Summary
Realizando experimentos de cultura celular para investigar a adesão bacteriana e invasão em condições aeróbias é geralmente representativa do
Abstract
As interacções dos agentes patogénicos bacterianos com células hospedeiras têm sido investigados extensivamente usando métodos de cultura de células in vitro. No entanto, como estes ensaios de cultura de células são realizadas em condições aeróbias, estes modelos in vitro não pode representar exactamente o ambiente in vivo nas quais as interacções hospedeiro-agente patogénico a ter lugar. Nós desenvolvemos um modelo in vitro de infecção que permite a co-cultura de bactérias e células hospedeiras diferentes meios e sob condições de gás. A Câmara de difusão vertical (VDC) modelo imita as condições do intestino humano, onde as bactérias estarão em condições de muito baixo do tecido, enquanto o oxigênio será fornecido com o oxigênio do sangue. Colocação de células (IEC) monocamadas epiteliais intestinais polarizadas crescidas em Snapwell insere um VCC cria compartimentos separados apical e basolateral. O compartimento basolateral é preenchido com meio de cultura de células, selado e perfundido com oxigénio wHilst o compartimento apical é enchido com caldo, mantida aberta e incubados sob condições microaeróbias. Tanto as células Caco-2 e T84 IECs pode ser mantida na VCC sob estas condições sem quaisquer efeitos nocivos aparentes na sobrevivência celular ou a integridade monocamada. Coculturing experimentos realizados com diferentes C. as estirpes de tipo selvagem jejuni e diferentes linhas IEC no modelo VCC com condições microaeróbias no compartimento apical reprodutivelmente resultar num aumento do número de interagir (quase 10 vezes) e bactérias intracelulares (quase 100 vezes) em comparação com as condições de cultura aeróbias 1. O ambiente criado no modelo VCC imita mais de perto o ambiente encontrado por C. jejuni no intestino humano e destaca a importância da realização de ensaios de infecção in vitro em condições que mais de perto imitar a realidade em vivo. Propomos que o uso do modelo VDC permite novas interpretações das interações apostarween agentes patogénicos bacterianos e as células hospedeiras.
Introduction
As interacções dos agentes patogénicos bacterianos com células hospedeiras têm sido investigados extensivamente usando métodos de cultura de células in vitro. Usando estes ensaios de cultura celular, a adesão bacteriana a células hospedeiras, a identificação de receptores de células hospedeiras, células do hospedeiro vias de sinalização e invasão bacteriana de células hospedeiras têm sido estudadas em pormenor, resultando em muitas observações importantes. No entanto, tais ensaios de cultura de células são realizadas em condições aeróbias, que podem não ser representativas do ambiente in vivo. Uma grande limitação de modelos in vitro utilizados para estudar as infecções gastrointestinais é que as condições de cultura, incluindo níveis elevados de oxigénio, geralmente favorece a sobrevivência de células eucarióticas. No entanto as condições no lúmen intestinal será quase anaeróbias. Patógenos entéricos em um ambiente muito baixa de oxigênio expressar genes de virulência cuja expressão mudanças em condições aeróbias 2. Como tal, os dados obtidos usando o padrão de cultura de células modelos may dar uma indicação imprecisa de interações bacterianas com células hospedeiras.
Campylobacter jejuni é o principal agente causador de gastroenterite aguda bacteriana em todo o mundo, com sintomas que vão desde diarréia leve a enterite inflamatória grave. A maioria dos C. jejuni infecções resultam em gastroenterite simples, no entanto C. jejuni é também o agente infeccioso mais comumente identificados em neuropatias periféricas, incluindo a síndrome de Guillain-Barré (GBS). No Reino Unido, estima-se que existem mais de 500000 casos de enterite causadas por C. jejuni infecção a cada ano, com um custo previsto para a economia do Reino Unido de £ 580 milhões. No mundo em desenvolvimento, C. jejuni é a principal causa de mortalidade entre as crianças. Apesar da importância inquestionável da infecção por Campylobacter e décadas de pesquisa, incluindo a análise baseada em genômica completa, C. jejuni patogênese ainda é mal understood, em contraste com outros agentes patogénicos entéricos, tais como Salmonella, Escherichia coli, Shigella, e Vibrio cholerae. A falta de um modelo animal de pequeno conveniente é uma das principais razões para esta 3. Também a amplamente utilizados em modelos in vitro de infecção são mais apropriado para estudar microaerofílica C. jejuni, do que para outros agentes patogénicos entéricos que são anaeróbios facultativos. Enquanto C. jejuni é reconhecido como um agente patogénico invasor, os mecanismos de C. jejuni invasão das células epiteliais intestinais (IECs) ainda não são claras 4,5. C. invasão jejuni demonstrou ser dependente quer microfilamentos, os microtúbulos, uma combinação de ambos, nem 5. A confusão nesta área é mais provavelmente devido ao uso de inadequado em condições de ensaio in vitro.
