Summary
Wir präsentieren die Prozedur, um eine Samenschale Bettwäsche-Assay (Pressluftatmer) aus Arabidopsis thaliana Samen zusammenzubauen. Der Pressluftatmer wurde gezeigt, dass ein leistungsfähiges Werkzeug, um genetisch und in vitro zu erforschen, wie die Kontrollen Endosperm die Keimung der Samen in ruhenden Samen und in Reaktion auf Licht Cues. Das Atemschutzgerät ist prinzipiell anwendbar unter jeder Situation, in der Mehlkörper wird vermutet, um embryonale Wachstum beeinflussen.
Abstract
Die Arabidopsis Endosperm besteht aus einer einzigen Zellschicht um den reifen Embryo und spielt eine wesentliche Rolle, um die Keimung von ruhenden Samen oder die der nondormant Samen von einem fernen Rot (FR) Lichtpuls bestrahlt verhindern. Um weitere Einblicke in die molekularen genetischen Mechanismen, die Keimung repressive Tätigkeit des Mehlkörpers ausgeübt zugrunde liegt, wurde ein "Samenschale Bettwäsche"-Test (Pressluftatmer) entwickelt. Das Atemschutzgerät ist ein Dissektion Verfahren physische Trennung Samenschalen und Embryonen aus Samen, die es ermöglicht die Überwachung des Wachstums von Embryonen auf einer darunter liegenden Schicht der Samenschalen. Bemerkenswert ist, rekonstruiert das Atemschutzgerät die Keim repressiven Aktivitäten der Samenschale im Rahmen der Samenruhe und FR-abhängige Steuerung der Keimung der Samen. Da das Atemschutzgerät ermöglicht die Verwendung von kombinatorischen ruhend, nondormant und genetisch veränderte Samenschale und embryonalen Materialien, die genetischen Signalwege steuern Keimung und speziell optriebs im Endosperm und Embryo kann zerlegt werden. Hier werden wir ausführlich die Prozedur, um einen Pressluftatmer montieren.
Introduction
In Arabidopsis reifen Samen wird der Samenmantel der Samenschale, einer äußeren Schicht von abgestorbenem Gewebe mütterlichen Ursprungs, und der Mehlkörper, einer einzigen Zellschicht der lebenden Gewebe des Embryos ein unmittelbar umgebenden zusammen. Das Endosperm und der Embryo aus getrennten Befruchtung Ereignisse abgeleitet: das Endosperm ist ein triploid Gewebe mit zwei Müttern und einem väterlichen Genoms während das Embryo ein diploiden Gewebes mit einer Mutter und einem väterlichen Genoms 2.
Die Hauptfunktion traditionell dem Endosperm zugeordnet ist, dass ein Nährgewebe. Jedoch ist es immer deutlicher, dass das Endosperm spielt auch eine zentrale Rolle bei der Samenkeimung steuern. Dieser Begriff wurde zunächst offensichtlich im Fall der Ruhe, ein Merkmal von neu produzierten Samen ausgestellt. Ruhenden Samen nicht, trotz der Anwesenheit von günstigen Keimbedingungen keimen. Samen verlieren ihre Keimruhe nach einer Reifezeit und werden nondormant, dh sie keimen, wenn günstige Keimbedingungen ausgesetzt. In vielen Pflanzenarten, darunter der Modellpflanze Arabidopsis wird die Samenschale zwingend erforderlich, um die Keimung von ruhenden Samen zu verhindern, da die Entfernung der Samenschale löst embryonale Wachstum und Begrünung 3,4. In Arabidopsis Bethke et al. Beobachtet, dass die Keimung blieb nach dem Entfernen der Samenschale, während der Mehlkörper rund um den Mehlkörper 5 verdrängte. Diese Beobachtungen stark an, dass die Mehlkörper wird das Gewebe innerhalb der Samenschale Ausüben einer repressiven Aktivitäten auf den Embryo. Allerdings glaube Samenschale Entfernung Experimente nicht unbedingt zur Klärung der Art der Keimung repressive Aktivität durch die Samenschale vorgesehen noch die Identifizierung der Gene, die es zu implementieren.
