Summary
Vi presenterer fremgangsmåten for å sette sammen en frøhylsteret sengetøy analysen (SCBA) fra Arabidopsis thaliana frø. Den SCBA ble vist seg å være et kraftig verktøy for å utforske genetisk og in vitro hvordan stivelse kontroller frø spiring i sovende frø og i respons til lys signaler. Den SCBA er i prinsippet som gjelder under noen situasjon der det er analysert er mistenkt for å påvirke embryonale vekst.
Abstract
Den Arabidopsis endosperm består av et enkelt cellelag som omgir det modne embryo og spille en viktig rolle for å forhindre spiring av frø i hvilende tilstand eller som av nondormant frø bestrålt av en langt rød (FR) lyspuls. For ytterligere å få innsikt i de molekylære genetiske mekanismene bak spiring undertrykkende aktivitet utøves av stivelse, ble en "seed coat bedding" analysen (SCBA) utviklet. Den SCBA er en disseksjon prosedyre fysisk skille frø strøk og embryoer fra frø, som tillater overvåking veksten av embryo på et underliggende lag av frø strøk. Bemerkelsesverdig, rekonstruerer SCBA spiring undertrykkende aktiviteter av frø pels i sammenheng med frø dvalen og FR avhengig styring av frø spiring. Siden SCBA tillater kombi bruk av sovende, nondormant og genmodifiserte frø pels og embryonale materialer, de genetiske trasé kontrollerende spiring og spesielt opMed drifts i endosperm og embryo kan bli dissekert. Her har vi detalj prosedyren for å sette sammen en SCBA.
Introduction
I Arabidopsis modne frø, blir frø pels bestående av testa, et ytre lag av dødt vev av maternal opprinnelse, og endosperm, en enkelt celle laget av levende vev direkte omgir embryoet 1. Stivelse og embryoet er utledet fra separate befruktning hendelser: stivelse er en triploid vev med to mødre og en faderlig genomet mens fosteret er en diploid vev med en mors og en fars genom to.
Hovedfunksjonen som tradisjonelt er tilordnet stivelse er at av en næringsverdi vev. Imidlertid er det stadig tydeligere at stivelse spiller også en sentral rolle for å kontrollere frø spiring. Denne forestillingen ble først synlig i tilfellet uvirksom, en egenskap som utvises av nylig produserte frø. Dormant frø unnlater å spire til tross for tilstedeværelsen av gunstige spirebetingelser. Frø mister dvalen etter en modningsperioden og bli nondormant, dvs. de vil spire når de utsettes for gunstige spireforhold. I mange plantearter, inkludert modell anlegg Arabidopsis, er frøet pelsen helt nødvendig for å hindre spiring av sovende frø siden frøhylsteret fjerning utløser embryonale vekst og Greening 3,4. I Arabidopsis, Bethke et al. Observert at spiring forble trykt etter å ha fjernet testa samtidig opprettholde stivelse rundt endosperm fem. Disse observasjoner indikerte at stivelse er vevet i frøhylsteret utøve en undertrykkende aktivitet på embryoet. Men ikke seedet frakk fjerning eksperimenter ikke nødvendigvis hjelpe å avklare innholdet av spiring undertrykkende aktivitet gitt av frøet pelsen heller identifisere genene som implementerer den.
Vi har nylig introdusert et frø frakk sengetøy analysen (SCBA) hvor frø strøk og embryoer er fysisk atskilt, men holdt i nært Proxistemmelse slik at spiring undertrykkende aktivitet gitt av stivelse er opprettholdt seks. Den SCBA tillater kombi bruk av sovende, nondormant, og genmodifiserte frø pels og embryonale materialer. Som et resultat, kan de genetiske trasé kontrollerende spiring og spesielt opererer i endosperm og embryoet blir dissekert. Den SCBA ble brukt i sammenheng med dvalen for å vise at stivelse utgivelser phytohormone abscisic syre (ABA) mot fosteret å undertrykke sin vekst seks. Videre kunne vi bruke røykdykker å identifisere signalveier som opererer i endosperm og embryonale vev for å fremme dvalen.
