Summary
Vi presentiamo la procedura per assemblare un seme saggio di biancheria da letto di mano (SCBA) da Arabidopsis thaliana semi. La SCBA ha dimostrato di essere uno strumento potente per esplorare geneticamente e in vitro come il germinazione del seme controlli endosperma nei semi dormienti e in risposta a stimoli luminosi. L'autorespiratore in linea di principio applicabile in qualsiasi situazione in cui l'endosperma è sospettato di influenzare la crescita embrionale.
Abstract
L'endosperma Arabidopsis è costituito da un singolo strato di cellule che circonda l'embrione maturo e gioca un ruolo essenziale per impedire la germinazione dei semi dormienti o di semi nondormant irradiati da un impulso di luce rosso lontano (FR). Al fine di ottenere ulteriori informazioni sui meccanismi genetici molecolari alla base della germinazione attività repressiva esercitata dal endosperma, un saggio di "assestamento cappotto di seme" (SCBA) è stato concepito. La SCBA è una procedura di dissezione separando fisicamente tegumenti ed embrioni da semi, che consente il monitoraggio della crescita di embrioni in uno strato sottostante di cappotti di seme. Sorprendentemente, l'autorespiratore ricostituisce la germinazione attività repressive del cappotto di seme nel contesto della dormienza dei semi e di controllo FR-dipendente di germinazione dei semi. Poiché l'autorespiratore consente l'utilizzo combinatoria di dormienti, nondormant e geneticamente modificati tegumento e materiali embrionali, i percorsi genetici che controllano la germinazione e specificatamente opdendo per l'endosperma ed embrione può essere sezionato. Qui ci dettaglio la procedura per assemblare un autorespiratore.
Introduction
In Arabidopsis semi maturi, il cappotto di seme è composto dalla testa, uno strato esterno di tessuto morto di origine materna, e l'endosperma, un singolo strato di cellule di tessuto vivo che circonda direttamente l'embrione 1. L'endosperma e l'embrione sono derivati da eventi fecondazione distinti: il endosperma è un tessuto triploide con due materna e un genoma paterno che l'embrione è un tessuto diploide con una materna e un genoma paterno 2.
La funzione principale tradizionalmente assegnato al endosperma è quello di un tessuto nutritivo. Tuttavia, è sempre più evidente che l'endosperma svolge un ruolo centrale per controllare la germinazione dei semi. Questa nozione è diventato il primo evidente nel caso di dormienza, un tratto esibita da semi di nuova produzione. Semi dormienti non riescono a germinare nonostante la presenza di condizioni di germinazione favorevoli. I semi perdono la loro dormienza dopo un periodo di maturazione e diventano nondormant, cioè germineranno quando esposto a condizioni favorevoli di germinazione. In molte specie vegetali, tra cui la pianta modello Arabidopsis, il cappotto di seme è assolutamente necessaria per impedire la germinazione dei semi dormienti poiché la rimozione tegumento innesca la crescita embrionale e greening 3,4. In Arabidopsis, Bethke et al. Ha osservato che la germinazione è rimasta repressa dopo aver tolto la testa, pur mantenendo l'endosperma che circonda l'endosperma 5. Queste osservazioni hanno indicato con forza che l'endosperma è il tessuto all'interno del cappotto di seme esercitando un'attività repressiva sull'embrione. Tuttavia, seme esperimenti rimozione coat non necessariamente aiutano chiarire la natura della germinazione attività repressiva fornite dal tegumento né identificare i geni che implementano.
Abbiamo recentemente introdotto un test di biancheria cappotto di seme (SCBA) dove cappotti di seme ed embrioni sono separati fisicamente, ma tenuti in prossimmità modo che l'attività repressiva germinazione fornita dal endosperma viene mantenuta 6. L'autorespiratore consente l'uso combinatorio di dormienti, nondormant e geneticamente modificati tegumento e materiali embrionali. Come risultato, i percorsi genetici che controllano la germinazione e specificamente operante nel endosperma ed embrione può essere sezionato. La SCBA stato usato nel contesto della dormienza per dimostrare che l'endosperma rilascia l'acido abscissico phytohormone (ABA) verso l'embrione di reprimere la sua crescita 6. Inoltre, potremmo usare l'autorespiratore per identificare le vie di segnalazione che operano in endosperma e tessuti embrionali per promuovere la dormienza.