Wir vor kurzem eine Samenschale Bettwäsche-Assay (Pressluftatmer), wo Samenschalen und Embryonen sind physisch getrennt, aber in enger Nähe gehaltenerklärung, so dass die Keimung repressive Aktivität durch den Mehlkörper vorgesehen ist, gehalten 6. Das Atemschutzgerät ermöglicht die Verwendung von kombinatorischen ruhend, nondormant, und genetisch veränderte Samenschale und embryonalen Materialien. Als Ergebnis können die genetischen Bahnen Steuern Keimung und spezifisch im Endosperm und Embryo-Betriebs seziert werden. Das Atemschutzgerät wurde im Rahmen der Vegetationsruhe verwendet, um zu zeigen, dass der Mehlkörper gibt das Phytohormon Abscisinsäure (ABA) in Richtung der Embryo seine Wachstums 6 verdrängen. Darüber hinaus wir die Pressluftatmer nutzen könnten, um die Signalwege, die in Mehlkörpers und embryonalen Geweben zu identifizieren, um Ruhe zu fördern.
Die Rolle des Endosperms, um Keimung Kontrolle wurde weiter verstärkt, indem man den Fall der nondormant Samen auf einen Impuls des fernen Rot (FR) belichtet. Frühe auf Samenquellung ein Lichtimpuls FR ist bekannt, dass die Keimung hemmen 7,8. Wenn Samenschalen wurden aus Samen entfernt einen Impuls von Licht FRwar nicht in der Lage, um die Keimung hemmen, was stark darauf hindeutet, dass der Mehlkörper können auch die Keimung von Samen nondormant 9 verdrängen. Bemerkenswerterweise kann das Atemschutzgerät auch zur FR-abhängige Hemmung der Keimung zu rekapitulieren. Dies erlaubt zu zeigen, dass die FR-abhängige Hemmung der Keimung der Samen ist auch ein Prozess, der ABA-Freisetzung aus dem Mehlkörper 9. Darüber hinaus erlaubt die Identifizierung der verschiedenen Atemschutzlichtsignalwege, die in der Mehlkörpers und der Embryo nondormant die Keimung der Samen in Reaktion auf Licht Cues 9,10 steuern.
Das Atemschutzgerät scheint daher eine zuverlässige Technik, um die Funktion des Endosperms im Rahmen der Steuerung der Samenkeimung erkunden. Es ist auch ein leistungsfähiges Werkzeug, um in vitro beurteilen, ob Gene im Verdacht, die Keimung Kontrolle arbeiten im Endosperm, Embryo oder beiden Geweben. Hier werden wir ausführlich die verschiedenen Schritte erforderlich, um eine Atemschutz montieren.
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Protocol
Sobald das SCBA zusammengebaut ist, wird das Wachstum der Embryonen über mehrere Tage überwacht. Deshalb wird vor der Saat Dissektion Verfahren und die Montage des Atemschutzgerätes muss man Samen zu sterilisieren, um zukünftige Verunreinigungen, die angemessene Bewertung der Wirkung der Samenschale Material auf embryonale Wachstum verhindern könnten, zu vermeiden.
1. Seed Sterilisation
- Gießen 50-60 ul reife und trockene Arabidopsis-Samen in ein 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen und bereiten eine 70% ige Ethanollösung.
- 1 ml 70% Ethanol-Lösung zu der Mikrozentrifugenröhrchen mit den Samen und Schütteln bei Raumtemperatur für 10 min bei 1200 rpm in einem Vortexer.
- Zentrifugenmikrozentrifugenröhrchen für 3 Sekunden bei 4000 × g, um Samen am Boden des Röhrchens zu konzentrieren.
- Saugt den 70% igen Ethanollösung unter Verwendung einer Vakuum Absaugspitze vorsichtig Verlassen der Samen in den Boden des Mikrozentrifugenröhrchens.
- 1 ml sterilem destilliertem Wasser zu t Mikrozentrifugenröhrchen er immer noch mit den Samen.
- Schütteln bei Raumtemperatur für 10 min bei 1.200 Umdrehungen pro Minute.
- Zentrifugenmikrozentrifugenröhrchen für 3 Sekunden bei 4000 × g, um Samen am Boden des Röhrchens zu konzentrieren. Saugen Wasserstandes mit einer Vakuum-Saug-Spitze vorsichtig so dass die Samen an der Unterseite des Rohres.
