Summary
我们目前的程序，从拟南芥种子组装种皮床上用品法（SCBA）。空气呼吸器被证明是一个强大的工具，基因和体外探索胚乳控制种子发芽的种子的休眠和反应轻线索如何。空气呼吸器是适用的原则，在胚乳被怀疑影响胚胎生长任何情况下。
Abstract
拟南芥胚乳由周边的成熟胚和播放，以防止休眠种子的萌发，或由远红光（FR）的光脉冲照射nondormant种子的重要作用单细胞层。为了进一步洞察底层由胚乳施加的发芽压制性活性的分子遗传机制，一个“种皮寝具”测定法（SCBA）被设计。空气呼吸器是一种剥离的过程实际上从种子，因此可以监视胚胎的生长种皮的下层上分离种皮和胚。值得注意的是，空气呼吸器重新组成种皮发芽镇压活动在种子休眠和萌发的FR-依赖的控制的情况下。由于空气呼吸器允许组合使用休眠，nondormant和转基因种皮和胚材料的遗传途径控制的萌发和专门运erating在胚乳和胚可以被解剖。下面我们详细的程序来组装一个自给式呼吸器。
Introduction
在拟南芥成熟种子的种皮是由种皮，母体来源的死组织的外层，和胚乳，直接围绕胚胎1活组织的单细胞层。胚乳和胚胎均来自不同的施肥事件：胚乳是三倍体组织有两个产妇和一个父亲的基因组，而胚胎是一个产妇和一个父亲的基因组2二倍体组织。
传统上分配给该胚乳的主要功能是，营养组织。然而，它正变得越来越明显的是，胚乳也起着控制种子发芽的核心作用。这个概念在休眠的情况下成为了第一个明显的，由新产生的种子表现出的特质。休眠种子不能发芽，尽管有利发芽条件的存在。种子成熟期后失去他们的休眠，成为nondormanT， 即它们会发芽，当暴露在有利的条件下催芽。在许多植物物种，其中包括模式植物拟南芥 ，种皮是绝对必要的，以防止休眠种子的萌发，因为种皮去除触发胚胎生长和绿化3,4。在拟南芥中 ，贝思克等人观察到，除去种皮，同时保持周围的胚乳5胚乳萌发后仍然压抑。这些观察结果强烈表明，胚乳，种皮施加的镇压活动在胚胎内的组织。然而，种皮去除的实验并不一定有助于澄清发芽镇压活动由种皮所提供的性质，也不确定实现它的基因。
我们最近推出了种皮床上用品法（SCBA），其中种皮和胚在物理上分开，但保持着密切PROXIMITY使得由胚乳提供的发芽压制性的活性得以维持6。空气呼吸器允许组合使用休眠，nondormant，和转基因种皮和胚料。其结果是，在遗传途径控制发芽并在胚乳和胚具体操作可以被解剖。空气呼吸器被用于休眠的 情况下，显示的胚乳释放激素脱落酸（ABA）对胚胎来抑制其生长6。此外，我们还可以使用空气呼吸器，以确定在胚乳操作的信号通路和胚胎组织，以促进休眠。
胚乳控制发芽的作用考虑承受远红（FR）的光脉冲nondormant种子的情况下得到进一步加强。在种子吸胀初期帧中继光脉冲是已知的抑制发芽7,8。当从种子中除去种皮FR光脉冲无法抑制发芽，强烈的建议，胚乳也可以抑制nondormant 9种子的萌发。值得注意的是，SCBA也可以用来概括发芽的FR-依赖性抑制。这可以表明，种子萌发的FR-依赖性抑制也有来自胚乳9阿坝释放的过程。此外，SCBA允许识别在胚乳和胚来控制nondormant种子萌发响应于光线索9,10操作不同的光信号转导途径。
因此，空气呼吸器似乎是一个可靠的技术来探索种子萌发的控制范围内胚乳的功能。这也是一个强大的工具， 在体外 ，以评估是否涉嫌基因控制发芽的胚乳，胚或两者的组织工作。下面我们详细组装一台空气呼吸器所需的各个步骤。
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Protocol
一旦空气呼吸器被组装时，胚胎的生长被监控超过数天。因此，空气呼吸器的种子解剖过程和组装之前，需要消毒的种子，以避免将来的污染，可以防止种皮材料对胚胎生长的影响，正确的评估。
1。种子消毒
- 倒入50-60微升成熟和拟南芥干种子在1.5 ml离心管中，并准备一个70％的乙醇溶液。
- 加入1毫升70％的乙醇溶液至含有种子的微量离心管中，并在1,200 rpm下在涡流混合器摇动在室温下搅拌10分钟。