Il ruolo del endosperma di controllare la germinazione è stata ulteriormente rafforzata considerando il caso delle sementi nondormant esposti a un impulso di rosso lontano (FR) della luce. Presto su imbibizione semi di un impulso luminoso FR è noto per inibire la germinazione 7,8. Quando tegumenti sono stati rimossi dai semi un impulso di luce FRera in grado di inibire la germinazione, suggerendo fortemente che l'endosperma può anche reprimere la germinazione dei semi nondormant 9. Sorprendentemente, la SCBA potrebbe anche essere utilizzato per ricapitolare inibizione FR-dipendente di germinazione. Questo ha permesso di dimostrare che tale FR-dipendente inibizione della germinazione dei semi è anche un processo che coinvolge ABA liberazione dal endosperma 9. Inoltre, l'autorespiratore permesso identificare le differenti vie di segnalazione luminosa che operano nel endosperma e l'embrione di controllare la germinazione dei semi nondormant in risposta a stimoli luminosi 9,10.
La SCBA sembra quindi essere una tecnica affidabile per esplorare la funzione del endosperma nell'ambito del controllo di germinazione dei semi. E 'anche un potente strumento per valutare in vitro se i geni sospettati di controllare germinazione operare nel endosperma, l'embrione o entrambi i tessuti. Qui abbiamo dettaglio le varie fasi necessarie per assemblare un autorespiratore.
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Protocol
Una volta che il SCBA è assemblato, la crescita di embrioni viene monitorato per diversi giorni. Pertanto, prima della procedura di dissezione seme e montaggio del autorespiratori, si ha la necessità di sterilizzare i semi per evitare contaminazioni future che potrebbero impedire la corretta valutazione dell'effetto di materiale tegumento sulla crescita embrionale.
1. Seed Sterilizzazione
- Versare 50-60 ml di semi di Arabidopsis maturi e secchi in una provetta da 1,5 ml e preparare una soluzione di etanolo al 70%.
- Aggiungere 1 ml di soluzione di etanolo al 70% per la provetta contenente i semi e agitare a temperatura ambiente per 10 min a 1200 rpm in un vortex.
- Centrifugare provetta per 3 sec a 4.000 xg per concentrare sementi al fondo della provetta.
- Aspirare la soluzione di etanolo al 70% con una punta di aspirazione vuoto, lasciando accuratamente i semi sul fondo della provetta.
- Aggiungere 1 ml di acqua distillata sterile per t egli provetta contenente ancora i semi.
- Agitare a temperatura ambiente per 10 min a 1200 rpm.
- Centrifugare provetta per 3 sec a 4.000 xg per concentrare sementi al fondo della provetta. Aspirare il surnatante acqua utilizzando una punta di aspirazione vuoto, lasciando accuratamente i semi sul fondo della provetta.
- Aggiungere 1 ml di acqua distillata acqua sterile alla provetta contenente ancora i semi. Assicurarsi che il flusso di acqua sospende omogeneamente i semi all'interno del tubo. L'obiettivo è quello di evitare un ulteriore agitazione in modo da preservare l'integrità dei semi.
- Lasciare che i semi depositano per gravità sul fondo del tubo lasciando il tubo ancora per 30 sec. Aspirare il surnatante acqua utilizzando una punta di aspirazione vuoto, lasciando accuratamente i semi sul fondo della provetta.
- Ripetere quattro volte i passaggi 1,8-1,9. Nel complesso la procedura di sterilizzazione dura circa 30 min.
2. Seed placcatura
ONTENUTO "> Tutte le fasi successive vengono eseguite all'interno di una cappa a flusso laminare per mantenere condizioni di sterilità.- Preparare una piastra piastra di Petri (diametro 100 mm, altezza 20 mm) contenente 30 ml di mezzo di germinazione preparato autoclavando una soluzione contenente 4,3 g / L Murashige e Skoog in 2,5 mM 2 - (N-morfolino) acido etansolfonico (MES-KOH ; pH 5.7) e 0,8 g / L di agar. Lasciare raffreddare la soluzione in un bagno d'acqua a 50 ° C prima di versarlo sulla piastra piastra Petri.
- Aggiungere 200 ml di acqua distillata sterile per il tubo contenente i semi. Risospendere i semi e trasferirli sulla superficie del mezzo di germinazione con una pipetta standard con una punta di 1 ml.