- 1 ml sterilem Wasser destilliertes Wasser zum Mikrozentrifugenröhrchen noch mit den Samen. Sicherzustellen, dass die Strömung von Wasser homogen suspendiert die Samen im Inneren der Röhre. Das Ziel ist hier, um zu vermeiden weiterem Schütteln, um die Integrität der Samen zu bewahren.
- Lassen Sie die Samen sesshaft durch die Schwerkraft am Boden der Röhre, indem man das Rohr noch für 30 Sekunden. Saugen Wasserstandes mit einer Vakuum-Saug-Spitze vorsichtig so dass die Samen an der Unterseite des Rohres.
- Wiederholen Sie die Schritte vier mal 1,8 bis 1,9. Insgesamt ist das Sterilisationsverfahren dauert etwa 30 min.
2. Seed-Überzug
NHALT "> Alle weiteren Schritte werden in einer Sterilbank durchgeführt, um sterile Bedingungen zu wahren.- Vorbereitung einer Petrischale Platte (100 mm Durchmesser, 20 mm Höhe), die 30 ml Keimmedium durch Autoklavieren einer Lösung, die 4,3 g / l Murashige-Skoog-Medium mit 2,5 mM 2 - (N-Morpholino) ethansulfonsäure (MES-KOH , pH 5,7) und 0,8 g / L Agar. Lassen Sie die Lösung abkühlen, in einem 50 ° C Wasserbad vor dem Gießen auf der Petrischale Platte.
- Geben Sie 200 ul sterilem destilliertem Wasser auf das Rohr mit den Samen. Resuspendieren der Samen und übertragen Sie sie auf der Oberfläche der Keimmedium mit einem Standard-Pipette mit einer 1 ml-Spitze.
- Entfernen Sie das umgebende Wasser die Samen auf der Oberfläche der Keimmedium mit Hilfe eines Vakuum-Saug-Spitze.
- Verlassen Sie die Petrischale, die die Samen ohne Deckel in der Sterilbank für 2 Stunden zur weiteren Trocknung. Schließen Sie die Petrischale mit dem Deckel und lassen Sie es unter der Laminar-Standfließen Schrank für etwa 90 min, so daß etwa 4 Stunden seit der Initiierung der Samensterilisationsverfahren (Schritt 1.2) geleitet.
3. Seed Dissection
Die folgenden Schritte erfordern die Zusammenarbeit mit einem Stereomikroskop in der Sterilschrank gestellt. Eine Pinzette Dumont Nr. 5 mit abgeschnittenen (dh stumpf) Tipps erleichtert die Handhabung der Samen (Abbildung 1A).
- Bereiten Sie eine neue Petrischale Platte mit 30 ml Keimmedium. Platz auf der Oberfläche des Mediums zwei nebeneinander liegende rechteckige sterile Whatman 3MM Papiere (1,5 cm x 1,0 cm; 1B, Schritt 1). Whatman 3MM-Papier wird in einem Autoklaven sterilisiert.
- Übertragen Samen auf den Whatman 3MM Papier mit einer sterilen Pinzette (1B, Schritt 2).
- Halten Sie eine individuelle Saatgut vor der Whatman 3MM Papier vorsichtig Drücken der Samen mit den nebeneinander liegenden stumpfen Spitzen der Zange abgeschnitten (
- Schneiden der Samenschale (Testa und Endosperm) der Samen unter Verwendung einer Spritzennadel (z. B. U100 Insulinspritze + 1 ml Spritze, 0,33 mm (29 G) x 12,7 mm) (Fig. 1B, Schritt 4). Die Form der Arabidopsis-Samen ist ellipsenförmigen und es wird empfohlen, um die Samenschale entlang der längsten Halbhauptachse so nah wie möglich an den Ort, an dem die Keimblätter sind an der Keimwurzel (dh weg von der radikalen Spitze) beigetreten geschnitten. Dies hilft, die sichere Freilassung des Embryos in den nächsten Schritt der Prozedur der Präparation.
