Summary
Vi presenterar proceduren att montera ett fröskal sängar analys (SCBA) från Arabidopsis thaliana frön. Den SCBA visade sig vara ett kraftfullt verktyg för att utforska genetiskt och in vitro hur frövitan kontroller frögroning i vilande frön och som ett svar på ljussignaler. Den SCBA är i princip tillämplig enligt alla situationer där det finns misstanke om frövitan att påverka foster-tillväxt.
Abstract
Den Arabidopsis frövita består av ett enda cellager som omger den mogna embryo och spelar en viktig roll för att förhindra groning av vilande frön eller det av nondormant frön bestrålats med ett långt rött (FR) ljuspuls. För att ytterligare få insikt i de molekylära genetiska mekanismer som ligger bakom den grobarhet repressiv verksamhet som utövas av frövita, var en "fröskal strö"-analys (SCBA) utarbetat. SCBA är en dissektion förfarande fysiskt separera fröhöljen och embryon från frön, som tillåter att övervaka tillväxten av embryon på ett underliggande skikt av fröhöljen. Anmärkningsvärt, den SCBA rekonstituerar groningen repressiva verksamhet fröhöljet i samband med frö dvala och FR-beroende kontroll av utsäde grobarhet. Eftersom SCBA tillåter kombi användning av vilande, nondormant och genetiskt modifierade fröskal och embryonala material, de genetiska vägar som kontrollerar groning och specifikt oprande i frövita och embryo kan dissekeras. Här vi detalj proceduren att montera en SCBA.
Introduction
I Arabidopsis mogna frön, är fröskalet består av testa, ett yttre lager av död vävnad från moderdjuret, och frövitan, en enda cell lager av levande vävnad som direkt omger embryot 1. Frövita och embryo kommer från olika gödslingshändelser: frövitan är en triploid vävnad med två mödrar och en faderlig genomet medan embryot är en diploid vävnad med en maternal och en faderlig genomet 2.
Den huvudsakliga funktionen traditionellt tilldelats endospermen är det av en närande vävnad. Dock har det blivit alltmer uppenbart att frövitan spelar också en central roll för att styra frögroning. Detta begrepp blev först uppenbart i fallet med dvala, en egenskap som uppvisas av nyproducerade frön. Vilande frön inte gror trots förekomsten av gynnsamma grobarhet förhållanden. Källor förlorar sin dvala efter en mognadsperiod och blir nondormant, det vill säga de kommer att gro när de utsätts för gynnsamma grobarhet förhållanden. I många växtarter, bland annat modellväxten Arabidopsis, är fröskalet absolut krävs för att förhindra groning av vilande frön eftersom fröskalet borttagning utlöser embryonal tillväxt och grönare 3,4. I Arabidopsis, Bethke et al. Konstaterade att grobarheten varit undertryckt efter att ta bort testa samtidigt som frövita omger frövitan 5. Dessa observationer indikerade starkt att endospermen är den vävnad inom fröskalet utöva en hämmande aktivitet på embryot. Däremot behöver fröskal borttagning experiment inte nödvändigtvis bidra till att klargöra vilken typ av groning undertryckande aktivitet tillhandahållits av fröskalet eller identifiera de gener som implementerar det.
Vi introducerade nyligen ett fröskal sängar analys (SCBA) där fröhöljen och embryon är fysiskt åtskilda men hålls i nära proxistämmelse så att groningen repressiv verksamhet som tillhandahålls av frövitan bibehålls 6. SCBA tillåter kombinato användning av vilande, nondormant, och genetiskt modifierade fröskal och embryonala material. Som ett resultat kan de genetiska vägar som kontrollerar groning och specifikt verksamma i frövitan och embryot dissekerades. SCBA användes i samband med dvala att visa att endospermen frisätter fytohormonerna abskisinsyra (ABA) till embryot för att undertrycka tillväxten 6. Vi kan dessutom använda SCBA att identifiera de signalvägar som är verksamma i frövitan och embryonala vävnader för att främja dvala.