- Rimuovere l'acqua che circonda i semi sulla superficie del mezzo di germinazione con una punta di aspirazione sotto vuoto.
- Lasciare la piastra Petri contenente i semi senza coperchio all'interno della cappa a flusso laminare per 2 ore per ulteriore essiccamento. Chiudere la capsula di Petri con il coperchio e lasciar riposare sotto il laminareflusso armadio per circa 90 minuti in modo che circa 4 ore sono passati da quando l'avvio della procedura di sterilizzazione seme (fase 1.2).
3. Seed Dissection
Le seguenti operazioni richiedono lavoro con uno stereomicroscopio posto all'interno dell'armadio cappa a flusso laminare. Un Dumont pinze # 5 con troncate consigli (cioè smussato) facilita notevolmente la manipolazione dei semi (Figura 1A).
- Preparare una nuova piastra capsula di Petri contenente 30 ml di terreno di germinazione. Posto sulla superficie delle medie due rettangolari sterili carte Whatman 3MM giustapposte (1,5 cm x 1,0 cm; Figura 1B, step 1). Whatman 3MM carta viene sterilizzato in autoclave.
- Trasferire i semi delle carte Whatman 3MM utilizzando pinze sterili (Figura 1B, step 2).
- Tenere un seme di persona contro la carta Whatman 3MM premendo delicatamente il seme con le punte smussate giustapposti della pinza troncati (
- Tagliare il cappotto di seme (testa e endosperma) del seme utilizzando un ago della siringa (ad esempio U100 insulina siringa + 1 siringa ml, 0,33 millimetri (29 G) x 12,7 mm) (Figura 1B, punto 4). La forma del seme di Arabidopsis è ellissoidale e si consiglia di tagliare il cappotto di seme lungo la più lunga semi-asse principale più vicino possibile al luogo in cui i cotiledoni sono uniti alla radichetta (cioè lontano dalla punta radicale). Questo aiuta il rilascio sicuro dell'embrione nella fase successiva del procedimento dissezione.
- Spingere il seme contro la carta Whatman 3MM utilizzando le punte smussate giustapposti della pinza troncate (Figura 1B, punto 5). Questo passaggio rilascia l'embrione fuori il cappotto di seme attraverso l'apertura creata nel passaggio 3.4 (Figura 1B, punto 6). Si raccomanda di applicare la spinta sul seme in cui la punta dei cotiledoni sono in più vicino alla estremità radicolare (cioè lontano from l'apertura).
4. Assemblea del cappotto di seme Bedding Assay (SCBA)
Si veda la discussione per la corretta scelta del numero di cappotti di seme ed embrioni.
- Preparare una nuova piastra capsula di Petri contenente 30 ml di terreno di germinazione. Posto sulla superficie del terreno un pezzo rettangolare sterile (3.5 cm x 5,0 centimetri) di maglia di nylon (Figura 2, punto 1).
- Per evitare danni, embrioni e tegumenti possono essere spostati alla superficie dei bordi metallici della pinza spingendo delicatamente utilizzando l'ago della siringa (Figura 2, punto 2). Embrioni di trasferimento e tegumenti sulla maglia di nylon (Figura 2, punto 3).
- Montare uno strato circolare e singola di tegumenti utilizzando le pinze smussate e l'ago fare in modo che i semi cappotti sono in quanto una maggiore vicinanza possibile (Figura 2, punto 4). Prova di esporre il più possibile l'apertura tegumento generato dall'ago verso l'alto. Questo passo non è stato sistematicamente testato. Tuttavia, potrebbe aumentare l'efficienza del SCBA da sostanze diffusibili inibiscono la crescita dell'embrione dovrebbero diffondere direttamente verso l'embrione piuttosto che lontano da esso.
- Mettere gli embrioni come un unico strato circolare al centro del letto tegumento assemblato in fase 4.3 (Figura 2, punto 5). Assicurarsi che gli embrioni sono tanto maggiore vicinanza possibile.
- Incubare le autorespiratori sotto luce continua (40 micromol / m 2 s ec) a 20-21 ° C. Nel caso in cui un impulso FR viene utilizzato per arrestare la germinazione, montare il SCBA a luce normale, applica l'impulso FR come descritto 9 e lasciare piastra di Petri nell'oscurità.