- 离心机的离心管中，持续3秒在4000×g离心浓缩种子在管的底部。
- 用真空吸嘴小心而使种子在微量离心管的底部吸出70％的乙醇溶液。
- 加入1毫升无菌蒸馏水至吨他离心管中仍含有的种子。
- 摇在室温下在1200rpm 10分钟。
- 离心机的离心管中，持续3秒在4000×g离心浓缩种子在管的底部。用真空吸嘴小心而使种子在管的底部抽吸水上清液。
- 加入1毫升无菌水蒸馏水至仍含有种子的微量离心管中。确保水的流动均匀挂起管内的种子。这样做的目的是为了避免进一步的晃动，从而保持种子的完整性。
- 让种子定下来通过重力在该管的底部由仍留在管30秒。用真空吸嘴小心而使种子在管的底部抽吸水上清液。
- 重复四次步骤1.8 - 1.9。整体灭菌过程大约需要30分钟。
2。种子电镀
ontent“>所有后续步骤都在层流柜中进行，以保持无菌条件。- 准备陪替氏培养皿盘（100毫米直径20毫米高）制备通过高压灭菌含有4.3克/ L的Murashige和Skoog培养基中2.5毫米2的溶液中装有30ml萌发培养基 - （N-吗啉）乙磺酸（MES-KOH ; pH值5.7）和0.8克/升琼脂。设在50℃水浴中冷却液倒在培养皿板浇筑前。
- 加入200μl的无菌蒸馏水到含种子的试管中。重悬的种子，并用标准移液管与1毫升尖萌发培养基的表面上传送。
- 除去周围用真空吸嘴的萌发培养基的表面上的种子的水分。
- 离开含种子没有它的盖培养皿中的层流柜内2小时为进一步干燥。关闭培养皿的盖子，让它经得起层下流柜约90分钟，使约4小时，自该种子灭菌过程（步骤1.2）的启动通过。
3。种子解剖
下面的步骤必要用立体显微镜放置在层流罩柜内工作。一个杜蒙钳＃5于截断（ 即钝）提示极大地方便了种子的处理（ 图1A）。
- 准备装有30ml萌发培养基的新培养皿板。这里的介质2并列的矩形灭菌的Whatman 3MM纸（1.5厘米×1.0厘米; 图1B，步骤1）的表面上。的Whatman 3MM纸被高压灭菌。
- 传送上使用无菌镊子（ 图1B，步骤2）中的Whatman 3MM纸种子。
- 通过使用截断钳的并列钝头（轻轻按压种子仇视的Whatman 3MM纸单粒种子
- 切割用注射器针头种子的种皮（外种皮和胚乳）（ 如 U100胰岛素注射器+ 1ml注射器，0.33毫米（29 G）×12.7毫米）（ 图1B，步骤4）。 拟南芥种子的形状是椭圆形的，因此建议削减种皮沿尽可能接近的地方子叶接合到胚根（ 即远离基端部）的位置上最长的半主轴。这有助于在清扫过程的下一步骤中胚胎的安全释放。
- 使用截短的镊子（ 图1B，步骤5）的并置的钝头推压的Whatman 3MM纸上的种子。此步骤会释放出胚种皮通过在步骤3.4（ 图1B，步骤6）中创建的开口。它建议申请在该处的子叶的顶端是在最靠近胚根的尖端处的种子（ 即相差fr处的推OM开放）。
4。大会的种皮床品含量（SCBA）
为种皮和胚胎的数量的适当的选择看讨论。
- 准备装有30ml萌发培养基的新培养皿板。地方的介质的表面上的无菌一块长方形的尼龙网片（3.5厘米×5.0厘米）（ 图2，步骤1）。
- 为避免损坏，胚胎和种皮可以通过使用注射器针头（ 图2，步骤2）轻轻推他们移动到钳子的金属边缘的表面上。转移的胚胎和种皮上的尼龙筛网（ 图2，步骤3）。
- 组装种皮的使用钝钳和针确保种子外套是在尽可能多的靠近，尽可能地（ 图2，步骤4）的圆形和单层。尝试以暴露尽可能由所产生的种皮开口针向上。这一步是没有系统地测试。但是，它可能会增加空气呼吸器的效率，因为可扩散物质抑制了胚胎的生长预期直接扩散出来对胚胎而不是远离它。
- 将胚胎作为组装在步骤4.3种皮床中心的环状单层（ 图2，步骤5）。确保胚胎是在尽可能多的更接近越好。
- 在20-21℃下孵育下连续光照（40微摩尔/米2秒 EC）的SCBAs在帧中继脉冲用来逮捕发芽，组装空气呼吸器正常光线下，与实际情况相符的FR脉冲9，离开培养皿在黑暗的情况下。
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Representative Results
