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Biology

Un tégument Literie dosage à explorer génétiquement Published: November 9, 2013 doi: 10.3791/50732
Automatic Translation
1, 1
1Département de Botanique et de Biologie Végétale, Université de Genève

Summary

Nous présentons la procédure pour assembler une literie de manteau essai de semences (ARA) de Arabidopsis thaliana graines. L'ARA s'est révélée être un outil puissant pour explorer génétiquement in vitro et la façon dont la germination des contrôles de l'endosperme de graines en dormance des graines et en réponse à des signaux lumineux. L'ARA est en principe applicable en vertu d'une situation où l'endosperme est soupçonné d'influencer la croissance embryonnaire.

Abstract

L'endosperme de Arabidopsis est constitué d'une seule couche de cellules entourant l'embryon mature et jouant un rôle essentiel pour empêcher la germination des graines ou dormants que des graines non dormantes irradiés par une impulsion de lumière rouge lointain (FR). Afin d'obtenir d'autres renseignements sur les mécanismes génétiques moléculaires qui sous-tendent l'activité répressive de germination exercée par l'endosperme, un test "graines de literie de manteau" (ARA) a été conçu. L'ARA est une procédure de dissection séparer physiquement les téguments et les embryons de graines, qui permet de surveiller la croissance des embryons sur une couche sous-jacente de téguments. Remarquablement, l'ARA reconstitue la germination activités répressives de l'enveloppe de la graine dans le contexte de la dormance des graines et de contrôle FR-dépendante de la germination des graines. Depuis l'ARA permet l'utilisation combinatoire de manteau de graines dormantes, dormantes et génétiquement modifiés et matériaux embryonnaires, les voies génétiques contrôlant la germination et spécifiquement operating dans l'endosperme et de l'embryon peut être disséqué. Ici, nous détaillons la procédure d'assembler un appareil respiratoire autonome.

Introduction

Dans les graines matures Arabidopsis, le tégument est composé de la testa, une couche externe de tissu mort d'origine maternelle, et l'endosperme, une seule couche de cellules de tissus vivants entourant directement l'embryon 1. L'endosperme et l'embryon sont dérivés d'événements de fertilisation distinctes: l'endosperme est un tissu triploïde avec deux maternel et un génome paternel tandis que l'embryon est un tissu diploïde avec une mère et un génome paternel 2.

La fonction principale traditionnellement attribué à l'endosperme est celui d'un tissu nutritif. Cependant, il est de plus en plus évident que l'endosperme joue également un rôle central pour contrôler la germination des graines. Cette notion est devenue la première apparente dans le cas de dormance, un trait présentée par graines nouvellement produites. Graines dormantes ne germent pas, malgré la présence de conditions favorables de germination. Graines perdent leur dormance après une période de maturation et deviennent nondormant, c'est à dire qu'ils vont germer lorsqu'il est exposé à des conditions favorables de germination. Chez de nombreuses espèces de plantes, y compris la plante modèle Arabidopsis, le tégument est absolument nécessaire pour empêcher la germination des graines dormantes depuis élimination du tégument déclenche la croissance embryonnaire et l'écologisation de 3,4. Chez Arabidopsis, Bethke et al. Observé que la germination est resté refoulé après avoir enlevé le testa tout en maintenant l'endosperme entourant l'endosperme 5. Ces observations indiquaient fortement que l'endosperme est le tissu à l'intérieur de l'enveloppe de la graine exerçant une activité répressive sur l'embryon. Cependant, semences expériences d'enlèvement de couche ne contribuent pas nécessairement à clarifier la nature de l'activité répressive de germination fournies par le tégument de la graine, ni d'identifier les gènes qui la mettent en œuvre.

Nous avons récemment lancé un essai graines de literie de manteau (ARA) où les téguments et les embryons sont physiquement séparés, mais conservés à promité de sorte que l'activité répressive de la germination fourni par l'endosperme est maintenue 6. L'ARA permet l'utilisation combinatoire de manteau de graines dormantes, dormantes, et génétiquement modifiés et matériaux embryonnaires. En conséquence, les voies génétiques contrôlant la germination et fonctionnant spécifiquement dans l'endosperme et l'embryon peut être disséqués. L'ARA a été utilisé dans le cadre de la dormance de montrer que l'endosperme libère l'acide abscissique phytohormones (ABA) en direction de l'embryon à réprimer sa croissance 6. De plus, nous pourrions utiliser l'ARA à identifier les voies de signalisation qui opèrent dans l'endosperme et tissus embryonnaires de promouvoir la dormance.

