de fagocitose. Mesclar os 3 canais otimizados e montar as imagens em um filme usando o software de processamento de imagem profissional. Quantificar intensidades de fluorescência de cada contas selecionadas em canais vermelho e verde, ea proporção de verde / vermelho vai refletir a dinâmica phagosomal produção ROS das células.
2. Medição quantitativa e Média taxa de transferência de superóxido intracelular Produção
- Coletar one 80% confluentes prato de Dictyostelium, em 10 ml de meio HL5C. Células Centrífuga Dictyostelium a 850 xg durante 5 min, com cuidado e o excesso de meio completamente aspirado. Ressuspender as células em tampão SS6.4 [0,12 M de sorbitol em tampão de Sorensen (14,69 mM de KH 2 PO 4, e 6,27 mM de Na 2 HPO 4), pH 6,4], contagem de células e diluir para uma densidade final de 6 x 10 6 células / ml (ver comentários adicionais na discussão).
- Adicionar 50 ul de suspensão celular em cada poço de uma branca não transparente placa de 96 poços (ver comentários adicionais na discussão).
- Diluir estoque DHE (30 mM em DMSO) a 500 vezes com SS6.4, pipeta 50 ul de DHE diluída para cada poço utilizando uma pipeta de canais múltiplos, se necessário. A concentração final da DHE é de 30 uM. A reacção inicia-se imediatamente.
- Estímulos ou inibidores podem ser adicionados neste momento, ou em outros pontos de tempo de acordo com as necessidades específicas.
- Use o ponto de "leitura & # top final34, Modo de um leitor de microplacas de fluorescência, fluorescência com excitação / emissão a 522 nm/605 nm, ler todos os 2 minutos durante 1 hora, a vibração da média de 5 segundos / min, a 22 ° C.
3. Quantitativa e High Throughput Medição de Extracelular H 2 O 2 Produção
- Siga os mesmos passos descritos em 2.1 e 2.2.
- Prepare HRP diluída pela adição de 5 ul de estoque de HRP (100 U / ml em água destilada) em 10 ml de SS6.4, vórtice ou inverter o tubo para misturar bem e manter em gelo para posterior utilização. A solução HRP diluída é de 0,05 U / ml.
- Preparar a mistura de reacção por mistura de AUR o estoque AUR (AUR 10 mM em DMSO) e a solução diluída em tampão HRP SS6.4 para as concentrações finais de 6,25 jiM, e 0,005 U / ml, respectivamente. Como um exemplo, para preparar a mistura de reacção para 40 reacções, misturar 1,600 mL de SS6.4 com 400 ul de HRP e diluída com 2,5 ml de solução de estoque AUR.
- Adicionar 50 ul de mistura AURtura em cada poço utilizando uma pipeta de canais múltiplos, se necessário. Agora, a reacção começa.
- Estímulos ou inibidores podem ser adicionados neste momento, ou em outros pontos de tempo de acordo com as necessidades específicas.
- Use o ponto de modo final "top leitura" de uma micro leitor de placas de fluorescência, com fluorescência excitação / emissão a 530 nm nm/590, leia cada 2 minutos para 1 hora, a vibração da média 5 seg / min, a 22 ° C.