Um número de diferentes ensaios de cultura de células foram utilizadas para investigar as interacções de C. jejunicom as células hospedeiras. Caco-2, 6, 7 INT 407, T84 e 8 linhas de células têm sido usados para estudar as capacidades de adesão e invasão de diferente C. jejuni. No entanto, os níveis de adesão bacteriana e invasão por C. jejuni com IECs são drasticamente mais baixos do que para outros patógenos entéricos 9. O coculturing de C. jejuni com IECs é normalmente realizado em uma incubadora de CO 2 sob condições próximas a níveis de oxigénio atmosférico, necessária para a sobrevivência das IECs. C. expressão gênica jejuni será muito diferente no ambiente de baixo oxigênio do lúmen intestinal em relação às condições atmosféricas de oxigênio.
A utilização de um sistema de câmara de difusão vertical (VCC), foi desenvolvido o qual permite a co-cultura de bactérias e células hospedeiras diferentes meios e sob condições de gás 1,10,11. Este sistema mimetiza as condições presentes no intestino humano, onde as bactérias irão ser under condições de muito baixa tecido, enquanto o oxigênio será fornecido com o oxigênio da corrente sanguínea. As monocamadas de IEC polarizadas crescidas em filtros especiais 0,4 mM foram colocados num VCC criar um compartimento apical e basolateral, que foram preenchidos individualmente com caldo bacteriano e meio de cultura de células, respectivamente (Figura 1). O VDC foi colocado na atmosfera variável incubadora contendo 85% de N 2, 5% de O2, e 10% de CO 2, a 37 ° C, o que representa condições óptimas para C. jejuni. O compartimento apical foi deixada em aberto e exposto à atmosfera microaeróbia dentro da atmosfera variável incubadora, enquanto que o compartimento basolateral selado foi fornecido com oxigénio por administração constante de 5% de CO 2 / S mistura gasosa de 95% 2, com um tubo de saída da prevenção da acumulação de pressão . Caco-2, a sobrevivência das células e integridade monocamada sob estas condições foram confirmadas através da monitorização do elemento transepitelialresistência ctrical (TEER) através da monocamada durante 24 h, para demonstrar a separação de sobrevivência de células Caco-2 em monocamada de células e física dos compartimentos apical e basolateral sob baixas condições de oxigénio no compartimento apical. O TEER de monocamadas em VDCs mantidos na incubadora de atmosfera variável (condições microaeróbias) e um padrão de cultura de células incubadora de CO 2 (condições aeróbias) não apresentaram diferenças significativas, indicando integridade da monocamada de células em diferentes condições atmosféricas 1. Sob condições microaeróbicas, junções apertadas permaneceu presente e uniformemente distribuída entre as bordas das células, com um padrão de coloração occludin semelhantes às células mantidas sob condições aeróbicas 1.
