Summary
De embryonala epidermis av mycket sent stadium Drosophila embryon ger en in vivo-system för snabb analys sår svar och kan kombineras med genetiska manipulationer eller kemiska mikroinjektion behandlingar för att främja studier i sårläkning för översättning till däggdjursmodeller.
Abstract
Drosophila embryo utvecklar en robust epidermal lagret som fungerar både för att skydda de inre cellerna från en hård yttre miljön samt för att upprätthålla cellulär homeostas. Punktering skada med glas nålar ger en direkt metod för att utlösa en snabb epidermal lindad respons som aktiverar lindade transkription reportrar, som kan visualiseras genom en lokaliserad rapportörsignalen i levande embryon eller larver. Punktering eller laserskada ger också signaler som främjar rekryteringen av hemocyter till sårområdet. Överraskande, svår (rakt igenom) punktering skada i embryon sent skede stör sällan normal embryonal utveckling, eftersom mer än 90% av dessa sårade embryon överlever till vuxen ålder när embryon injiceras i ett oljemedium som minimerar omedelbar läckage av hemolymfa från punktionsställen . Såret Förfarandet kräver mikromanipulation av Drosophila embryon, inklusive manuell anpassning av embryona på agar tallrikar och överföring av de inriktade embryon till objektglas. Drosophila epidermal sår svarsanalysen ger ett snabbt system för att testa de genetiska kraven för en mängd olika biologiska funktioner som främjar sårläkning, samt ett sätt att screena för potentiella kemiska föreningar som främjar sårläkning. Den korta livscykel och enkel odling rutin gör Drosophila en kraftfull modell organism. Drosophila ren sårläkning verkar samordna epidermal regenerativ respons, med det medfödda immunsvaret, på ett sätt som fortfarande är under utredning, vilket ger ett utmärkt system för att hitta bevarade regelverk mekanismer som är gemensamma för Drosophila och däggdjur epidermal såra.
Introduction
Manipulering av Drosophila embryon med hjälp av en mikroinjektion teknik är en väletablerad analys 1. Betydelsen av den epidermala sår svars reporter metod är att kombinera protokollet för punktering / mikroinjektion med fluorescerande reportrar och visualisera en in vivo-svar på epidermal skada i Drosophila embryon. Målet med denna metod är att göra det möjligt för en bredare uppsättning av forskare för att använda Drosophila som ett verktyg för att undersöka de processer som reglerar transkriptions svar på epidermal punktering skada. De enkla lager epidermis i Drosophila ger ett enkelt system för att studera en epidermal sår svar efter en punktering skada 2. Den Drosophila embryot är en robust modell för att undersöka genetiska skillnader mellan de olika stadierna i sårläkning, inklusive sår svar, inflammation, och reepithelialization 3. Detta beror delvis på att många eller de flesta zygotiska mutanter överleva till slutet av embryogenesär och utveckla epidermala hinder även när utvecklings mönstring går djupt snett. Föregående karakterisering av en väl bevarad transkriptionsfaktor Kornig huvud (GRH), identifierat att GRH-mål gener dopadekarboxylas (DDC) och tyrosin hydroxylas (PLE) är transkriptionellt aktiverade runt platserna för skada 4. Drosophila som modellorganism för sår svar ger en kompletterande linje av utredning till för studier i däggdjur sårläkning 5. Senare studier har identifierat ytterligare Drosophila sår-inducerade gener och utvecklat en "verktygslåda" av många fluorescerande sår reportrar att övervaka in vivo epidermal sår svar att rengöra såra 6. Nya rapporter om regleringen av Drosophila sårläkning har fokuserat på såret stängning fenotyp, vilket gör upptäckten av många signalvägar som reglerar cellmigration 7,8. Med analysen ifluorescerande sår reportrar har våra studier identifierat en ny uppsättning av gener som krävs för det lokala uttrycket av epidermala sår-inducerbara gener 9. En av fördelarna med såret svars reporter metod är att resultaten ger mer insikt i en mekanism för hur signaler omvandlade från skadeplatsen till granncellerna. Dock är en av nackdelarna med såret svars reporter metod att resultaten inte direkt länka till fenotyper i sårläkning eller reparation. Bredare användning av rent såret punktering protokoll i genetiska och kemiska sidor kommer nya regulatorer av transkriptions svar på epidermal såra att identifieras och vidare översättningen av sårläknings upptäckter i däggdjursmodeller skadebehandlingar.