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Representative Results
A geração de ROS em phagosomes pode ser visualizada qualitativamente e dinamicamente por microscopia (S1 do ficheiro). A fluorescência vermelha emitida pela Alexa fluor 594 é insensível pH e mantém-se constante no ambiente phagosomal, enquanto que a oxidação de OBG aumenta a fluorescência no canal verde. O espectro de emissão de ensaios in vitro e oxidado OBG grânulos revestidos não oxidados são comparados na Figura 1B, que mostra um aumento significativo da intensidade após a oxidação. Para facilitar a visualização dos eventos ao vivo, os dois canais são fundidas e as mudanças de cor decorrentes de vermelho para laranja durante a fagocitose por células ax2 tipo selvagem dentro de 1 min de captação. O aumento na fluorescência verde indica a geração de ROS possivelmente diretamente no fagossomo. Utilizando um leitor de microplacas, de médio rendimento medição quantitativa de superóxido intracelular e extracelular H 2 O 2 de produção são mostrados na Figure 2C e na Figura 3B, respectivamente. Produção basal de células ROS AX2, possivelmente a partir do metabolismo do óxido-redutor regular, pode ser medido. Quando as células são estimuladas com LPS, os sinais para a produção de ROS são significativamente aumentados em ambos os ensaios. Além disso, no ensaio de DHE, a diminuição de fluorescência azul (dihydroethidium) e o aumento dos sinais de etídio (fluorescência vermelha) são inversamente correlacionadas, como esperado. A localização da produção ROS medido tanto DHE e ensaios AUR são confirmados na Figura 2D e Figura 3C, respectivamente. A adição de DEDTC (uma membrana permeante superóxido dismutase (SOD) inibidor) 16, um aumento do sinal de DHE e diminuiu o sinal de AUR em uma maneira dependente da dose, indicando que DEDTC causou a acumulação de o superóxido substrato SOD e o esgotamento do produto SOD H 2 O 2 a esperada a partir da reacção mostrada na Figura 2A. Alternatively, pela adição de catalase (uma membrana impermeabilizante H 2 O 2 quencher), o sinal de superóxido intracelular de ensaio DHE foi não afectada, enquanto que o H 2 O 2 extracelular sinal de ensaio AUR diminuiu de uma forma dependente da dose.
Figura 1. Princípio e utilização do ensaio de OBG (OxyBurst verde). A) fluoresceína OBG e Alexa fluor 594 estão acoplados de forma covalente à superfície de 3 mM esferas de sílica através de BSA. A emissão de fluorescência de fluoresceína de OBG indica a oxidação por ROS, enquanto que o sinal de Alexa Fluor 594 ajuda a localizar os grânulos e serve como controlo para a quantificação de fluorescência. B) Teste in vitro para a eficiência de revestimento. H 2 O 2 e HRP são usados para oxidar os grânulos revestidos in vitro. Sob excitção a 500 nm, os grânulos oxidados mostrar um pico significativo de emissão de 538 nm em comparação com a dos grânulos não oxidados, com um rácio de intensidade de pelo menos 11-12 vezes.
Figura 2. Princípio e utilização do ensaio de DHE (Dihydroethedium). A) Síntese das reações bioquímicas relacionadas com DHE e AUR ensaios. B) No citoplasma, a membrana permeante DHE tem picos de excitação e emissão de 370/420 nm, respectivamente. Como um resultado da oxidação por superóxido, etídio é capaz de se intercalar no ADN nuclear e mitocondrial e deslocou-se os picos de excitação e emissão de 522/605 nm, respectivamente. A intensidade de fluorescência de etídio corresponde à quantidade da produção de superóxido dentro das células. C) Uma experiência representativa mostra que, quando estimuladas com LPS, o super dinâmicoa produção de óxido de células AX2 é significativamente mais elevado do que o nível basal a partir de células estimuladas e AX2 o fundo da reacção em tampão. A diminuição da fluorescência azul e o aumento de fluorescência vermelha estão inversamente correlacionados como esperado. D) Quando tratados com várias concentrações de DEDTC (uma membrana permeante inibidor da superóxido dismutase), o declive (RFU / min) de etídio a produção aumenta em uma dose- forma dependente, enquanto o tratamento com catalase (uma membrana impermeabilizante H 2 O 2 supressor) não afeta a produção de superóxido. Clique aqui para ver maior figura .
Figura 3. Princípio e utilização do ensaio AUR (Amplex Ultrared). A) A membrana impermeabilizante AUR can ser oxidado para a sua forma fluorescente resorufina, AUR-boi, por H 2 O 2 na presença de uma peroxidase (picos de excitação e emissão de 530 e 590 nm, respectivamente). A intensidade de fluorescência de AUR-boi corresponde à quantidade de H 2 O 2 produzida fora das células. B) Uma experiência representativa mostra que, quando estimuladas com LPS, a dinâmica H 2 O 2 a partir de células de produção AX2 é significativamente mais elevado do que o basal nível a partir de células estimuladas e AX2 a reacção de fundo. C) quando tratados com várias concentrações de DEDTC ou catalase, o declive (RFU / min) de AUR-ox diminui a produção de uma forma dependente da dose, devido à inibição da H 2 O 2 produção de superóxido intracelular e esgotamento de H 2 O 2 extracelular, respectivamente. Clique aqui para ampliarfigura.