以前的工作表明，突变体种子无法合成GA无法发芽，作为高ABA积累在种子11,12的结果。但是，不能发芽，需要种皮，因为它的去除触发胚胎生长13。这有力地表明，种子不能合成赤霉素的胚乳被释放ABA阻止胚胎发育。因此，我们预计种子大衣不能合成GA阻止胚胎在呼吸器的增长不像种皮不能合成赤霉素和脱落酸。这里我们使用GA1-21（Salk的插入线Salk_109115）携带一个T-DNA插入破坏GA1基因（加入AT4G02780）编码ENT-copalyl二磷酸合成酶，这是GA合成14 GA1（SALK_109115插入线（必需的突变体种子山口生态型）在SALK信号数据库15（被引用http://signal.salk。埃杜/）。
与以前的结果13，GA1-21突变体种子不能发芽80小时，种子吸胀后（ 图3，面板1）。与此相反，与先前结果13进一步相一致，种皮去除触发GA1-21胚生长（ 图3，面板2）除非ABA是存在于培养基中（ 图3，面板3）。
在图3板4被送往80小时种子吸胀后显示了GA1-21胚胎在床上的80 GA1-21的种皮一个呼吸器。符合我们的假设，GA1-21突变体的种皮堵塞GA1-21胚的生长。
以前的工作表明，在休眠种子的种皮中合成并释放对胚胎的ABA作为GA-DELLA响应因子RGL2，从而促进ABA积累在吸液的组成型表达的结果种子6,11。根据发生GA合成受阻条件DELLA因素RGL2组成积累，促进ABA积累11。因此RGL2的缺乏和ABA合成GA1-21的种皮，预计允许GA1-21胚胎在呼吸器的增长。为了检验这一假设，我们使用了ABA2-1突变等位基因（西生态型），缺乏ABA合成为一个点突变的基因编码Xanthosin脱氢酶（AT1G52340）和RGL2-14 T-DNA插入线（Salk_027654的结果， Col生态）16。
图1。步骤种子解剖。 A）图描述了如何使截断钳种子解剖。镊子可以使用剪刀或钳子被截断。当镊子关闭时，并列的截头尖端寿。LD盖约种子大小的面B）步骤1：两个并排的矩形灭菌的Whatman 3MM文件被放置在含有MS固体培养基的培养皿板。步骤2：种子被转移的瓦特曼纸吸胀后4小时的表面上。步骤3：剥离过程需要保持对Whatman滤纸将种子用钳子截断。步骤4：将注射器针头用于切割种皮，如图所示。步骤5和6：闭合钳的并列技巧是用来通过切口的部位轻轻推了出来胚种皮。
图2。操作步骤为种皮床上用品检测的组装步骤1：一个长方形的一块尼龙网的铺设上载的MS固体培养基的培养皿板。步骤2和3：解剖胚胎和种皮是轻轻使用前将注射器针头将其转移到尼龙网移动到钳子的边缘。步骤4和5：组装种皮的通函及单层和处理的胚胎作为组装种皮床的中央圆形单层。
图3。与籽料不能合成GA代表性的结果。用种皮和胚从GA1（GA1-21）突变体种子解剖，无法合成GA种皮床上用品检测。面板显示的植物材料作为图中的80小时的种子吸胀后所述。
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Discussion
这里所描述的种皮床上用品法（SCBA）程序原则上适用于其中拟南芥种子发芽受阻（或延迟），并在那里胚乳被怀疑实施这一逮捕任何情况下。后者可通过除去种皮（外种皮和胚乳），并观察到胚胎生长前进速度相对于所观察到的，当胚胎是由种皮包围得以证实。发芽可能被阻止响应于特定环境的物理参数（ 例如 ，水或潜在的光质）或在特定的遗传背景（ 例如，不存在GA合成的作为GA1突变体，参见图3）。
有关于种皮和胚可以用于呼吸器的数量没有一般规则。这依赖于种子批次（尤其是它的新鲜度）和要执行的实验类型。因此，至关重要的，以adjus通过监测生长对种皮，每天的床胚胎吨针对每一特定情况下解剖材料的量。然而，通常几个种皮是必要的，当高度休眠拟南芥生态型使用。下面显示的是种皮和胚组装SCBAs时所成功使用的典型值：
呼吸器与休眠的 种子材料6：
*刚收获的（ 即休眠）佛得角岛生态型（CVI）：使用10胚胎和20种皮。
*刚收获的兰茨贝格（LER）种子：使用10胚胎和80种皮。