Rollen av frövitan styra groning stärktes ytterligare genom att betrakta det gäller nondormant frön utsätts för en puls med långt rött (FR) ljus. Tidigt på frö uppsugning en FR ljuspuls är kända för att hämma groning 7,8. När fröhöljen togs bort från frön en puls av FR ljuskunde inte hämma groning, starkt tyder på att frövitan även kan undertrycka groning av nondormant fröer 9. Anmärkningsvärt nog kan SCBA också användas för att rekapitulera FR beroende hämning av groning. Detta tillåtet att visa att det FR beroende hämning av frögroning är också en process med ABA frigivning från frövitan 9. Dessutom SCBA tillåtet att identifiera de olika ljus-signalvägar som är verksamma i frövitan och embryot att styra nondormant frögroning som svar på ljussignaler 9,10.
SCBA synes därför vara en tillförlitlig teknik för att undersöka funktionen av endospermen i samband med kontroll av frögroning. Det är också ett kraftfullt verktyg för att bedöma in vitro huruvida gener som misstänks för att kontrollera grobarheten arbeta i frövitan, embryot eller båda vävnader. Här är vi i detalj de olika steg som krävs för att sätta ihop en SCBA.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
När andningsapparaten är monterad, är tillväxten av embryon övervakas under flera dagar. Därför, innan fröet dissekering förfarandet och montering av andningsapparater måste man sterilisera frön för att undvika framtida föroreningar som skulle kunna förhindra korrekt bedömning av effekten av fröskalet material på embryonala tillväxten.
1. Seed Sterilisering
- Häll 50-60 pl av mogna och torra Arabidopsis frön i en 1,5 ml mikrocentrifugrör och förbereda en 70% etanollösning.
- Tillsätt 1 ml 70% etanollösning till mikrocentrifugrör innehållande fröna och skaka vid rumstemperatur i 10 min vid 1200 rpm i en virvelblandare.
- Centrifugera mikrocentrifugrör för 3 sek vid 4000 xg för att koncentrera frön i botten av röret.
- Aspirera etanollösning 70% med användning av en vakuum sugdelen noggrant lämna fröna vid botten av mikrocentrifugrör.
- Tillsätt 1 ml sterilt destillerat vatten till t han mikrocentrifugrör fortfarande innehåller frön.
- Skaka vid rumstemperatur under 10 min vid 1200 rpm.
- Centrifugera mikrocentrifugrör för 3 sek vid 4000 xg för att koncentrera frön i botten av röret. Aspirera vatten supernatanten med användning av en vakuumsug spets noggrant lämna fröna i botten av röret.
- Tillsätt 1 ml sterilt vatten destillerat vatten till mikrocentrifugrör fortfarande innehållande fröna. Se till att flödet av vatten suspenderar homogent fröna inuti röret. Målet här är att undvika ytterligare skaka för att bevara integriteten i fröna.
- Låt fröna slå sig ned genom tyngdkraften på botten av röret genom att lämna röret fortfarande för 30 sek. Aspirera vatten supernatanten med användning av en vakuumsug spets noggrant lämna fröna i botten av röret.
- Upprepa fyra gånger steg från 1,8 till 1,9. Övergripande steriliseringsproceduren tar ca 30 min.
2. Seed Plating
ontent "> är alla efterföljande steg utförs i ett skåp med laminärt flöde för att bevara sterila förhållanden.- Bered en petriskål platta (100 mm diameter, 20 mm höjd), som innehöll 30 ml germinationsmedium ställdes genom autoklavering av en lösning innehållande 4,3 g / L Murashige och Skoog-medium i 2,5 mM 2 - (N-morfolino) etansulfonsyra (MES-KOH , pH 5,7) och 0,8 g / I agar. Låt lösningen svalna i ett 50 ° C vattenbad innan den hälldes på petriskålen plattan.