Arquivo S1. Filme da produção phagosomal ROS dinâmica em células Dictyostelium. O filme de lapso de tempo foi registrado por 40 min por microscopia ao vivo, usando uma ampliação de 60X. Durante o primeiro minuto após a absorção por fagocitose, a fluorescência da OBG contas revestidas de fluoresceína mudou de vermelho para laranja brilhante, indicando que ROS foram provavelmente produzidas diretamente dentro das phagosomes. Clique aqui para ver filme .
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Discussion
Em comparação com os métodos anteriormente descritos, o ensaio de OBG visualiza dinamicamente o processo de geração de ROS phagosomal ao nível da célula individual, em vez de medir o sinal médio ROS a partir de uma população de células. Tais métodos população de amostragem tendem a obscurecer a informação crítica causada por fagocitose não-sincrónico. Nós adaptado com sucesso DHE e AUR ensaios para Dictyostelium e otimizados os protocolos. Mais importante, nós especificados os tipos e localizações subcelulares de ROS medidos por esses dois ensaios. Tomados em conjunto, o conjunto de protocolos de medição ROS para Dictyostelium proporciona um sistema útil e poderoso para estudar os mecanismos celulares relacionadas com ROS, como a imunidade inata, a diferenciação das células e sinalização intracelular.
Para o ensaio de OBG, a preparação de grânulos revestidos é crítica para o sucesso da experiência. Devido à complexidade de captação fagocítica mediada pelo receptor em mamíferosn celular, as partículas necessitam de ser opsonizada (por exemplo, com as IgG) para desencadear a ingestão. Baixa eficiência de absorção em células de mamíferos limita severamente a visualização de eventos individuais de geração phagosomal ROS. A taxa de fagocitose em Dicytostelium tem sido observada como sendo de 10-20 vezes maior do que um macrófago 17, e com o presente protocolo, obtivemos fagocitose robusto e eficaz sem qualquer conjugar opsonina sobre as esferas. Isto não só simplifica o procedimento de revestimento de grânulo, mas reduz os riscos de oxidação do corante de fluoresceína OBG durante a manipulação. Desde OBG fluoresceína pode ser oxidado pela luz e pelo oxigénio, o reagente tem de ser protegido contra a exposição à luz e ar ambiente, tanto quanto possível (por exemplo, utilizar uma folha de alumínio para cobrir o tubo, e encher o tubo com azoto ou outro gás inerte), especialmente para o armazenamento a longo prazo.
Para geração de imagens ao vivo, as células podem ser semeadas em vários pratos com opticamente cbottoms lear. Enquanto Dictyostelium adere ligeiramente melhor ao plástico, a maioria das células de mamíferos (ver abaixo) aderem igualmente bem ao vidro. Outro passo importante para a imagiologia óptima é a incubar as células em meio de Dictyostelium LF (baixa fluorescência de fundo) para pelo menos 2 horas antes de se proceder aos passos de imagem. Uma vez que o sinal de fundo de fluorescência verde do meio de cultura (HL5C) precisa ser empobrecido de seus compartimentos endossomais para evitar a interferência com o sinal gerado a partir de esferas revestidas oxidados. Nós também recomendamos realizar pelo menos uma experiência piloto para otimizar as configurações do microscópio (por exemplo, de intensidade laser, tempo de exposição, etc), especialmente para o canal verde. As contas constantemente emitem forte fluorescência vermelha durante todo o experimento, mas a fluorescência verde aumenta em reacção com ROS imediatamente após a fagocitose e planaltos dentro de 5-10 min. Portanto, é melhor para ajustar as configurações para o green canal perto do fim da experiência, quando a fluorescência verde de a maior parte dos grânulos pode ser totalmente visualizadas. Uma vez que as configurações são otimizadas, guardá-lo para experiências futuras, a fim de obter resultados reprodutíveis.