As interações de C. jejuni com células Caco-2 e T84 células na VCC foram investigados avaliando interacção bacteriana (adesão e invasão) e invasão. Dois C. diferente jejuni tipo selvagem strains foram usados 1. C. jejuni 11168H hypermotile é um derivado da estirpe NCTC11168 sequência original. A tensão 11168H mostra níveis muito mais elevados de colonização em um modelo de colonização garota e, assim, é considerada uma cepa adequada de usar para estudos de interação patógeno-hospedeiro. 81-176 é isolar um ser humano e é uma das estirpes laboratoriais amplamente estudados mais invasivos. C. jejuni foram adicionados ao compartimento apical de uma VCC, quer sob condições microaeróbias ou aeróbico. Observou-se taxas mais elevadas para a interação e invasão foram registradas para C. jejuni em condições microaeróbicas 1. O aumento C. jejuni interacções não eram devidas a um aumento no número de bactérias em condições microaeróbias 1. Estes dados apoiam a hipótese de que o ambiente de baixo teor de oxigénio no compartimento apical do VDC aumenta as interacções de bactérias hospedeiras, e indica que as propriedades invasivas de C. jejuni são incraliviou sob estas condições. Este foi o primeiro relato da utilização do modelo de VCC a estudar um agente patogénico bacteriano invasiva e realça a importância de efectuar ensaios de infecção in vitro sob condições que imitar mais de perto a situação in vivo. O VDC modelo pode ser usado para estudar as interacções hospedeiro-agente patogénico para muitas espécies de bactérias diferentes.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Crescimento do IEC Monolayers em especial Filtros 0,4 mM
- Culturas células Caco-2 em meio essencial modificado por Dulbecco (DMEM) suplementado com 10% de soro (v / v) de vitela fetal, 100 U / ml de penicilina, 100 ug / ml de estreptomicina e 1% (v / v) de aminoácidos não essenciais em um cultura de tecido padrão incubadora a 37 ° C em 5% de CO 2 e 95% de ar. Semente de 4 x 10 5 células Caco-2 IECs por 0,4 um filtro de polarização e crescer para mais de 21 dias, passando os meios de comunicação a cada 2-3 dias.
- Medir a TEER para confirmar o estado de polarização da monocamada utilizando um medidor de resistência de volt-ohm. Nos nossos estudos, o TEER de 21 dias as células Caco-2 cultivadas nesses filtros 0,4 mM é Ωcm 700-800 2.
2. Preparação de C. jejuni e Médio bacteriana para o Ensaio Coculturing
- 24 horas antes do ponto desejado do ensaio coculturing VDC partida, preparar um prato fresco agar sangue de C. jejuni e incubar a 37 ° C sob condições microaeróbias (85% de N 2, 5% de O2, e 10% de CO2) na atmosfera variável incubadora.
- Ao mesmo tempo, pré-incubar 30 ml de caldo de brucela a 37 ° C sob condições microaeróbias numa incubadora de atmosfera variável.
3. Preparação e esterilização do meio Chambers VDC Antes do Ensaio
- Mergulhe completamente câmaras VDC meia, assim como os anéis e as fichas na solução de esterilização.
- Usando um estéril seringa de 20 ml, lavar a solução de esterilização através das entradas de gás em ambas as câmaras meia. Não fazer isso pode resultar em contaminação das amostras durante coculturing.
- Deixar os componentes imersos na solução de esterilização durante> 1 h.
- Lave todos os componentes com água estéril fresco, usando outra seringa de 20 ml estéril para lavar as entradas de gás.
4. Preparaçãodo inoculo bacteriano
- Colher metade de um prato de C. jejuni crescimento da placa de agar de sangue preparado no dia anterior em 1 ml de caldo de Brucella-incubadas. Isto deverá dar ~ 10 10 ufc / mL.
- Determinar a densidade óptica da suspensão bacteriana a 600 nm para semiquantify unidades formadoras de colónias bacterianas (UFCs).
- Ajuste a suspensão bacteriana para o nível desejado de inoculo em 4 ml do caldo de Brucella-incubadas.
- Efectuar uma diluição em série a partir desta suspensão bacteriana definitivo seguido por plaqueamento das diluições apropriadas em placas de agar de sangue, em triplicado, em seguida, incubado a 37 ° C na atmosfera variável incubadora durante 48 horas para quantificar o número de CFUs bacterianas presentes no inoculo.
5. Configurando o VDC
- Coloque a metade inferior de uma câmara VDC plano para o banco. Montar um O-ring para a metade inferior da câmara.
- Retire um filtro que transportam os IECs de tele transportador e lavar três vezes com 400 ul de PBS estéril. Coloque o filtro na metade câmara baixa, certificando-se o anel continua em vigor.
- Delicadamente abaixar a metade câmara superior no lugar. Uma vez que as duas meias-câmaras são montados, apertar em conjunto, utilizando as braçadeiras de anel. Coloque a VCC horizontalmente no topo da bancada, com as duas aberturas voltadas para cima.