- Addera 200 ^ il sterilt destillerat vatten till röret innehållande fröna. Omsuspendera frön och överföra dem på ytan av groningen medium med användning av en standard-pipett med en 1 ml dricks.
- Ta bort vattnet som omger fröna på ytan av grobarheten mediet med hjälp av en vakuumsug spets.
- Lämna petriskålen innehållande fröna utan lock inuti skåp med laminärt flöde under 2 timmar för ytterligare torkning. Stäng petriskål med locket och låt den stå under laminäraflöde skåp i cirka 90 minuter så att ca 4 timmar har gått sedan inledningen av utsädessteriliseringsförfarandet (steg 1,2).
3. Seed Dissection
Följande steg kräver att arbeta med ett stereomikroskop placerat inne i dragskåp med laminärt flöde skåp. En Dumont pincett # 5 med trunkerade (dvs. trubbigt) tips avsevärt underlättar hanteringen av frön (Figur 1A).
- Förbered en ny petriskål platta innehållande 30 ml groningsmedium. Placera på ytan av de medel två intilliggande rektangulära sterila Whatman 3MM papper (1,5 cm x 1,0 cm, figur 1B, steg 1). Whatman 3MM papper steriliseras i en autoklav.
- Överför frön på Whatman 3MM papper med hjälp av steril pincett (Figur 1B, steg 2).
- Håll ett enskilt frö mot Whatman 3MM papper genom att försiktigt trycka fröet med hjälp av de intill varandra trubbiga tips av de trunkerade pincett (
- Skär fröskalet (testa och frövitan) av utsädet med hjälp av en spruta nål (t.ex. U100 insulinspruta + 1 ml spruta, 0,33 mm (29 G) x 12,7 mm) (Figur 1B, steg 4). Formen hos Arabidopsis frö är ellipsoid och det rekommenderas att skära fröskalet längs de längsta halvhuvudaxel och så nära som möjligt till den plats där hjärtbladen är förbundna med rotanlaget (det vill säga bort från det radikala tips). Detta bidrar till en säker frigöring av embryot i nästa steg av dissekeringsförfarandet.
- Push utsädet mot Whatman 3MM-papper med användning av de intill varandra belägna trubbiga spetsar stympade pincett (Figur 1B, steg 5). Detta steg frigör det embryo ut fröskalet genom öppningen skapade i steg 3,4 (Figur 1B, steg 6). Det rekommenderas att applicera ett tryck på fröet där spetsen av hjärtbladen är i närmast spetsen av rotanlaget (det vill säga bort frOM öppningen).
4. Montering av Seed Coat Bedding Assay (SCBA)
Se diskussionen för lämpligt val av antalet fröhöljen och embryon.
- Förbered en ny petriskål platta innehållande 30 ml groningsmedium. Placera på mediets yta en steril rektangulär bit (3,5 cm x 5,0 cm) av nylon mesh (Figur 2, steg 1).
- För att undvika skador, kan embryon och fröhöljen förflyttas till ytan av de metalliska kanterna av tången genom att försiktigt trycka dem med hjälp av sprutans nål (Figur 2, steg 2). Överför embryon och fröhöljen på nylonnät (figur 2, steg 3).
- Sätt ihop en cirkulär och enkelt skikt av fröhöljen med användning av de trubbiga pincett och nålen och se till att frön rockar är i så mycket närmare varandra som möjligt (figur 2, steg 4). Försök för att exponera så mycket som möjligt fröskalet öppning alstras avnål uppåt. Detta steg har inte testats systematiskt. Men det kan öka effektiviteten i SCBA sedan diffunderbara substanser som hämmar tillväxten av embryot förväntas direkt diffundera ut mot embryot istället ifrån det.
- Placera embryon som en cirkulär enda skikt på mitten av fröskalet sängen monterad i steg 4,3 (Figur 2, steg 5). Säkerställ att embryona är i så mycket närmare varandra som möjligt.