Durante o ensaio OBG, as células saudáveis devem continuar sua motilidade aleatória e não completam. Caso contrário, isso é indicativo de danos em células, o que pode ser causado pela secagem da camada de agar e pela intensidade do laser excessiva. Assim, manter o líquido suficiente na camada de agar para a duração de toda a experiência e também manter a intensidade do laser e tempo de exposição tão baixos quanto possível.
Nos ensaios de AUR e DHE, o declive das curvas de leitura de fluorescência mostra uma relação dependente da dose, com a quantidade de células utilizadas em cada cavidade dentro de um determinado intervalo. A fim de alcançar os resultados mais reprodutíveis, é essencial utilizar idêntico número de células para cada uma das condições de uma experiência. Além disso,devido a variações no tamanho da célula entre diferentes tipos de células, é altamente sugerido que, durante as experiências piloto, diferentes diluições são testadas para se obter uma monocamada de células após fixação no fundo do poço. Para as células ax2 Dictyostelium, 3 x 10 5 células formam uma monocamada e esta densidade de células também se aplica a muitas outras cepas do tipo selvagem e mutantes Dictyostelium. A fim de se obter as contagens de células precisos, é melhor para contar, após a centrifugação, e não antes, uma vez que a centrifugação e ressuspensão da pelota passos podem provocar alguma perda de células. Usamos um contador de células automatizado para contar após ressuspensão do sedimento celular (funciona melhor com densidades de células acima de 6 x 10 6 células / ml), depois dilui-se com precisão as amostras de células de 6 x 10 6 células / ml.
Para os ensaios de DHE e AUR, sinais de baixa pode ser devido ao uso de placas de 96 poços não ótimos, e assim, recomendamos o uso de placas de 96 poços não transparentes brancas. Comparado com preto ou transparenteplacas ent, o sinal fluorescente capturado é intensificada pela reflexão sobre a superfície branca, aumentando a relação sinal-para-ruído. A desvantagem de placas não transparentes brancas é, às vezes, fortes sinais fluorescentes podem vazar em poços vizinhos. No entanto, através da utilização de 100 ul de volume de reacção e a concentração da sonda descrita, que não detectou qualquer sinal de vazamento em ambos DHE e ensaios de AUR. Além disso, recomendamos a realização de algumas experiências-piloto para otimizar a sensibilidade de fluorescência do leitor de placas. Tomando o leitor de placas SynergyMX como exemplo, sensibilidade de 100 e 70 funcionam melhor para o ensaio DHE e AUR, respectivamente. Além disso, é importante controlar os espectros de excitação e de emissão específicos nas condições da experiência, com as células. De fato, temos observado um deslocamento do máximo de emissão para AUR a 590 nm, em comparação com os 581 nm mencionadas pelo fabricante. Finalmente, obteve-se ligeiramente melhores resultados através da excitação a 530 nm em vez de 568nm sugerido pelo fabricante.
Em comparação com uma solução de estoque AUR, a solução estoque de DHE é muito mais propenso à oxidação, mesmo quando protegido da luz, a -20 ° C. Assim, é preferível utilizar o material de DHE no prazo de 10 dias após a dissolução do pó. Se a cor da solução muda de cinza para roxo ou rosa, descartá-lo e preparar fresco do pó 18.
No ensaio de AUR, tanto AUR e HRP pode ser tomada por macropinocitose. Portanto, o sinal de fluorescência resultante da oxidação por H 2 O 2 pode também ser parcialmente gerados dentro das macropinosomes. No entanto, uma vez que a retenção urinária aguda e HPR não penetram as membranas celulares, o sinal de medida no interior das macropinosomes pelo ensaio AUR é ainda topologicamente equivalentes a um sinal extracelular, em oposição a um sinal gerado no citosol.