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Representative Results
Lavoro precedente ha mostrato che i semi mutanti incapaci di sintetizzare GA erano in grado di germinare come risultato di accumulo alta ABA in semi 11,12. Tuttavia, l'incapacità di germinare richiede il cappotto di seme fin dalla sua rimozione innesca embrionale 13 la crescita. Questo indica fortemente che l'endosperma dei semi in grado di sintetizzare GA sta rilasciando ABA per bloccare la crescita embrionale. Ci aspettiamo quindi semi cappotti in grado di sintetizzare GA per bloccare la crescita di embrioni in un autorespiratore a differenza di cappotti di seme in grado di sintetizzare GA e ABA. Qui usiamo GA1-21 (linea di inserimento Salk Salk_109115) semi mutanti che trasportano un inserimento di T-DNA interrompere il gene GA1 (adesione AT4G02780) che codifica per ent-copalyl difosfato sintasi, che è essenziale per la biosintesi GA 14 (SALK_109115 linea di inserimento in GA1 (Col ecotipo) viene fatto riferimento nel database SALK segnale 15 ( http://signal.salk. Edu /).
Coerentemente con i risultati precedenti 13, GA1-21 semi mutanti non potevano germinare 80 ore dopo imbibizione delle sementi (Figura 3, Panel 1). In contrasto e in seguito in linea con i risultati precedenti 13, rimozione tegumento innescato GA1-21 embrione crescita (figura 3, pannello 2) a meno ABA era presente nel mezzo (Figura 3, pannello 3).
Pannello 4 in figura 3 è stata presa 80 ore dopo imbibizione dei semi e mostra un autorespiratore con GA1-21 embrioni su un letto di 80 GA1-21 tegumenti. Coerentemente con la nostra ipotesi, GA1-21 tegumenti mutanti bloccato la crescita di GA1-21 embrioni.
Lavoro precedente ha mostrato che nei semi dormienti tegumento sintetizza e rilascia ABA verso l'embrione come conseguenza della espressione costitutiva di GA-risposta fattore DELLA RGL2, che promuove l'accumulo ABA in assorbitoSemi di 6,11. In condizioni in cui la sintesi GA è bloccato il fattore DELLA RGL2 accumula costitutivamente e promuove l'accumulo di ABA 11. Assenza di RGL2 e sintesi di ABA in GA1-21 tegumenti dovrebbe quindi permettere la crescita di GA1-21 embrioni in un autorespiratore. Per verificare questa ipotesi abbiamo utilizzato il aba2-1 allele mutante (Col ecotipo), carenti di sintesi ABA come risultato di una mutazione puntiforme nel gene codificante Xanthosin deidrogenasi (AT1G52340) e la linea di inserimento rgl2-14 T-DNA (Salk_027654, Col ecotipo) 16.
Figura 1. Procedura per la dissezione seme. A) Schema che descrive come fare pinze troncati per la dissezione delle sementi. Pinze possono essere troncati con le forbici o pinze. Quando la pinza è chiuso il punte troncate giustapposti shou. copertura ld una superficie delle dimensioni di un seme B) Fase 1: due fianco a fianco rettangolari sterili carte Whatman 3MM sono disposte su un piatto piastra di Petri contenente terreno solido MS. Fase 2: semi vengono trasferiti sulla superficie delle carte Whatman 4 ore dopo imbibizione. Fase 3: la procedura di dissezione richiede che tiene il seme contro la carta Whatman utilizzando le pinze troncate. Fase 4: Un ago della siringa è usata per tagliare il cappotto di seme, come mostrato. Passi 5 e 6: Le punte giustapposti della pinza chiusi sono usati per spingere delicatamente l'embrione fuori dal cappotto di seme attraverso il sito del taglio.
Figura 2. . Procedura per il montaggio del test biancheria cappotto di seme Passo 1: Un pezzo rettangolare di maglia in nylon è posato su una piastra piastra di Petri contenente terreno solido MS. Fase 2 e 3: Dissected embrioni e tegumenti sono delicatamentespostato ai bordi della pinza usando l'ago della siringa prima di trasferirli sulla rete di nylon. Fase 4 e 5: Montare uno strato circolare e singola di tegumenti e smaltire gli embrioni come un unico strato circolare al centro del letto tegumento assemblato.
Figura 3. Rappresentante risultati con materiale di seme in grado di sintetizzare GA. Seed cappotto saggi di biancheria da letto con cappotti e gli embrioni di semi sezionati da GA1 semi (GA1-21) mutanti, incapaci di sintetizzare GA. Pannelli mostrano materiale vegetale come descritto nella figura 80 ore dopo imbibizione seme.