- Adicionar 4 ml de inoculo bacteriano na metade câmara apical.
- Adicionar 4 ml de meio de cultura celular para a metade câmara basolateral.
- Coloque as peças finais nas aberturas de ambas as câmaras meia.
6. Colocar a VDC para o Manifold gás dentro da variável Atmosfera Incubadora
- Coloque a VCC na atmosfera variável incubadora em estreita proximidade com o colector de gás.
- Abra o regulador de alimentação de gás ligados ao colector de gás. Ligar o tubo a partir do colector para dentro da entrada de gás na câmara de metade basolateral da VCC. Prenda a gas saída do tubo que conduz para fora da atmosfera variável incubadora para uma das saídas no final peça na metade câmara basolateral.
- Feche o outro na saída da peça de extremidade na metade câmara basolateral. Abra o fluxo de gás no coletor de gás, tendo o cuidado para abri-lo muito lentamente para evitar o excesso de pressão do gás, pois isso pode levar à expulsão do meio basolateral.
- O objetivo é um fluxo de 1 bolha a cada 2-5 segundos gás. Verifique periodicamente no fluxo de gás durante o curso do experimento e ajustar se necessário.
7. Desmontagem do VDC após Coculture
- Após o período de co-cultura apropriado, feche o regulador de gás ligado ao colector de gás. Feche o fluxo de gás para o VDC no coletor. Desligar a entrada do gás, a saída do gás, e a rolha do VCC.
- Remover o VCC de uma incubadora de atmosfera variável. Remover o sobrenadante e armazenar apical e basolateral a -80 ° C para subsequenanálise t.
- Remova os grampos anel e tomar cuidado para além do VCC. Retire o filtro a partir da metade da câmara e transferir para um 6-bem placa de cultura de células estéreis. Lavar as IECs três vezes com 400 ul de PBS estéril.
- Por contagem do número total de bactérias que interagem, adicionar 400 ul de PBS estéril que continha 0,1% (v / v) de Triton X-100 para as IECs e incubar durante 20 min à temperatura ambiente para lisar o IEC. Efectuar uma diluição em série a partir desta ligado celular, seguido por plaqueamento das diluições apropriadas em placas de agar de sangue, em triplicado, em seguida, incubado a 37 ° C na atmosfera variável incubadora durante 48 horas para quantificar o número de interagir CFUs bacterianas.
- Por contagem do número total de bactérias invasoras, adicionar 400 mL de meio de cultura celular DMEM contendo 150 ug / ml de gentamicina às IECs e incubar durante 2 horas numa incubadora de cultura de tecido padrão, a 37 ° C em 5% de CO 2 e 95% ar para matar as bactérias extracelulares,siga como para a etapa 7.4 acima.
8. Limpando o VDC após Coculture
Lave o VDC com água estéril e loja para a próxima rodada de experimentos.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Coculturing experimentos realizados com um C. jejuni estirpe de tipo selvagem e IECs no modelo VCC com condições microaeróbias no compartimento apical demonstraram um aumento no número de interagir (quase 10 vezes) e bactérias intracelulares (quase 100 vezes) em comparação com as condições de cultura aeróbias em um tempo maneira dependente da 1. Esta observação foi reprodutível usando duas C. diferente jejuni do tipo selvagem (11168H e 81-176) e duas linhas IEC diferentes (Caco-2 e T84), com destaque para a validade do modelo VDC 1.
Os resultados aqui apresentados são representativos de uma comparação entre o número de C. jejuni interagindo com ou invadir células Caco-2, após 3, 6 ou 24 horas de co-cultura, quer sob condições de ensaio de cultura de células padrão em incubador de CO2 (Figuras 2A e B) ou no modelo VCC com condições microaeróbias na com apicalcompartimento (Figuras 2C e D). Os dados para duas C. diferente são apresentados estirpes de tipo selvagem (11168H jejuni e 81-176). Sob as condições de cultura celular padrão utilizados na maioria dos estudos na literatura científica, <10 7 ufc foram observadas interagir com células Caco-2 (Figura 2A), em comparação com ~ 10 8 ufc observada interacção com células Caco-2 no VCC modelo (Figura 2C), após 24 horas. Após a co-cultura no modelo VCC, ~ 10 7 ufc intracelular foram isolados a partir de células Caco-2 (Figura 2D), em comparação com apenas ~ 10 5 ufc intracelular isolado a partir de células Caco-2 (Figura 2B), após co-cultura de células sob condições de cultura padrão para 24 hr.