Rollen av stivelse for å kontrollere spiring ble ytterligere styrket ved å vurdere saken på nondormant frø utsatt for en puls på langt rødt (FR) lys. Tidlig på frø imbibition en FR lys puls er kjent for å hemme spiring 7,8. Når sette strøk ble fjernet fra frøene en puls av FR lysetvar ute av stand til å hemme spiring, sterkt tyder på at stivelse kan også undertrykke spiring av nondormant frø ni. Bemerkelsesverdig, kan det overtrykk også brukes til å rekapitulere FR-avhengig inhibering av spiring. Denne lov til å vise at at FR avhengig hemming av frø spiring er også en prosess som involverer ABA utgivelse fra stivelse ni. Videre røykdykker tillot identifisering av de forskjellige lys-signalveier som opererer i endosperm og embryoet for å styre nondormant frøspiring som reaksjon på lys signaler 9,10.
Den med overtrykk ser derfor ut til å være en pålitelig teknikk for å utforske funksjon av stivelse i forbindelse med kontroll av frøspiring. Det er også et kraftig verktøy for å bedømme in vitro vidt gener som mistenkes for å styre spiring operere i endosperm, embryo eller begge vevene. Her har vi detalj de ulike trinnene som kreves for å sette sammen en SCBA.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Når røykdykker er satt sammen, blir veksten av embryoer overvåkes i løpet av flere dager. Derfor, før frøet disseksjon prosedyre og montering av røykdykker, trenger man å sterilisere frø for å unngå fremtidige forurensninger som kan hindre skikkelig vurdering av effekten av frø pels materiale på embryonale vekst.
En. Seed Sterilisering
- Hell 50-60 mL av modne og tørre Arabidopsis frø i en 1,5 ml mikrosentrifuge tube og forberede en 70% etanol løsning.
- Tilsett 1 ml av 70% etanol-løsning til mikrosentrifugerør inneholdende frøene og ristes ved romtemperatur i 10 min ved 1200 rpm i en vortex.
- Sentrifuger mikrosentrifugerør i 3 sekunder ved 4000 x g for å konsentrere frø i bunnen av røret.
- Aspirer 70% etanolløsning ved hjelp av en vakuum-suge spiss nøye forlater frøene ved bunnen av mikrosentrifugerør.
- Tilsett 1 ml sterilt destillert vann til t Han mikrosentrifuge tube fortsatt inneholder frø.
- Rist ved romtemperatur i 10 min ved 1200 rpm.
- Sentrifuger mikrosentrifugerør i 3 sekunder ved 4000 x g for å konsentrere frø i bunnen av røret. Suge vann supernatanten ved hjelp av en vakuum-suge spiss nøye forlater frøene i bunnen av røret.
- Tilsett 1 ml sterilt vann destillert vann til mikrosentrifugerør som fremdeles inneholder frøene. Påse at strømmen av vann homogent suspenderer frøene på innsiden av røret. Målet her er å unngå ytterligere risting, slik som å bevare integriteten av frøene.
- La frøene slå seg ned ved tyngdekraften ved bunnen av røret ved å la røret fortsatt i 30 sek. Suge vann supernatanten ved hjelp av en vakuum-suge spiss nøye forlater frøene i bunnen av røret.
- Gjenta fire ganger trinn 01.08 til 01.09. Samlet steriliseringsprosessen tar ca 30 min.
2. Seed Plating
ontent "> er alle etterfølgende trinn utført inne i en laminær kabinett å bevare sterile forhold.- Tilbered en petriskål plate (100 mm diameter, 20 mm høyde) inneholdende 30 ml av spiremedium fremstilt ved autoklavering en oppløsning inneholdende 4,3 g / L Murashige og Skoog medium i 2,5 mM 2 - (N-morfolino) etansulfonsyre (MES-KOH ; pH 5,7) og 0,8 g / L agar. La oppløsningen avkjøles i et 50 ° C vannbad før det helles i petriskål plate.