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Discussion
Procedura Il test biancheria cappotto di seme (SCBA) qui descritto è in linea di principio applicabile a qualsiasi circostanza in cui la germinazione del seme di Arabidopsis è bloccato (o ritardato) e dove l'endosperma è sospettato di implementare questo arresto. Quest'ultimo può essere provata togliendo il cappotto di seme (testa e endosperma) e osservando che i proventi di crescita embrionali più veloce rispetto a quella osservata quando gli embrioni sono circondati dal tegumento. La germinazione può essere bloccato in risposta a particolari parametri fisici ambientali (ad esempio potenziali acqua o qualità della luce) o in background genetici specifici (ad esempio, assenza di sintesi GA come in mutanti GA1, vedi Figura 3).
Non esistono regole generali relative al numero di cappotti di seme ed embrioni da utilizzare per un autorespiratore. Questo dipende dalla partita di semi (e in particolare la sua freschezza) e del tipo di esperimento da eseguire. E 'quindi fondamentale per adjust la quantità di materiale sezionato per ciascun caso particolare monitorando la crescita su embrioni sul letto di tegumenti su base giornaliera. Tuttavia, di solito pochi tegumenti sono necessari quando si utilizzano ecotipi di Arabidopsis altamente dormienti. Di seguito vengono riportati gli importi tipici di cappotti di seme ed embrioni che sono stati utilizzati con successo durante il montaggio autorespiratori:
SCBA con materiale di seme dormiente 6:
* Appena raccolte (cioè dormiente) Capo Verde Isola ecotipo (CVI): Usa 10 embrioni e 20 cappotti di seme.
* Appena raccolte Landsberg (Ler) semi: Usa 10 embrioni e 80 cappotti di seme.
SCBA in assenza di gibberelline (GA) biosintesi (Figura 3):
* Semi GA1 mutanti (Columbia - Col - ecotipo): Usa 10 embrioni e 80 cappotti di semi.
* wild type Col semi con 10 pM paclobutrazol (un inibitore della biosintesi GA) nel mezzo di germinazione: Usa 10 embrionis e 100 tegumenti. Aggiungere Paclobutrazol quando il mezzo viene raffreddato a 50 ° C prima di versare nel piatto Petri.
SCBA dopo un impulso di rosso lontano (FR) Luce 9:
* Utilizzare 12 embrioni e 100 tegumenti.
L'unica limitazione della tecnica SCBA è che richiede pazienza e destrezza in modo da assemblare rapidamente le semenze sezionati mentre non uccidere gli embrioni. Un ricercatore esperto può sezionare 100 semi entro 20-30 min. Tuttavia, gli utenti meno esperti possono avere bisogno di 1 ora e si aspettano danni embrionale. A nostra conoscenza non ci sono finora nessun tecniche alternative per esplorare il ruolo della mandorla farinosa per il controllo della germinazione dei semi.
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Disclosures
Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni dal National Science Foundation svizzero e dallo Stato di Ginevra.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Thermomixer Comfort | Eppendorf AG | 5355 000.011 | Eppendorf AG, Hamburg, Germany |
| Vacusafe Comfort | INTEGRA Biosciences AG | 158 310 | Integra Biosciences AG, Zizers, Switzerland |
| Petri dish plate (100 mm x 20 mm) | Greiner Bio-One GmbH | 664 102 | Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany |
| Murashige and Skoog | Sigma-Aldrich | M5524 | Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA |
| MES | Sigma-Aldrich | M3671 | Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA |
| Agar (plant agar) | Duchefa Biochemie B.V. | P1001 | Duchefa Biochemie, Haarlem, Netherlands |
| Dumont forceps #5 | Fine Science Tools GmbH | 11251-10 | Fine Science Tools GmbH, Heidelberg Germany |
| Syringe needle | BD Micro-Fine | 324827 | BD, Franklin Lakes, NJ USA |
| Nylon mesh (SEFAR NYTEX) | SEFAR AG | 03-50/31 | Sefar AG, Heiden, Switzerland |
| Growth chamber | CLF Plant Climatics | Percival I-30BLLX | CLF plant Climatics, Wertingen, Germany |
| Paclobutrazol | Sigma-Aldrich | 46046 | Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA |
References
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