- Drücken Sie die Samen vor dem Whatman 3MM-Papier mit den nebeneinander liegenden stumpfen Spitzen der Zange abgeschnitten (Abbildung 1B, Schritt 5). Dieser Schritt löst den Embryo aus der Samenschale durch die Öffnung im Schritt 3.4 (1B, Schritt 6) erstellt. Es wird empfohlen, den Druck auf das Saatgut, wobei die Spitze der Keimblätter sind in der Nähe der Spitze der Keimwurzel (dh weg fr geltenom die Öffnung).
4. Versammlung der Samenschale Bettwäsche Assay (Pressluftatmer)
Siehe Diskussion für die richtige Wahl der Anzahl von Samenschalen und Embryonen.
- Bereiten Sie eine neue Petrischale Platte mit 30 ml Keimmedium. An der Oberfläche des Mediums eine sterile rechteckiges Stück (3,5 cm x 5,0 cm) von Nylon-Mesh (Abbildung 2, Schritt 1).
- Um Beschädigungen zu vermeiden, kann Embryos und Samenschalen auf die Oberfläche der Metallkanten der Zange durch sanftes Drücken Sie sie mit dem Spritzennadel (Abbildung 2, Schritt 2) bewegt werden. Über Embryonen und Samenschalen auf der Nylon-Mesh (Abb. 2, Schritt 3).
- Bauen Sie ein Kreis-und Einzelschicht der Samenschalen mit den abgestumpft Pinzette und Nadel, sicherzustellen, dass Samen Mäntel sind so viel näher wie möglich (Abb. 2, Schritt 4). Versuchen, so viel wie möglich ausgesetzt werden die Samenschale durch die erzeugte ÖffnungNadel nach oben. Dieser Schritt wurde nicht systematisch untersucht. Es könnte jedoch der Wirkungsgrad des Atemschutzgerätes zu erhöhen, da diffundierbare Substanzen Hemmung des Wachstums des Embryos wird erwartet, direkt diffundieren in Richtung der Embryo statt von diesem weg.
- Zeigen die Embryonen als Kreis einzigen Schicht auf der Mitte der Samenschale Bett im Schritt 4.3 zusammengebaut (Fig. 2, Schritt 5). Sicherzustellen, dass die Embryonen in so viel wie möglich näher.
- Die Pressluftatmer unter Dauerlicht (40 mmol / m 2 s ec) Inkubation bei 20-21 ° C In dem Fall, wo ein FR-Impuls wird verwendet, um die Keimung zu verhaften, montieren die Pressluftatmer unter normalem Licht, gelten die FR-Impuls, wie beschrieben, 9 und verlassen Petrischale in der Dunkelheit.
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Representative Results
Frühere Arbeiten haben gezeigt, dass mutierte Samen nicht GA synthetisieren konnten als Ergebnis der hohen ABA-Akkumulation in Samen keimen 11,12. Allerdings, die Unfähigkeit, keimen erfordert die Samenschale, da seine Entfernung löst embryonale Wachstum 13. Diese stark an, dass das Endosperm der Samen nicht GA synthetisieren ist die Freigabe ABA embryonale Wachstum zu blockieren. Wir erwarten daher Samen Mäntel nicht GA zu synthetisieren, um das Wachstum der Embryonen in einem Pressluftatmer im Gegensatz zu Samenschalen nicht GA-und ABA-Synthese blockieren. Hier verwenden wir GA1-21 (Salk Insertionslinie Salk_109115) mutierten Samen, die ein T-DNA-Insertion Störung der GA1-Gen (Beitritt AT4G02780) ent-copalyl Synthase, die für GA-Biosynthese 14 (SALK_109115 Eintragslinie in GA1 (kodiert Col Ökotypen) wird in der SALK Signaldatenbank 15 (referenziert http://signal.salk. Edu /).
In Übereinstimmung mit früheren Ergebnissen 13, könnte GA1-21-Mutante Samen nicht keimen 80 Stunden nach Samenquellung (3, Tafel 1). Im Gegensatz dazu und weiter im Einklang mit früheren Ergebnissen 13, Samenschale Entfernung ausgelöst GA1-21 Embryo Wachstum (Abbildung 3, Feld 2), es sei denn ABA im Medium vorhanden (Abb. 3, Feld 3) war.