Uma comparação directa entre o número de C. jejuni interagindo com ou invadir IECs após co-cultura no modelo VDC com qualquer microaeróbico ou condição aeróbicações no compartimento apical tem sido realizada previamente 1. Utilização dos resultados do modelo VDC no aumento interagindo C. jejuni de quase 10 vezes maior e um aumento intracelular C. jejuni de quase 100 vezes após 24 horas de co-cultura 1.
Figura 1. Esquemático da câmara de difusão vertical (VCC), células epiteliais intestinais de modelo. (IECs) são cultivadas em suportes permeáveis 0,4 mM de filtro e inserido num VCC, criando assim um compartimento apical e basolateral. Esses compartimentos podem então ser ajustadas individualmente no que diz respeito à forma e à composição do gás para permitir o coculturing dos IECs com C. jejuni, com condições microaeróbias na superfície apical dos IECs e condições aeróbias na superfície basolateral da IECs.
Figura 2. Os resultados representativos comparando os números de C. 11168H jejuni 81-176 ou estirpes do tipo selvagem, que interagem com (A e C) ou invadir (B e D) de células Caco-2 após 3, 6 ou 24 horas, quando o ensaio de co-cultura foi realizada, quer sob condições de cultura de células padrão num CO 2 incubadora (A e B) ou no modelo VDC com condições microaeróbicas no compartimento apical (C e D). Todos os experimentos representam, no mínimo, três repetições biológicas realizadas em duplicado em cada experimento. Clique aqui para ver a figura maior .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
A utilização de métodos de cultura de células in vitro para estudar as interacções dos agentes patogénicos bacterianos com células hospedeiras é uma técnica amplamente utilizada em muitos laboratórios de investigação. No entanto, como estes ensaios de cultura de células são realizadas em condições aeróbias, estes modelos in vitro não pode representar exactamente o ambiente in vivo nas quais as interacções hospedeiro-agente patogénico a ter lugar. A amplamente utilizada em modelos de infecção in vitro são particularmente inadequados para estudar microaerofílica C. jejuni, em comparação com outros agentes patogénicos entéricos que são anaeróbios facultativos. Há uma considerável confusão na literatura sobre os mecanismos de invasão de IECs humanos por C. jejuni 4,5. Sugerimos que a razão pela qual os mecanismos de invasão são tão mal compreendido é porque os modelos in vitro utilizados nestes estudos não refletem exatamente a situação in vivo. Usando ensaios de cultura de células normais, o nívelde C. invasão jejuni de IECs é sempre muito baixo 9. O desenvolvimento do modelo VDC foi a nossa resposta para resolver este problema.
Nós estabelecemos que duas linhas IEC diferentes podem ser mantidas na VCC com condições microaeróbias na superfície apical, sem quaisquer efeitos desvantajosos observados durante um período de 1 h 24. Um aumento tempo-dependente dos números de ambos interagindo e intracelular C. 11168H jejuni estirpe de bactérias de tipo selvagem foi observado após coculturing com células Caco-2 IECs do VDC com condições microaeróbias no compartimento apical 1. Estas observações foram confirmadas utilizando ainda uma segunda linha de IEC (T84), bem como uma segunda C. jejuni cepa do tipo selvagem (81-176), indicando que não há linha celular ou estirpe efeitos específicos de bactérias 1. Estes níveis aumentados de interacção e invasão bacteriana resultou no aumento da resposta imune inata polarizada, a partir do IECs 1. Higos níveis de IL-8 foram detectados após coculturing microaeróbia, indicando que o aumento do desafio bacteriano é acompanhada por um aumento da resposta do hospedeiro. Os níveis mais elevados de IL-8 foram detectadas nos sobrenadantes basolateral em comparação com os sobrenadantes apicais, indicando que a secreção de IL-8 pelas IECs ocorre predominantemente a partir da superfície basolateral IEC. A IL-8 é um atrativo como neutrófilos, que seria de uso limitado no lúmen intestinal. Estes dados demonstram que a configuração de dois compartimentos do VDC permite também a identificação eficiente de uma resposta do hospedeiro polarizada.