SCBA在缺少赤霉素（GA）合成（ 图3）：
* GA1突变体种子（哥伦比亚 - 山口 - 生态型）：使用10胚胎和80种皮。
*野生型上校种子用10微米多效唑在萌发培养基（GA生物合成的抑制剂）：使用10胚s和100种皮。加多效唑当介质被冷却到50℃倒入培养皿之前。
SCBA远红光（FR）9光的脉冲后：
*使用12个胚胎和100种皮。
空气呼吸器技术的唯一的限制是，它需要耐心和灵活性，以便迅速组装解剖种子材料，而不是杀死胚胎。一个有经验的研究人员可以在20-30分钟剖析100粒种子。然而，缺乏经验的用户可能需要1个小时，并期望胚胎的损害。据我们所知，有迄今尚无替代技术，探讨了胚乳的种子发芽的控制作用。
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Disclosures
作者宣称，他们有没有竞争的财务权益。
Acknowledgments
这项工作是由瑞士国家科学基金会资助和日内瓦州的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Thermomixer Comfort | Eppendorf AG | 5355 000.011 | Eppendorf AG, Hamburg, Germany |
| Vacusafe Comfort | INTEGRA Biosciences AG | 158 310 | Integra Biosciences AG, Zizers, Switzerland |
| Petri dish plate (100 mm x 20 mm) | Greiner Bio-One GmbH | 664 102 | Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany |
| Murashige and Skoog | Sigma-Aldrich | M5524 | Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA |
| MES | Sigma-Aldrich | M3671 | Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA |
| Agar (plant agar) | Duchefa Biochemie B.V. | P1001 | Duchefa Biochemie, Haarlem, Netherlands |
| Dumont forceps #5 | Fine Science Tools GmbH | 11251-10 | Fine Science Tools GmbH, Heidelberg Germany |
| Syringe needle | BD Micro-Fine | 324827 | BD, Franklin Lakes, NJ USA |
| Nylon mesh (SEFAR NYTEX) | SEFAR AG | 03-50/31 | Sefar AG, Heiden, Switzerland |
| Growth chamber | CLF Plant Climatics | Percival I-30BLLX | CLF plant Climatics, Wertingen, Germany |
| Paclobutrazol | Sigma-Aldrich | 46046 | Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA |
References
- Debeaujon, I., Leon-Kloosterziel, K. M., Koornneef, M. Influence of the testa on seed dormancy, germination, and longevity in Arabidopsis. Plant Physiol. 122, 403-414 (2000).