- Legg 200 mL sterilt destillert vann til røret inneholder frø. Resuspender frøene og overføre dem på overflaten av spiremedium med en standard pipette med en 1 ml spiss.
- Fjern vannet som omgir frøene på overflaten av spiremedium ved hjelp av en vakuum-suge spiss.
- La petriskål inneholdende frøene uten at lokket på innsiden av laminær skap i 2 timer for ytterligere tørking. Lukk petriskål med lokk og la det stå under laminærflyte kabinett for ca 90 min slik at om lag fire timer har gått siden oppstart av frøet steriliseringsprosessen (trinn 1,2).
Tre. Seed Dissection
Følgende trinn nødvendig arbeider med en stereo plassert inne i laminær hette skap. En Dumont tang # 5 med avkortede (dvs. sløv) tips i stor grad forenkler håndteringen av frøene (figur 1A).
- Forbered en ny petriskål plate som inneholder 30 ml av spiring medium. Sted på overflaten av de mellom to sammenstilte rektangulære sterilt Whatman 3MM papir (1,5 cm x 1,0 cm; Figur 1B, trinn 1). Whatman 3MM papir blir sterilisert i en autoklav.
- Overfør frø på Whatman 3MM avisene bruker steril tang (Figur 1B, trinn 2).
- Hold en individuell frø mot Whatman 3MM papir ved å trykke forsiktig frøet ved hjelp av sidestilt sløv tips av den avkortede tang (
- Kutt frøhylsteret (testa og stivelse) av frø ved hjelp av en sprøyte nål (f.eks U100 insulinsprøyte + 1 ml sprøyte, 0,33 mm (29 G) x 12.7 mm) (figur 1B, trinn 4). Formen på Arabidopsis frø er ellipsoidiske og det anbefales å kutte frøet pelsen langs den lengste semi-hovedakse så nært som mulig til stedet hvor de cotyledons er koblet til radicle (dvs. bort fra den radikale tips). Dette bidrar til en sikker frigjøring av embryoet i det neste trinn av fremgangsmåten disseksjon.
- Skyv frøet mot Whatman 3MM papir ved hjelp av sidestilt sløv tips av den avkortede tang (Figur 1B, trinn 5). Dette trinnet frigjør embryo ut frøhylsteret gjennom åpningen laget i trinn 3.4 (figur 1B, trinn 6). Det anbefales å påføre et trykk på frøet hvor tuppen av cotyledons er i nærmest tuppen av radicle (dvs. bort frOM-åpningen).
4. Montering av Seed Coat Bedding analysen (SCBA)
Se diskusjonen for riktig valg av antall frø strøk og embryoer.
- Forbered en ny petriskål plate som inneholder 30 ml av spiring medium. Sted på overflaten av mediet en steril rektangulært stykke (3,5 cm x 5,0 cm) av Nylon mesh (figur 2, trinn 1).
- For å unngå skader, kan embryoer og frø strøk flyttes til overflaten av de metalliske kanter av tang ved å skyve dem ved hjelp av sprøytespissen (figur 2, trinn 2). Overfør embryoer og frø strøk på Nylon mesh (Figur 2, trinn 3).
- Monter en sirkulær og enkelt lag av frø strøk bruker avstumpet tang og nålen og pass på at frø strøk er i så mye større nærhet som mulig (Figur 2, trinn 4). Prøv å eksponere så mye som mulig den frøhylsteret åpningen generert avnål oppover. Dette trinnet ble ikke systematisk testet. Imidlertid kan det å øke effektiviteten av røykdykker siden diffunderbare stoffer som hemmer veksten av embryoet forventes å direkte diffundere ut mot embryo i stedet for vekk fra den.
- Plasser embryoene som en sirkulær enkelt lag på midten av frøhylsteret bed montert i trinn 4.3 (fig. 2, trinn 5). Sørg for at embryoene er i så mye større nærhet som mulig.