Várias características relativas ao lado do modelo VCC / custos técnicos devem ser consideradas antes de se aplicar o modelo para o estudo de qualquer organismo patogénico. Em primeiro lugar, as IECs devem ser cultivadas para formar uma monocamada impermeável em 0,4 mM filtros especiais. Isso leva entre 14-21 dias, dependendo da linha celular utilizada e faz com que as experiências relativamente longas em comparação com clássica cocultuanel experiências realizadas em placas de cultura de células e usando IECs cultivadas para entre 1-7 dias. Por outro lado, só depois de um longo período de crescimento foram as IECs sido demonstrada para formar uma monocamada totalmente polarizado. Tais monocamadas polarizadas mimetizar a situação in vivo no epitélio intestinal humano muito mais estreita do que as nonpolarized, não confluentes linhas IEC utilizados em alguns estudos e, como tal, proporcionam uma outra vantagem do modelo de VCC. Em segundo lugar, os filtros especiais 0,4 m são significativamente mais caros do que uma placa de cultura celular de 24 poços padrão. A principal limitação do VDC é relativamente baixo rendimento. Isto é principalmente devido à disponibilidade de VDC câmaras ea instalação exigir que o distribuidor de gás. Só um número relativamente baixo de repetições paralelas pode ser realizada de uma só vez, em contraste com o método clássico de cultura de células. O modelo VCC é, portanto, menos adequados para experiências de rastreio em larga escala ou experiências que requerem um elevado número de réplicastes. Outro factor a considerar é que o efeito da gravidade de realizar ensaios de co-cultura no modelo VCC significa que as bactérias mais tempo começará a agregada na parte inferior do compartimento apical resultando em reduzida oportunidade para interacções com a monocamada de IEC. No entanto, utilizando o modelo VDC, temos mostrado que as interações de um nonmotile, nonaggregating 11168H rpoN mutante são drasticamente reduzidos em relação à móveis, agregando 11168H estirpe selvagem após 6 horas 1. Estamos atualmente trabalhando em modificações no modelo VDC que permitiria alguma mistura no compartimento apical que mais de perto imitar o peristaltismo no lúmen intestinal. Por conseguinte, embora o modelo VCC é melhor do que os métodos de cultura de células, aeróbias clássicos devido a imitar mais de perto a situação in vivo, especialmente para bactérias tais como C. jejuni que têm uma atmosféricas rigorosas exigências, o modelo VCC ainda apresenta certas limitações que têm de ser tomadasem consideração ao projetar experimentos.
Nossos dados suporta os resultados relatados por um modelo VCC semelhante usado para estudar o agente patogénico humano gástrica Helicobacter pylori, que mostraram um aumento da aderência das bactérias às células hospedeiras, o aumento da síntese de factores de virulência bacteriana, bem como um aumento do hospedeiro quando a resposta imune inata H. pylori foi co-cultivados com células epiteliais, em comparação com microaeróbia sob condições aeróbicas 11. Como ambos H. pylori e C. jejuni requerem condições microaeróbicas para o crescimento, a constatação de que as condições microaeróbicas promover a interação dos organismos com células hospedeiras é surpreendente. No entanto, outro estudo utilizando um sistema VDC para analisar as interações entre os anaeróbios facultativos Escherichia coli entero com IECs demonstrado aumento dos níveis de interação de bactérias em condições anaeróbicas cocultura / microaeróbico no compartimento apical VDC 10. Tindica que o seu comportamento de bactérias que são capazes de proliferar sob condições atmosféricas de oxigénio também é alterada quando co-cultivadas com IECs sob condições anaeróbicas / microaeróbia. Isto sugere que o modelo VCC é um modelo melhorado e valioso para a análise das interacções hospedeiro-agente patogénico de muitas bactérias patogénicas diferentes sob condições que se assemelham mais fielmente a situação in vivo no lúmen intestinal humana.