- Inkubera SCBAs enligt kontinuerligt ljus (40 mikromol / m 2 s ec) vid 20-21 ° C. I det fall då en FR-puls används för att stoppa groning, montera SCBA i vanligt ljus, applicera FR puls såsom beskrivits 9 och lämnar petriskål i mörker.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Tidigare arbete visade att muterade frön som inte kan syntetisera GA kunde gro till följd av hög ABA ansamling i utsäde 11,12. Men oförmågan att gro kräver fröhöljet sedan dess avlägsnande triggar embryonala tillväxt 13. Detta indikerade starkt att frövitan av frön som inte kan syntetisera GA släpper ABA att blockera embryonal tillväxt. Vi förväntar oss därför frön rockar inte kan syntetisera GA för att blockera tillväxten av embryona i en SCBA skillnad fröhöljen oförmögna att syntetisera GA och ABA. Här använder vi GA1-21 (Salk ingslinje Salk_109115) muterade frön bär en T-DNA inser störa GA1 genen (anslutningen AT4G02780) kodning ent-copalyl difosfat syntas, som är nödvändigt för GA biosyntes 14 (SALK_109115 ingslinje i GA1 (Col ekotyp) refereras i SALK signaldatabasen 15 ( http://signal.salk. Edu /).
I överensstämmelse med tidigare resultat 13 kunde GA1-21 muterade frön inte gror 80 timmar efter frö uppsugning (figur 3, panel 1). I kontrast och ytterligare i linje med tidigare resultat 13, utlöste fröskal borttagning GA1-21 embryo tillväxt (figur 3, panel 2) om inte ABA var närvarande i mediet (figur 3, panel 3).
Panel 4 i figur 3 togs 80 timmar efter frö uppsugning och visar en andningsapparat med GA1-21 embryon på en bädd av 80 GA1-21 fröhöljen. I linje med vår hypotes, GA1-21 mutant fröhöljen blockerade tillväxten av GA1-21 embryon.
Tidigare arbete har visat att i vilande frön fröskalet syntetiserar och frigör ABA mot embryot som en följd av konstitutivt uttryck av GA-respons DELLA faktor RGL2 vilken befrämjar ABA ackumulering i imbibedfrön 6,11. Under förhållanden där GA-syntes är blockerad konstitutivt ackumulerar DELLA faktorn RGL2 och främjar ABA ackumulering 11. Frånvaro av RGL2 och ABA-syntes i GA1-21 fröhöljen förväntas därför att medge tillväxt av GA1-21 embryon i en SCBA. För att testa denna hypotes använde vi aba2-en mutant allel (Col ekotyp), bristfälliga i ABA-syntes som en följd av en punktmutation i genen som kodar för Xanthosin dehydrogenas (AT1G52340) och rgl2-14 T-DNA-införingslinjen (Salk_027654, Col ekotyp) 16.
Figur 1. Förfarande för utsädes dissekering. A) Diagram som beskriver hur man gör trunkerade pincett för utsädes dissekering. Tång kan trunkeras med hjälp av sax eller tång. När tången stängs den intilliggande stympade tips shou. ld locket en yta ungefär lika stor som ett frö B) Steg 1: två sida vid sida rektangulära sterila Whatman 3MM papper läggs på en petriskål platta innehållande MS fast medium. Steg 2: frön överförs på ytan av Whatman-papper 4 h efter uppsugning. Steg 3: dissektion procedur kräver håller utsädet mot Whatman-papper med användning av de trunkerade pincett. Steg 4: En spruta nål används för att skära av fröskal som visas. Steg 5 och 6: De intill varandra tips för slutna pincett används för att försiktigt trycka embryot ur fröskalet genom webbplatsen på snittet.
Figur 2. . Förfarande för montering av fröskalet strö analys Steg 1: Ett rektangulärt stycke av nylonnät läggs på en petriskål platta innehållande MS fast medium. Steg 2 och 3: dissekerade embryon och fröhöljen är försiktigtförflyttas till kanterna av tången använda sprutnål före överföring dem på nylonnät. Steg 4 och 5: Montera ett cirkulärt och enkelt skikt av fröhöljen och kassera embryon som en cirkulär enda skikt på mitten av den monterade fröskal säng.