Com base numa série de testes preliminares, tanto para DHE e ensaios AUR,afigura-se importante a utilização de um tampão simples que não contém glucose ou outros componentes de meios biológicos, uma vez que interferem fortemente com ambos os ensaios e resultar num sinal fluorescente artefatual alta. Portanto, podemos usar tampão fosfato de Sorensen complementado com 0,12 M de sorbitol, um agente osmótico não digerível utilizado para definir uma osmolaridade similar à do meio de cultura de Dictyostelium 19. Note-se que o elevado teor de sal de tampões iso-osmótica utilizada para células de mamíferos, tais como PBS, é prejudicial para Dictyostelium.
Os protocolos aqui apresentados não se pode medir tudo possível ROS, como hipoclorito, radicais hidroxila e oxigênio singlete, e as suas localizações subcelulares. Uma imagem mais abrangente de geração de ROS ainda é limitada pela disponibilidade e desenvolvimento de sondas específicas.
Este conjunto de protocolos pode ser facilmente adaptada para outras células de mamíferos, incluindo fagócitos, com a seguinte modificção. Por exemplo no ensaio de OBG, meio sem FCS e vermelho de fenol pode ser usado para obter um baixo ruído de fundo de fluorescência. Em DHE e AUR ensaios, o tampão PBS pode ser usado em vez de SS6.4, e o número de células plaqueadas em cada cavidade para se obter uma camada confluente pode ser adaptado por tentativa e erro, de acordo com o seu tamanho. As concentrações de HRP, AUR DHE e também pode ser optimizado em experiências piloto, a fim de alcançar os resultados mais sensíveis. No entanto, os possíveis efeitos adversos da DMSO deve ser testado quando se utiliza concentrações aumentadas de AUR e / ou reagentes DHE. Nós testamos DHE e AUR ensaia com sucesso com outro protozoário, Acanthamoeba castellanii e com uma linha de rato BV2 célula microglia. Além disso, os ensaios de DHE e AUR também pode ser usado para medir a geração de ROS durante as interações patógeno-hospedeiro, por exemplo, durante infecção de Dictyostelium ou Acanthamoeba por Micobactérias marinum.
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Disclosures
Não há conflitos de interesse declarados.
Acknowledgments
Somos gratos aos Drs. Karl-Heinz Krause e Vincent Jaquet para ajuda e conselhos para configurar estes protocolos, e também agradecer Christoph Bauer e Jérôme Bosset da Plataforma Bioimaging do NCCR e Dr. Navin Gopaldass por seu apoio técnico. A pesquisa é apoiada por uma bolsa ProDoc da National Science Foundation suíço.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| REAGENTS | |||
| OxyBURST Green H2HFF BSA | Invitrogen | O-13291 | |
| Alexa Fluor 594 | Invitrogen | A-20004 | |
| Carboxylated silica beads | Kisker Biotech | PSi-3.0COOH | |
| HL5C medium | ForMedium | HLC0102 | |
| LoFlo medium | ForMedium | LF1001 | |
| Bacto agar | BD | 204010 | |
| Dihydroethidium | Sigma | 37291-25MG | |
| Amplex UltraRed | Invitrogen | A36006 | |
| Horseradish peroxidase | Roche | 10108090001 | |
| Diethyldithiocarbamate (DEDTC) | Sigma | D3506-100G | |
| Catalase | Sigma | C9322-1G | |
| Cyanamide | Sigma | 187364-25G | |
| Lipopolysaccharides | Sigma | L2630-25G | |
| EQUIPMENT | |||
| ibidi μ-Dish 35 mm, high | ibidi | 81156 | Bottom made of optically clear plastic |
| MatTek dish 35 mm | MatTek corporation | P35G-1.5-14-C | Bottom made of a glass coverslip |
| Scepter Cell Counter | Merck Millipore | PHCC00000 | |
| White 96 well plate | Nunc | 236108 | |
| Centrifuge | SORVALL | Legend RT | |
| Microplate reader | BioTek | Synergy Mx | |
References
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