Le rôle de l'endosperme de contrôler la germination a été renforcée en considérant le cas de semences non dormantes exposés à une impulsion de rouge lointain (FR) lumière. Tôt sur ​​l'imbibition une impulsion de lumière FR est connu pour inhiber la germination 7,8. Lorsque les téguments ont été retirés de graines d'une impulsion de lumière FRa été incapable d'inhiber la germination, ce qui suggère fortement que l'endosperme peut également réprimer la germination des graines non dormantes 9. Fait étonnant, l'ARA peut également être utilisé pour récapituler FR-dépendante inhibition de la germination. Cela a permis de montrer que cette FR-dépendante inhibition de la germination des graines est également un processus impliquant ABA libération de l'endosperme 9. En outre, l'ARA a permis d'identifier les différentes voies de signalisation lumineuse opérant dans l'endosperme et l'embryon de contrôler la germination des graines dormantes en réponse à des signaux lumineux 9,10.

L'ARA apparaît donc comme une technique fiable pour explorer la fonction de l'endosperme dans le contexte du contrôle de la germination des graines. Il est également un outil puissant pour évaluer in vitro si les gènes soupçonnés de contrôler la germination opèrent dans l'albumen, l'embryon ou les deux tissus. Ici, nous détaillons les différentes étapes nécessaires à l'assemblage d'un appareil respiratoire autonome.

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Protocol

Une fois que l'ARA est assemblé, la croissance de l'embryon est surveillé pendant plusieurs jours. Par conséquent, avant la procédure de dissection des semences et de l'assemblage de l'appareil respiratoire, il faut stériliser les semences pour éviter les contaminations futures qui pourraient empêcher une évaluation adéquate de l'effet du matériau d'enveloppe de graine sur la croissance embryonnaire.

Une. Graine de stérilisation

  1. Verser 50 à 60 ul de graines d'Arabidopsis matures et sèches, dans un tube de centrifugation de 1,5 ml et de préparer une solution d'éthanol à 70%.
  2. Ajouter 1 ml de solution d'éthanol à 70% pour le tube à centrifuger contenant les graines et agiter à température ambiante pendant 10 min à 1200 rpm dans un vortex.
  3. Centrifugeuse microtube pendant 3 secondes à 4000 g de concentrer les graines au fond du tube.
  4. Aspirer la solution d'éthanol à 70% à l'aide d'un embout d'aspiration sous vide en laissant soigneusement les graines au fond du tube à centrifuger.
  5. Ajouter 1 ml d'eau distillée stérile à t il microtube contenant encore des graines.
  6. Agiter à température ambiante pendant 10 min à 1200 rpm.
  7. Centrifugeuse microtube pendant 3 secondes à 4000 g de concentrer les graines au fond du tube. Aspirer le surnageant de l'eau à l'aide d'un embout d'aspiration sous vide en laissant soigneusement les graines au fond du tube.
  8. Ajouter 1 ml d'eau distillée, de l'eau stérile pour le microtube contenant encore des graines. Assurez-vous que le débit d'eau de manière homogène suspend les graines à l'intérieur du tube. Le but ici est d'éviter secouant outre, afin de préserver l'intégrité des graines.
  9. Laissez les graines se déposent par gravité au fond du tube, en laissant le tube encore pendant 30 sec. Aspirer le surnageant de l'eau à l'aide d'un embout d'aspiration sous vide en laissant soigneusement les graines au fond du tube.
  10. Répétez quatre fois les étapes 1.8 à 1.9. Dans l'ensemble de la procédure de stérilisation dure environ 30 min.

2. Graine de placage

ontenu "> Toutes les étapes suivantes sont exécutées à l'intérieur d'une hotte à flux laminaire afin de préserver des conditions stériles.

  1. Préparer une plaque de boîte de Pétri (diamètre de 100 mm, 20 mm de hauteur), contenant 30 ml de milieu de germination préparé par autoclavage d'une solution contenant 4,3 g / L de milieu de Murashige et Skoog à 2,5 mM de 2 - (N-morpholino) éthanesulfonique (MES-KOH ; pH 5,7) et 0,8 g / L d'agar. Laisser la solution refroidir dans un bain d'eau à 50 ° C avant de le verser sur la plaque de boîte de Pétri.
  2. Ajouter 200 ul d'eau distillée stérile dans le tube contenant les semences. Remettre en suspension les graines et les transférer sur la surface du milieu de germination à l'aide d'une pipette standard avec une pointe de 1 ml.
  3. Éliminer l'eau entourant les graines sur la surface du milieu de germination à l'aide d'un embout d'aspiration à vide.
  4. Laissez la boîte de Pétri contenant les graines sans son couvercle intérieur de la hotte à flux laminaire pendant 2 heures pour un séchage supplémentaire. Fermez la boîte de Pétri avec le couvercle et laisser reposer sous la laminaires'écouler armoire pendant environ 90 min de sorte qu'environ 4 heures se sont écoulées depuis l'ouverture de la procédure de stérilisation des semences (étape 1.2).