Figur 3. Representativa resultat med frömaterial inte kan syntetisera GA. Fröskal säng analyser med hjälp fröhöljen och embryon dissekerade från GA1 (GA1-21) muterade frön, oförmögen att syntetisera GA. Paneler visar växtmaterial såsom beskrivs i figuren 80 timmar efter utsäde uppsugning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Fröskalet sängar analys (SCBA) procedur som beskrivs här är i princip varje omständighet där Arabidopsis frögroning är blockerad (eller fördröjd) och när det finns misstanke frövitan att genomföra denna gripande. Det senare kan bevisas genom att ta bort fröskalet (testa och frövitan) och observera att embryonala tillväxtskrider snabbare i förhållande till vad som ses när embryona är omgivna av fröskalet. Groning kan blockeras som reaktion på särskilda miljö fysiska parametrar (t.ex. vatten potentiella eller ljuskvalitet) eller i specifika genetiska bakgrunder (t.ex. avsaknad av GA-syntes som i GA1 mutanter, se figur 3).
Det finns inga generella regler om antalet fröhöljen och embryon som skall användas för en SCBA. Detta beror på fröet satsen (och i synnerhet dess färskhet) och den typ av experiment som skall utföras. Det är därför kritiskt för justert mängden dissekerades material för varje enskilt fall genom att övervaka tillväxt på embryona på sängen av fröhöljen på en daglig basis. Emellertid vanligtvis några fröhöljen är nödvändiga när starkt vilande Arabidopsis-ekotyper användes. Nedan visas typiska mängder utsäde rockar och embryon som användes med framgång vid montering SCBAs:
SCBA med vilande frömaterial 6:
* Nytt skördade (dvs. vilande) Kap Verde Island ekotyp (CVI): Använd 10 embryon och 20 fröhöljen.
* Nytt skördade Landsberg (Ler) frön: Använd 10 embryon och 80 fröhöljen.
SCBA i frånvaro av gibberellin (GA) biosyntes (Figur 3):
* Frön GA1 muterade (Columbia - Col - ekotypen): Använd 10 embryon och 80 frö rockar.
* vildtyp Col frön med 10 ^ M paklobutrazol (en hämmare av GA biosyntes) i groningsmedium: Använd 10 embryos och 100 fröhöljen. Lägg Paclobutrazol när mediet kyls ner till 50 ° C innan den hälldes i petriskålen.
SCBA efter en puls långt rött (FR) ljus 9:
* Använd 12 embryon och 100 fröhöljen.
Den enda begränsningen av SCBA teknik är att den kräver tålamod och skicklighet för att snabbt montera dissekerade frömaterial medan inte döda embryon. En erfaren forskare kan dissekera 100 frön inom 20-30 min. Dock kan mindre erfarna användare behöver 1 timme och förväntar embryonala skador. Såvitt vi vet finns det än så länge inga alternativa tekniker för att utforska rollen av frövitan för kontroll av utsäde grobarhet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar att de inte har några konkurrerande ekonomiska intressen.