- Inkuber SCBAs under kontinuerlig lys (40 mikromol / m 2 s ec) ved 20-21 ° C. I det tilfelle hvor en puls FR anvendes til å arrestere spiring, montere røykdykker under normale lys, påføre FR puls som beskrevet 9 og forlater petriskål i mørke.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Tidligere arbeid har vist at mutant frø som ikke kan syntetisere GA ikke var i stand til å spire som et resultat av høy ABA akkumulering i frø 11,12. Men manglende evne til å spire krever frøhylsteret siden fjerning utløser embryonale vekst 13. Dette indikerte at sterkt endosperm av frø som ikke kan syntetisere GA slipper ABA å blokkere embryonisk vekst. Vi forventer derfor frø strøk klarer å syntetisere GA å blokkere veksten av embryo i en SCBA motsetning frø strøk klarer å syntetisere GA og ABA. Her bruker vi GA1-21 (Salk innsetting linjen Salk_109115) mutant frø bærer en T-DNA innsetting forstyrre GA1 genet (tiltredelse AT4G02780) koding av ent-copalyl diphosphate syntase, som er avgjørende for GA biosyntesen 14 (SALK_109115 innsetting linje i GA1 (Col ecotype) er referert i Salk signal databasen 15 ( http://signal.salk. Edu /).
I samsvar med tidligere resultater 13, kunne GA1-21 muterte frøene ikke spirer 80 timer etter frø imbibition (Figur 3, Panel 1). I kontrast og videre i samsvar med tidligere resultater 13, utløses frøhylsteret fjerning GA1-21 embryo vekst (figur 3, panel 2) med mindre ABA var til stede i mediet (figur 3, panel 3).
Panel 4 i figur 3 ble tatt 80 timer etter frø imbibition og viser en SCBA med GA1-21 embryoer på en seng av 80 GA1-21 frø strøk. I samsvar med vår hypotese, GA1-21 mutant frø strøk blokkert veksten av GA1-21 embryoer.
Tidligere arbeid har vist at i hvil frø frø belegge syntetiserer og frigjør ABA mot embryo som et resultat av konstitutiv ekspresjon av GA-respons DELLA faktor RGL2, som fremmer ABA akkumulering i absorbertefrø 6,11. Under forhold der GA syntese er blokkerte DELLA faktor RGL2 constitutively akkumulerer og fremmer ABA opphopning 11. Fravær av RGL2 og ABA syntese i GA1-21 frø strøk forventes derfor å tillate vekst av GA1-21 embryoer i en SCBA. For å teste denne hypotese om vi brukte aba2-1 mutant allel (Col ecotype), mangelfull i ABA-syntese som et resultat av en punktmutasjon i genet som koder Xanthosin dehydrogenase (AT1G52340) og rgl2-14 T-DNA-innsetningslinje (Salk_027654, Col ecotype) 16.
Figur 1. Prosedyre for frø disseksjon. A) Diagram som beskriver hvordan du kan lage avkortet tang for frø disseksjon. Pinsett kan bli avkortet ved hjelp av saks eller tang. Når pinsett er lukket sidestilt avkortede tips shou. ld dekselet en flate omtrent på størrelse med et frø B) Trinn 1: to side ved side rektangulære sterilt Whatman 3MM papir er lagt på en petriskål inneholdende MS-plate fast medium. Trinn 2: frø overføres på overflaten av de Whatman papir 4 timer etter absorpsjon. Trinn 3: disseksjon prosedyren krever holder frøet mot Whatman papiret med avkortede tang. Trinn 4: En kanyle blir brukt til å kutte den frøhylsteret som vist. Trinn 5 og 6: De satt sammen tips av de lukkede tang brukes til å forsiktig skyve embryo ut av frøet pelsen gjennom området av kuttet.