Do ponto de vista do modelo, o modelo VCC provou possuir algumas vantagens claras sobre aeróbio em C. jejuni modelos coculturing-IEC in vitro. O ambiente criado no modelo VCC imita mais de perto o ambiente no intestino humano durante C. infecção jejuni, levando a um aumento altamente significativo no número de bactérias que interagem com e invadir as IECs. O modelo VDC neste formato atual é ideal para estudar as interações de bactérias entéricas com gástrico ou intestinalcélulas epiteliais, mas existe a possibilidade de adaptar o modelo VDC para o estudo de anaeróbios estritos a partir de amostras de fezes ou de amostras microbiológicas orais, como apenas dois exemplos. O princípio importante deve sempre estar a tentar realizar estas experiências de co-cultura, em condições que imitar mais de perto a situação in vivo. O modelo VDC será uma ferramenta importante para estudos de C. jejuni interacções hospedeiro-agente patogénico e devem ser aplicáveis para o estudo dos mecanismos patogénicos de muitas bactérias diferentes.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Não temos nada a divulgar.
Acknowledgments
Dominic Mills foi apoiado por uma Bloomsbury Faculdades PhD Studentship (2007-2010). Os autores gostariam de agradecer a ambos Ozan Gundogdu e Abdi Elmi para a sua assistência no desenvolvimento do modelo VDC.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Speciality vertical diffusion system for use with Snapwell inserts | Harvard Apparatus | 66-0001 | Manifold & six Snapwell chambers |
| Caps | Harvard Apparatus | 66-0020 | |
| O-rings | Harvard Apparatus | 66-0007 | |
| Clamps | Harvard Apparatus | 66-0012 | |
| Snapwell filters (pore size 0.4 μm) | Corning Costar | 3407 | |
| Millicell ERS-2 Volt-Ohm resistance meter | Millipore | MERS00002 | |
| WPA Lightwave II spectrophotometer | Biochrom | 80-3003-72 |
References
- Mills, D. C., et al. Increase in Campylobacter jejuni invasion of intestinal epithelial cells under low-oxygen coculture conditions that reflect the in vivo environment. Infect. Immun. 80, 1690-1698 (2012).
- Marteyn, B., et al. Modulation of Shigella virulence in response to available oxygen in vivo. Nature. 465, 355-358 (2010).
- Dorrell, N., Wren, B. W. The second century of Campylobacter research: recent advances, new opportunities and old problems. Curr. Opin. Infect. Dis. 20, 514-518 (2007).
- Young, K. T., Davis, L. M., Dirita, V. J. Campylobacter jejuni: molecular biology and pathogenesis. Nat. Rev. Microbiol. 5, 665-679 (2007).
- Hu, L., Kopecko, D. J. Chapter 17. Campylobacter. Nachamkin, I., Szymanski, C. M., Blaser, M. J. , ASM Press. 297-313 (2008).
- Everest, P. H., et al. Differentiated Caco-2 cells as a model for enteric invasion by Campylobacter jejuni and C. coli. J. Med. Microbiol. 37, 319-325 (1992).
- Konkel, M. E., Hayes, S. F., Joens, L. A., Cieplak, W. Characteristics of the internalization and intracellular survival of Campylobacter jejuni in human epithelial cell cultures. Microb. Pathog. 13, 357-370 (1992).
- Monteville, M. R., Konkel, M. E. Fibronectin-facilitated invasion of T84 eukaryotic cells by Campylobacter jejuni occurs preferentially at the basolateral cell surface. Infect. Immun. 70, 6665-6671 (2002).
- Friis, L. M., Pin, C., Pearson, B. M., Wells, J. M. In vitro cell culture methods for investigating Campylobacter invasion mechanisms. J. Microbiol. Methods. 61, 145-160 (2005).
- Schuller, S., Phillips, A. D. Microaerobic conditions enhance type III secretion and adherence of enterohaemorrhagic Escherichia coli to polarized human intestinal epithelial cells. Environ. Microbiol. 12, 2426-2435 (2010).
- Cottet, S., Corthesy-Theulaz, I., Spertini, F., Corthesy, B. Microaerophilic conditions permit to mimic in vitro events occurring during in vivo Helicobacter pylori infection and to identify Rho/Ras-associated proteins in cellular signaling. J. Biol. Chem. 277, 33978-33986 (2002).