- Baroux, C., Spillane, C., Grossniklaus, U. Evolutionary origins of the endosperm in flowering plants. Genome Biol. 3, reviews1026 (2002).
- Debeaujon, I., Lepiniec, L., Pourcel, L., Routaboul, J. -M. Seed development, dormancy and germination. , Blackwell Publishing. 25-43 (2007).
- Finch-Savage, W. E., Leubner-Metzger, G. Seed dormancy and the control of germination. New Phytol. 171, 501-523 (2006).
- Bethke, P. C., et al. The Arabidopsis aleurone layer responds to nitric oxide, gibberellin, and abscisic acid and is sufficient and necessary for seed dormancy. Plant Physiol. 143, 1173-1188 (2007).
- Lee, K. P., Piskurewicz, U., Tureckova, V., Strnad, M., Lopez-Molina, L. A seed coat bedding assay shows that RGL2-dependent release of abscisic acid by the endosperm controls embryo growth in Arabidopsis dormant seeds. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 19108-19113 (2010).
- Reed, J. W., Nagatani, A., Elich, T. D., Fagan, M., Chory, J. Phytochrome A and Phytochrome B Have Overlapping but Distinct Functions in Arabidopsis Development. Plant Physiol. 104, 1139-1149 (1994).
- Shinomura, T., et al. Action spectra for phytochrome A- and B-specific photoinduction of seed germination in Arabidopsis thaliana. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93, 8129-8133 (1996).
- Lee, K. P., et al. Spatially and genetically distinct control of seed germination by phytochromes A and B. Genes Dev. 26, 1984-1996 (2012).
- Lee, K. P., Lopez-Molina, L. Control of seed germination in the shade. Cell Cycle. 11, 4489-4490 (2012).
- Piskurewicz, U., et al. The gibberellic acid signaling repressor RGL2 inhibits Arabidopsis seed germination by stimulating abscisic acid synthesis and ABI5 activity. Plant Cell. 20, 2729-2745 (2008).
- Piskurewicz, U., Tureckova, V., Lacombe, E., Lopez-Molina, L. Far-red light inhibits germination through DELLA-dependent stimulation of ABA synthesis and ABI3 activity. EMBO J. 28, 2259-2271 (2009).
- Debeaujon, I., Koornneef, M. Gibberellin requirement for Arabidopsis seed germination is determined both by testa characteristics and embryonic abscisic acid. Plant Physiol. 122, 415-424 (2000).
- Sun, T. P., Kamiya, Y. The Arabidopsis GA1 locus encodes the cyclase ent-kaurene synthetase A of gibberellin biosynthesis. Plant Cell. 6, 1509-1518 (1994).
- Alonso, J. M., et al. Genome-wide insertional mutagenesis of Arabidopsis thaliana. Science. 301, 653-657 (2003).
- Rook, F., et al. Impaired sucrose-induction mutants reveal the modulation of sugar-induced starch biosynthetic gene expression by abscisic acid signalling. Plant J. 26, 421-433 (2001).