3. Graine Dissection

Les étapes suivantes nécessitent de travailler avec un stéréomicroscope placé à l'intérieur de l'armoire de la hotte à flux laminaire. Une pince Dumont # 5 avec tronquées (c.-à-franc) conseils facilite grandement la manipulation des graines (figure 1A).

  1. Préparez une nouvelle plaque de boîte de Pétri contenant 30 ml de milieu de germination. Placer sur la surface des deux moyennes papiers juxtaposés rectangulaires stériles Whatman 3MM (1,5 cm x 1,0 cm, figure 1B, étape 1). Whatman 3MM papier est stérilisé à l'autoclave.
  2. Transfert des graines sur les papiers Whatman 3MM aide de pinces stériles (figure 1B, étape 2).
  3. Tenir une graine individuelle contre le papier Whatman 3MM en appuyant doucement sur la graine en utilisant les bouts arrondis juxtaposés de la pince tronquées (
  4. Couper le tégument (testa et endosperme) de la graine à l'aide d'une aiguille de seringue (par exemple l'insuline U100 seringue + 1 ml de seringue, 0,33 mm (29 G) x 12,7 mm) (figure 1B, étape 4). La forme de la graine d'Arabidopsis est ellipsoïdale et il est recommandé de couper l'enveloppe de la graine ainsi que les semi-axe principal plus longues aussi près que possible de l'endroit où les cotylédons sont joints à la radicule (c'est à dire de la pointe radical). Ceci aide à la libération en toute sécurité de l'embryon dans l'étape suivante de la procédure de dissection.
  5. Poussez la semence contre le papier Whatman 3MM utilisant les bouts arrondis juxtaposés de la pince tronquées (figure 1B, étape 5). Cette étape libère l'embryon sur le tégument de la graine à travers l'ouverture créée à l'étape 3.4 (figure 1B, étape 6). Il est recommandé d'appliquer la pression sur la graine où la pointe des cotylédons sont en plus proche de la pointe de la radicule (c'est à dire l'écart from l'ouverture).

4. Assemblée de l'enveloppe de la graine Literie Assay (ARA)

Voir la discussion pour le bon choix du nombre de couches de semences et d'embryons.

  1. Préparez une nouvelle plaque de boîte de Pétri contenant 30 ml de milieu de germination. Place sur la surface du support une pièce rectangulaire stérile (3,5 cm x 5,0 cm) de la maille en nylon (figure 2, étape 1).
  2. Pour éviter des dégâts, les embryons et les téguments peuvent être déplacés à la surface des bords métalliques de la pince en les poussant doucement à l'aide de l'aiguille de la seringue (figure 2, étape 2). embryons de transfert et des téguments sur le maillage en nylon (figure 2, étape 3).
  3. Monter une couche circulaire et unique de téguments en utilisant les forceps émoussé et l'aiguille de s'assurer que les graines manteaux sont à proximité comme beaucoup plus proche que possible (figure 2, étape 4). Essayez d'exposer autant que possible l'ouverture d'enveloppe de la graine produite par lel'aiguille vers le haut. Cette étape n'est pas systématiquement testé. Toutefois, on pourrait augmenter l'efficacité de l'ARA depuis substances diffusibles inhibant la croissance de l'embryon sont attendus pour diffuser directement vers l'embryon au lieu de s'en éloigner.
  4. Placer les embryons comme une seule couche circulaire sur le centre de la couche de lit de semence assemblé à l'étape 4.3 (figure 2, étape 5). Veiller à ce que les embryons sont à proximité comme beaucoup plus proche possible.
  5. Incuber les ARA sous lumière continue (40 pmol / m 2 ec) à 20-21 ° C. Dans le cas où une impulsion FR est utilisé pour arrêter la germination, assembler l'appareil respiratoire sous une lumière normale, appliquer l'impulsion de FR comme décrit 9 et laissez boîte de Pétri dans l'obscurité.