Acknowledgments
Detta arbete har finansierats med bidrag från den schweiziska National Science Foundation och av staten i Genève.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Thermomixer Comfort | Eppendorf AG | 5355 000.011 | Eppendorf AG, Hamburg, Germany |
| Vacusafe Comfort | INTEGRA Biosciences AG | 158 310 | Integra Biosciences AG, Zizers, Switzerland |
| Petri dish plate (100 mm x 20 mm) | Greiner Bio-One GmbH | 664 102 | Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany |
| Murashige and Skoog | Sigma-Aldrich | M5524 | Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA |
| MES | Sigma-Aldrich | M3671 | Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA |
| Agar (plant agar) | Duchefa Biochemie B.V. | P1001 | Duchefa Biochemie, Haarlem, Netherlands |
| Dumont forceps #5 | Fine Science Tools GmbH | 11251-10 | Fine Science Tools GmbH, Heidelberg Germany |
| Syringe needle | BD Micro-Fine | 324827 | BD, Franklin Lakes, NJ USA |
| Nylon mesh (SEFAR NYTEX) | SEFAR AG | 03-50/31 | Sefar AG, Heiden, Switzerland |
| Growth chamber | CLF Plant Climatics | Percival I-30BLLX | CLF plant Climatics, Wertingen, Germany |
| Paclobutrazol | Sigma-Aldrich | 46046 | Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA |
References
- Debeaujon, I., Leon-Kloosterziel, K. M., Koornneef, M. Influence of the testa on seed dormancy, germination, and longevity in Arabidopsis. Plant Physiol. 122, 403-414 (2000).
- Baroux, C., Spillane, C., Grossniklaus, U. Evolutionary origins of the endosperm in flowering plants. Genome Biol. 3, reviews1026 (2002).
- Debeaujon, I., Lepiniec, L., Pourcel, L., Routaboul, J. -M. Seed development, dormancy and germination. , Blackwell Publishing. 25-43 (2007).
- Finch-Savage, W. E., Leubner-Metzger, G. Seed dormancy and the control of germination. New Phytol. 171, 501-523 (2006).
- Bethke, P. C., et al. The Arabidopsis aleurone layer responds to nitric oxide, gibberellin, and abscisic acid and is sufficient and necessary for seed dormancy. Plant Physiol. 143, 1173-1188 (2007).
- Lee, K. P., Piskurewicz, U., Tureckova, V., Strnad, M., Lopez-Molina, L. A seed coat bedding assay shows that RGL2-dependent release of abscisic acid by the endosperm controls embryo growth in Arabidopsis dormant seeds. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 19108-19113 (2010).
- Reed, J. W., Nagatani, A., Elich, T. D., Fagan, M., Chory, J. Phytochrome A and Phytochrome B Have Overlapping but Distinct Functions in Arabidopsis Development. Plant Physiol. 104, 1139-1149 (1994).
- Shinomura, T., et al. Action spectra for phytochrome A- and B-specific photoinduction of seed germination in Arabidopsis thaliana. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93, 8129-8133 (1996).
- Lee, K. P., et al. Spatially and genetically distinct control of seed germination by phytochromes A and B. Genes Dev. 26, 1984-1996 (2012).
- Lee, K. P., Lopez-Molina, L. Control of seed germination in the shade. Cell Cycle. 11, 4489-4490 (2012).
- Piskurewicz, U., et al. The gibberellic acid signaling repressor RGL2 inhibits Arabidopsis seed germination by stimulating abscisic acid synthesis and ABI5 activity. Plant Cell. 20, 2729-2745 (2008).
- Piskurewicz, U., Tureckova, V., Lacombe, E., Lopez-Molina, L. Far-red light inhibits germination through DELLA-dependent stimulation of ABA synthesis and ABI3 activity. EMBO J. 28, 2259-2271 (2009).
- Debeaujon, I., Koornneef, M. Gibberellin requirement for Arabidopsis seed germination is determined both by testa characteristics and embryonic abscisic acid. Plant Physiol. 122, 415-424 (2000).
- Sun, T. P., Kamiya, Y. The Arabidopsis GA1 locus encodes the cyclase ent-kaurene synthetase A of gibberellin biosynthesis. Plant Cell. 6, 1509-1518 (1994).
- Alonso, J. M., et al. Genome-wide insertional mutagenesis of Arabidopsis thaliana. Science. 301, 653-657 (2003).
- Rook, F., et al. Impaired sucrose-induction mutants reveal the modulation of sugar-induced starch biosynthetic gene expression by abscisic acid signalling. Plant J. 26, 421-433 (2001).