Figur 2. . Fremgangsmåte for montering av frøhylsteret bedding analysen Trinn 1: Et rektangulært stykke av nylon mesh er lagt på en petriskål inneholdende MS-plate fast medium. Trinn 2 og 3: dissekert embryoer og frø strøk er forsiktigbeveget seg til kantene av tang ved hjelp av sprøytenål før overføre dem til den Nylon mesh. Trinn 4 og 5: montere en sirkulær og enkelt lag av frø lag og kast embryoene som en sirkulær enkelt lag på midten av den sammensatte belegge frø seng.
Figur 3. Representative resultater med frø materiale ute av stand til å syntetisere GA. Frøhylsteret sengetøy analyser ved hjelp frø strøk og embryoer dissekert fra GA1 (GA1-21) mutant frø, ute av stand til å syntetisere GA. Paneler viser plantemateriale som beskrevet i figur 80 timer etter at frø absorpsjon.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Frøet strøk sengetøy analysen (SCBA) prosedyre som er beskrevet her er i prinsippet som gjelder til enhver omstendighet hvor Arabidopsis frø spiring er blokkert (eller forsinket) og hvor stivelse er mistenkt for å implementere denne arrestasjonen. Sistnevnte kan være dokumentert ved å fjerne frø pels (testa og stivelse) og observere at embryonale veksten fortsetter raskere i forhold til det som er observert når embryoer er omgitt av frøet pelsen. Spiring kan blokkeres i respons på bestemte miljø fysiske parametere (for eksempel vann potensial eller lys), eller i bestemte genetiske bakgrunn (for eksempel fravær av GA-syntese som i GA1 mutanter, se figur 3).
Det finnes ingen generelle regler om antall frø strøk og embryoer som skal brukes til en SCBA. Dette avhenger av frøet batch (og særlig dens friskhet) og type forsøk som skal utføres. Det er derfor viktig å justertt mengden av dissekert materiale for hvert enkelt tilfelle ved å overvåke veksten av embryoene på sengen av frø strøk på en daglig basis. Men som regel noen få frø strøk er nødvendig når svært sovende Arabidopsis økotyper brukes. Nedenfor er typiske mengder frø strøk og embryoer som ble brukt med hell ved montering SCBAs:
SCBA med sovende frø materiale 6:
* Nyhøstede (dvs. sovende) Kapp Verde Island ecotype (CVI): Bruk 10 embryoer og 20 frø strøk.
* Nyhøstede Landsberg (Ler) frø: Bruk 10 embryoer og 80 frø strøk.
SCBA i fravær av gibberellin (GA) biosyntese (figur 3):
* GA1 mutant frø (Columbia - Col - ecotype): Bruk 10 embryoer og 80 frø strøk.
* villtype Col frø med 10 mikrometer paclobutrazol (en hemmer av GA biosyntesen) i spiring medium: Bruk 10 embryos og 100 frø strøk. Legg Paclobutrazol når mediet er avkjølt til 50 ° C før det fylles inn i petriskål.
SCBA etter en puls med langt rødt (FR) lys 9:
* Bruk 12 embryoer og 100 frø strøk.