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Representative Results

Des travaux antérieurs ont montré que les graines mutantes incapables de synthétiser GA ont été incapables de germer à la suite d'une forte accumulation de l'ABA dans les graines 11,12. Cependant, l'incapacité à germer nécessite l'enveloppe de la graine depuis son enlèvement déclenche 13 de croissance embryonnaire. Ce fortement indiqué que l'endosperme de graines incapables de synthétiser GA publie ABA pour bloquer la croissance embryonnaire. Nous attendons donc graines manteaux incapables de synthétiser GA pour bloquer la croissance des embryons dans un ARA contrairement téguments incapables de synthétiser GA et ABA. Ici, nous utilisons ga1-21 (Salk ligne d'insertion Salk_109115) graines mutantes portant une insertion ADN-T disruption du gène GA1 (adhésion AT4G02780) codant pour ent-copalyl diphosphate synthase, ce qui est essentiel pour biosynthèse des GA 14 (SALK_109115 de lignées d'insertion dans GA1 (Col écotype) est référencé dans la base de données SALK Signal 15 ( http://signal.salk. Edu /).

Conformément aux résultats précédents 13, ga1-21 graines mutantes ne pouvaient germer 80 heures après imbibition de la graine (graphique 3, partie 1). En revanche et en outre compatible avec les résultats précédents 13, élimination du tégument déclenché ga1-21 la croissance de l'embryon (figure 3, panneau 2) à moins ABA était présente dans le milieu (figure 3, panneau 3).

Groupe 4 de la figure 3 a été prise 80 heures après l'imbibition et montre un appareil respiratoire autonome avec ga1-21 embryons sur un lit de 80 ga1-21 téguments. Conformément à notre hypothèse, ga1-21 téguments mutantes ont bloqué la croissance de ga1-21 embryons.

Des travaux antérieurs ont montré que dans les graines dormantes le tégument synthétise et libère ABA vers l'embryon comme un résultat de l'expression constitutive du facteur de DELLA RGL2 GA-de réponse, ce qui favorise l'accumulation de l'ABA dans imbibégraines 6,11. Dans des conditions où la synthèse GA est bloqué le facteur RGL2 de DELLA s'accumule constitutive et favorise l'accumulation de l'ABA 11. Absence de RGL2 et la synthèse de l'ABA dans ga1-21 téguments est donc prévu pour permettre la croissance de ga1-21 embryons dans un ARA. Pour tester cette hypothèse, nous avons utilisé la ABA2-1 allèle mutant (Col de écotype), déficiente dans la synthèse de ABA à la suite d'une mutation ponctuelle dans le gène codant pour Xanthosin déshydrogénase (AT1G52340) et la ligne d'insertion rgl2-14 T-ADN (Salk_027654, Col écotype) 16.

Figure 1
Figure 1. Procédure pour la dissection de la graine. A) Schéma décrivant comment faire forceps tronqués pour la dissection de la graine. Pinces peuvent être tronqués avec des ciseaux ou des pinces. Lorsque la pince est fermée le conseil tronquées juxtaposés shou. couvercle ld une surface de la taille d'une graine B) Etape 1: deux côte à côte rectangulaires papiers Whatman 3MM stériles sont mis sur une plaque de boîte de Petri contenant un milieu MS solide. Etape 2: les graines sont transférées sur la surface des papiers Whatman 4 heures après imbibition. Étape 3: la procédure de dissection nécessite la tenue de la graine contre le papier Whatman en utilisant les forceps tronquées. Étape 4: Une aiguille de seringue est utilisée pour couper l'enveloppe de la graine comme indiqué. Les étapes 5 et 6: Les conseils juxtaposées des pinces fermées sont utilisés pour repousser doucement l'embryon sur le tégument sur le site de la coupe.

Figure 2
Figure 2. . Procédure pour le montage de l'essai des semences de literie de manteau Etape 1: Une pièce rectangulaire de maille de nylon est posé sur une plaque de boîte de Petri contenant un milieu MS solide. Étape 2 et 3: disséquée embryons et les téguments sont doucementdéplacé vers les bords de la pince à l'aide de l'aiguille de la seringue avant de les transférer sur le maillage en nylon. Etape 4 et 5: Monter une couche circulaire et unique de téguments et éliminer les embryons comme une couche circulaire unique sur le centre du lit de tégument assemblé.