Panel 4 in Abbildung 3 wurde 80 Stunden nach der Samenquellung aufgenommen und zeigt einen Pressluftatmer mit GA1-21 Embryonen auf einem Bett von 80 GA1-21 Samenschalen. In Übereinstimmung mit unserer Hypothese, blockiert GA1-21-Mutante Samenschalen das Wachstum der GA1-21 Embryonen.
Frühere Arbeiten zeigten, dass in ruhenden Samen der Samenschale synthetisiert und gibt ABA Richtung Embryo aufgrund der konstitutiven Expression des GA-Antwort DELLA Faktor RGL2, die ABA-Akkumulation in tränkte fördertSamen 6,11. Unter Bedingungen, wo GA-Synthese blockiert wird die DELLA Faktor RGL2 konstitutiv sammelt und fördert die ABA-Akkumulation 11. Fehlen RGL2 und ABA-Synthese im GA1-21 Samenschalen wird daher erwartet, dass das Wachstum der GA1-21 Embryonen in einem Atemschutzgerät zu ermöglichen. Um diese Hypothese zu benutzten wir die aba2-1-Mutante Allel (Ökotyp Col), mangelhaft in ABA-Synthese als Folge einer Punktmutation im Gen für Xanthosin Dehydrogenase (AT1G52340) und dem rgl2-14 T-DNA-Insertion Linie (Salk_027654 zu testen, Ökotyp Col) 16.
Fig. 1 ist. Verfahren für die Saatgut Dissektion. A) Diagramm beschreibt, wie abgeschnitten Zange für Saatgut Dissektion zu machen. Zange kann mit einer Schere oder Zange abgeschnitten. Wenn die Zange geschlossen wird, der nebeneinander liegenden stumpfen Spitzen shou. ld bedecken eine Fläche von der Größe eines Samens B) Schritt 1: zwei nebeneinander rechteckige sterile Whatman 3MM Papiere werden auf einer Petrischale Platte mit MS festen Medium festgelegt. Schritt 2: Samen werden auf der Oberfläche der Papiere Whatman 4 h nach der Imbibition übertragen. Schritt 3: die Präparation Verfahren erfordert, hält das Saatgut vor der Whatman-Papier mit den abgeschnittenen Pinzette. Schritt 4: eine Spritzennadel verwendet wird, um die Samenschale zu schneiden, wie gezeigt. Schritte 5 und 6: Die nebeneinander liegenden Spitzen der geschlossenen Zange zum schieben der Embryo aus der Samenschale durch die Seite des Schnitts.
2. . Vorgehensweise für die Montage der Samenschale Bettwäsche Test Schritt 1: Ein rechteckiges Stück Nylon-Mesh wird auf eine Petrischale Platte mit MS festen Medium festgelegt. Schritt 2 und 3: Dissected Embryonen und Samenschalen sind sanftbewegt wird, um die Kanten der Zange mit der Spritzennadel vor, um sie auf dem Nylonnetz übertragen. Schritt 4 und 5: Bauen Sie ein Kreis-und Einzelschicht der Samenschalen und entsorgen die Embryonen als Kreis einzigen Schicht auf der Mitte der Samenschale montiert Bett.
3. Repräsentative Ergebnisse mit Saatgut nicht GA synthetisieren. Seed Mantel Bettwäsche Tests unter Verwendung von Samenschalen und Embryonen von GA1 (GA1-21) mutierten Samen seziert, unfähig, GA synthetisieren. Panels zeigen Pflanzenmaterial wie in der Abbildung 80 Stunden nach Samenquellung beschrieben.
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Discussion
Die Samenschale Bettwäsche-Assay (Pressluftatmer) hier beschriebene Vorgehensweise ist im Prinzip auf jeder Umstand, bei dem die Keimung der Samen von Arabidopsis ist gesperrt (oder verzögert) und wo der Mehlkörper wird vermutet, diese Verhaftung zu implementieren. Letzteres kann durch Entfernen der Samenschale (Testa und Endosperm) und unter Berücksichtigung, dass embryonale Wachstum schneller verläuft relativ zu beobachten, wenn Embryonen werden von der Samenschale umgeben nachgewiesen werden. Die Keimung kann als Reaktion auf bestimmte Umwelt physikalischen Parameter (zB Wasserpotential oder Lichtqualität) oder in bestimmten genetischen Hintergründen (zB Fehlen von GA-Synthese wie in GA1-Mutanten, siehe Abbildung 3) blockiert werden.