Den eneste begrensning i røykdykker teknikk er at den krever tålmodighet og fingerferdighet for å raskt å sette sammen de dissekerte frø materialer samtidig som det ikke drepe embryoer. En erfaren forsker kan dissekere 100 frø i løpet av 20-30 min. Imidlertid kan mindre erfarne brukere trenger en hr og forventer embryonale skade. Så vidt vi vet er det så langt ingen alternative teknikker for å utforske rollen som stivelse for kontroll av frø spiring.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne hevder at de ikke har noen konkurrerende finansielle interesser.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet med tilskudd fra den sveitsiske National Science Foundation og av staten av Genève.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Thermomixer Comfort | Eppendorf AG | 5355 000.011 | Eppendorf AG, Hamburg, Germany |
| Vacusafe Comfort | INTEGRA Biosciences AG | 158 310 | Integra Biosciences AG, Zizers, Switzerland |
| Petri dish plate (100 mm x 20 mm) | Greiner Bio-One GmbH | 664 102 | Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany |
| Murashige and Skoog | Sigma-Aldrich | M5524 | Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA |
| MES | Sigma-Aldrich | M3671 | Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA |
| Agar (plant agar) | Duchefa Biochemie B.V. | P1001 | Duchefa Biochemie, Haarlem, Netherlands |
| Dumont forceps #5 | Fine Science Tools GmbH | 11251-10 | Fine Science Tools GmbH, Heidelberg Germany |
| Syringe needle | BD Micro-Fine | 324827 | BD, Franklin Lakes, NJ USA |
| Nylon mesh (SEFAR NYTEX) | SEFAR AG | 03-50/31 | Sefar AG, Heiden, Switzerland |
| Growth chamber | CLF Plant Climatics | Percival I-30BLLX | CLF plant Climatics, Wertingen, Germany |
| Paclobutrazol | Sigma-Aldrich | 46046 | Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA |
References
- Debeaujon, I., Leon-Kloosterziel, K. M., Koornneef, M. Influence of the testa on seed dormancy, germination, and longevity in Arabidopsis. Plant Physiol. 122, 403-414 (2000).
- Baroux, C., Spillane, C., Grossniklaus, U. Evolutionary origins of the endosperm in flowering plants. Genome Biol. 3, reviews1026 (2002).
- Debeaujon, I., Lepiniec, L., Pourcel, L., Routaboul, J. -M. Seed development, dormancy and germination. , Blackwell Publishing. 25-43 (2007).
- Finch-Savage, W. E., Leubner-Metzger, G. Seed dormancy and the control of germination. New Phytol. 171, 501-523 (2006).
- Bethke, P. C., et al. The Arabidopsis aleurone layer responds to nitric oxide, gibberellin, and abscisic acid and is sufficient and necessary for seed dormancy. Plant Physiol. 143, 1173-1188 (2007).
- Lee, K. P., Piskurewicz, U., Tureckova, V., Strnad, M., Lopez-Molina, L. A seed coat bedding assay shows that RGL2-dependent release of abscisic acid by the endosperm controls embryo growth in Arabidopsis dormant seeds. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 19108-19113 (2010).
- Reed, J. W., Nagatani, A., Elich, T. D., Fagan, M., Chory, J. Phytochrome A and Phytochrome B Have Overlapping but Distinct Functions in Arabidopsis Development. Plant Physiol. 104, 1139-1149 (1994).
- Shinomura, T., et al. Action spectra for phytochrome A- and B-specific photoinduction of seed germination in Arabidopsis thaliana. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93, 8129-8133 (1996).
- Lee, K. P., et al. Spatially and genetically distinct control of seed germination by phytochromes A and B. Genes Dev. 26, 1984-1996 (2012).
- Lee, K. P., Lopez-Molina, L.
- Piskurewicz, U., et al. The gibberellic acid signaling repressor RGL2 inhibits Arabidopsis seed germination by stimulating abscisic acid synthesis and ABI5 activity. Plant Cell. 20, 2729-2745 (2008).
- Piskurewicz, U., Tureckova, V., Lacombe, E., Lopez-Molina, L. Far-red light inhibits germination through DELLA-dependent stimulation of ABA synthesis and ABI3 activity. EMBO J. 28, 2259-2271 (2009).
- Debeaujon, I., Koornneef, M. Gibberellin requirement for Arabidopsis seed germination is determined both by testa characteristics and embryonic abscisic acid. Plant Physiol. 122, 415-424 (2000).
- Sun, T. P., Kamiya, Y. The Arabidopsis GA1 locus encodes the cyclase ent-kaurene synthetase A of gibberellin biosynthesis. Plant Cell. 6, 1509-1518 (1994).
- Alonso, J. M., et al. Genome-wide insertional mutagenesis of Arabidopsis thaliana. Science. 301, 653-657 (2003).
- Rook, F., et al. Impaired sucrose-induction mutants reveal the modulation of sugar-induced starch biosynthetic gene expression by abscisic acid signalling. Plant J. 26, 421-433 (2001).