Figure 3
Figure 3. Les résultats représentatifs avec un matériau incapable de synthétiser GA de semences. Tégument essais de literie à l'aide de couches de semences et embryons prélevés chez ga1 des semences (ga1-21), mutantes incapables de synthétiser GA. Les panels montrent le matériel végétal tel que décrit dans la figure 80 heures après imbibition des semences.

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Discussion

Le dosage de la literie de tégument (ARA) décrite ici est en principe applicable à toute circonstance où la germination des graines d'Arabidopsis est bloqué (ou retardée) et où l'endosperme est soupçonné de mettre en œuvre cette arrestation. Ce dernier peut être attestés par enlever le tégument (testa et endosperme) et en observant que le produit de croissance embryonnaires rapides par rapport à celle observée lorsque les embryons sont entourés par l'enveloppe de la graine. La germination peut être bloqué en réponse à des paramètres physiques de l'environnement (par exemple, le potentiel de l'eau ou de la qualité de la lumière) ou dans des fonds génétiques spécifiques (par exemple, absence de synthèse GA comme chez les mutants GA1, voir la figure 3).

Il n'y a pas de règles générales concernant le nombre de couches de semences et embryons destinés à être utilisés pour un appareil respiratoire autonome. Cela dépend du lot de semence (et en particulier sa fraîcheur) et le type d'expérience à être effectuée. Il est donc essentiel de adjust la quantité de matériau découpé dans chaque cas particulier par contrôle de la croissance sur les embryons sur le lit de couches de semences sur une base quotidienne. Cependant, habituellement quelques couches de semences sont nécessaires lorsque écotypes d'Arabidopsis très dormants sont utilisés. Présentés ci-dessous sont des montants typiques de téguments et les embryons qui ont été utilisés avec succès lors de l'assemblage des appareils respiratoires autonomes:

ARA avec du matériel de graines dormantes 6:
* Fraîchement récoltées (c.-à-sommeil) l'île du Cap-Vert écotype (IVC): utilisation d'embryons 10 et 20 téguments.

* Fraîchement récoltées Landsberg (Ler) graines: Utiliser 10 embryons et 80 téguments.

SCBA en absence de gibbérellines (GA) biosynthèse (figure 3):
* Graines ga1 mutantes (Britannique - Col - écotype): utilisation d'embryons 10 et 80 téguments.

* type sauvage graines Col avec 10 uM paclobutrazole (un inhibiteur de la biosynthèse des GA) dans le milieu de germination: Utilisez 10 embryons et 100 téguments. Ajouter Paclobutrazol lorsque le milieu est refroidi à 50 ° C avant de verser dans la boîte de Pétri.

SCBA après une impulsion de rouge lointain (FR) lumière 9:
* Utilisez 12 embryons et 100 téguments.

La seule limitation de la technique ARA est qu'il exige de la patience et de dextérité afin d'assembler rapidement les matériaux de semences disséqués sans tuer les embryons. Un chercheur expérimenté peut disséquer 100 graines dans 20-30 min. Toutefois, les utilisateurs moins expérimentés peuvent avoir besoin de 1 heure et attendre dommages embryonnaire. A notre connaissance, il n'existe à ce jour aucun des techniques alternatives à explorer le rôle de l'endosperme pour le contrôle de la germination des graines.

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Disclosures

Les auteurs déclarent qu'ils n'ont aucun intérêt financier concurrents.

Acknowledgments

Ce travail a été soutenu par des subventions du Fonds national suisse de la science et de l'Etat de Genève.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Thermomixer Comfort Eppendorf AG 5355 000.011 Eppendorf AG, Hamburg, Germany
Vacusafe Comfort INTEGRA Biosciences AG 158 310 Integra Biosciences AG, Zizers, Switzerland
Petri dish plate (100 mm x 20 mm) Greiner Bio-One GmbH 664 102 Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany
Murashige and Skoog Sigma-Aldrich M5524 Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA
MES Sigma-Aldrich M3671 Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA
Agar (plant agar) Duchefa Biochemie B.V. P1001 Duchefa Biochemie, Haarlem, Netherlands
Dumont forceps #5 Fine Science Tools GmbH 11251-10 Fine Science Tools GmbH, Heidelberg Germany
Syringe needle BD Micro-Fine 324827 BD, Franklin Lakes, NJ USA
Nylon mesh (SEFAR NYTEX) SEFAR AG 03-50/31 Sefar AG, Heiden, Switzerland
Growth chamber CLF Plant Climatics Percival I-30BLLX CLF plant Climatics, Wertingen, Germany
Paclobutrazol Sigma-Aldrich 46046 Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA

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References

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