Es gibt keine allgemein gültigen Regeln über die Zahl der Samenschalen und Embryonen für einen Pressluftatmer eingesetzt werden. Dies hängt von der Samencharge (und insbesondere ihre Frische) und der Art des Experiments durchgeführt werden. Es ist daher wichtig, adjust die Menge an Material, präpariert für jeden bestimmten Fall durch Überwachen des Wachstums auf die Embryos auf dem Bett des Samenschalen auf einer täglichen Basis. Allerdings sind in der Regel nur wenige Samenschalen notwendig, wenn hoch ruhenden Arabidopsis Ökotypen verwendet werden. Nachfolgend sind typische Mengen von Samenschalen und Embryonen, die bei der Montage Pressluftatmer erfolgreich eingesetzt wurden:
Pressluftatmer mit ruhenden Keimmaterial 6:
* Frisch geerntete (dh ruhende) Kap Verde Insel Ökotypen (CVI): Verwenden Sie 10 Embryonen und 20 Samenschalen.
* Frisch geerntete Landsberg (Ler) Samen: Verwenden Sie 10 Embryonen und 80 Samenschalen.
Atemschutzgerät in Abwesenheit von Gibberellin (GA)-Biosynthese (Fig. 3):
* GA1 mutierten Samen (Columbia - Col - Ökotypen): Verwenden Sie 10 Embryonen und 80 Samenschalen.
* Wildtyp Col Samen mit 10 uM Paclobutrazol (ein Inhibitor der Biosynthese GA) in der Keimmedium: Verwenden Sie 10 Embryos und 100 Samenschalen. Paclobutrazol hinzuzufügen, wenn das Medium auf 50 ° C vor dem Gießen in die Petrischale abgekühlt.
Atemschutzgerät nach einem Impuls von bis rot (FR) Licht 9:
* Verwenden Sie 12 100 Embryonen und Samenschalen.
Die einzige Einschränkung der Atemschutztechnik ist, dass es erfordert Geduld und Fingerfertigkeit, um so schnell montieren die Materialien seziert Samen zwar nicht die Tötung der Embryonen. Ein erfahrener Forscher kann 100 Samen innerhalb von 20-30 min zu sezieren. Allerdings müssen möglicherweise weniger erfahrene Benutzer 1 Stunde und erwarten, dass embryonale Schäden. Nach unserer Kenntnis gibt es bisher keine Alternative Techniken, die Rolle des Endosperms für die Kontrolle der Keimung von Samen zu erforschen.
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Disclosures
Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen konkurrieren.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse aus dem Schweizerischen Nationalfonds und vom Kanton Genf unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Thermomixer Comfort | Eppendorf AG | 5355 000.011 | Eppendorf AG, Hamburg, Germany |
| Vacusafe Comfort | INTEGRA Biosciences AG | 158 310 | Integra Biosciences AG, Zizers, Switzerland |
| Petri dish plate (100 mm x 20 mm) | Greiner Bio-One GmbH | 664 102 | Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany |
| Murashige and Skoog | Sigma-Aldrich | M5524 | Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA |
| MES | Sigma-Aldrich | M3671 | Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA |
| Agar (plant agar) | Duchefa Biochemie B.V. | P1001 | Duchefa Biochemie, Haarlem, Netherlands |
| Dumont forceps #5 | Fine Science Tools GmbH | 11251-10 | Fine Science Tools GmbH, Heidelberg Germany |
| Syringe needle | BD Micro-Fine | 324827 | BD, Franklin Lakes, NJ USA |
| Nylon mesh (SEFAR NYTEX) | SEFAR AG | 03-50/31 | Sefar AG, Heiden, Switzerland |
| Growth chamber | CLF Plant Climatics | Percival I-30BLLX | CLF plant Climatics, Wertingen, Germany |
| Paclobutrazol | Sigma-Aldrich | 46046 | Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA |
References
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