Protocol
Drosophila embryonala sår protokollet kan sammanfattas i fem steg: (1) Embryo samling, (2) Embryo Beredning (3) Embryo såra, (4) Embryo mikroinjektion, och (5) Embryo Fixering.
1. Embryosamlings
- Samla vuxna flugor, 2-3 dagar efter eclosing, tillsätt 50 honor och 25 hanar till en embryosamlings bur.
- Placera en färsk äppeljuice agar plus jäst tallrik varje morgon i 3 dagar.
Obs: För optimal embryosamlingen, cykla de flugor på en 12 tim dygnsschema i ett 25 ° C inkubator (05:00 lampor "ON" och 17:00 lampor "OFF"), kvinnliga flugor reagera på förändringar i ljuscykeln och kommer att sätta in större mängder av ägg under en övergång från ljus "ON" för ljus "OFF" 10,11. - På eftermiddagen i dag-3, placera en färsk äppeljuice plus jäst agarplatta på buren och samla embryon för 2 tim. Placera en ny jäst platta på buren och spara2 hr uppsamlingsplattan.
- Förvara uppsamlingsplattan under ytterligare 14 h vid 25 ° C för åldring av embryon.
Anteckningar: Sårläkning kan analyseras i något skede under Drosophila utveckling, såret-inducerade transkriptions reportrar som beskrivs i detta dokument har en optimal aktivitet mellan stegen 15-16 december. Genom sent 17, är embryot för gammal för att lätt tränga igenom mognande nagelband och effektivt aktivera såret reportrar eller upptäcka sår-inducerad transkription. Om du vill att tid insamling och såra tid att uppstå under topp lab timmar, vi följer ett schema för embryosamling för 2 timmar (från 16:00 till 18:00), byta ut uppsamlingsplattan med en ny platta vid 18:00, ålder uppsamlingsplatta vid 25 ° C under 14 h (över natten), och lindas embryona vid 08:00 (nästa dag).
2. Embryo Framställning
Anteckningar: Detta protokoll omfattar användning av många verktyg och objekt som är skarpa eller gjorda av glass. Hantera alla vassa föremål och glasobjekt med omsorg för att undvika personskador.
- Ta försiktigt bort embryon från uppsamlingsplattor med en pensel genom att tillsätta 2-3 ml vatten till tallrik och virvlande. Ta vatten och embryon från platta till nylonnät och provröret.
- Lägg 4-5 ml blekmedel till locket på en plastpetriskål platta och blöt mask täckta änden av provröret som innehåller embryon i blekmedel i 2 min, vilket tar bort den yttre äggskal av embryot. Rotera manuellt uppsamlingsröret ett par gånger för att förhindra embryon från klumpar i blekmedel. Skölj embryon med vatten 10x och torka nät omfattas provröret som innehåller dechorionated embryon på en pappershandduk.
- Använd en dissekera nål för att överföra ~ 50 embryon från nylon mesh på en agarplatta. Vi lägger grön karamellfärg till agarplatta att lägga kontrast och stöd embryo inriktning. Enligt en dissekera mikroskop, gör två parallella rader av ~ 25 embryon, rikta in embryos på objektglaset, så att de kommer att vara i rät vinkel mot punkteringsnålen på mikroinjektion apparaten. Lämna lite utrymme (ca 1 embryo längd) mellan embryon för gas utbytessyfte. De två parallella rader bör vara ungefär 5 mm från varandra.
- Placera en bild med dubbel tejp på toppen av de inriktade embryon och försiktigt trycka på bilden för att överföra embryon från den gröna plattan till bilden. Därefter lufttorka embryon ~ 25 min för att minska det inre trycket på embryot och förhindra en explosion när sårande.
- Placera 2-3 droppar Halocarbon olja mix över embryon för att förhindra ytterligare uttorkning.
3. Embryo sårbildning
- Placera embryot glida i injektions mikroskop scenen. Hitta embryona i synfältet och öva flytta skede av inverterat mikroskop.
Obs: Innan du arbetar med nålen, fokuserar på mellanplanet embryo längs dorsoventral axeln. För att möjliggöra en effektiv såra avlinje embryon, börjar såra raden närmare nålen apparaten. Flytta bordet för att bringa den övre delen av raden av inriktade embryon in i synfältet. - Placera försiktigt och säkra en drog-nål i nålhållaren. Använd mikromanipulator att flytta nålen ner mot bilden. Rikta nålen med embryot, i samma fokalplan. När nålen är i fokus med embryot, inte flytta nålen med mikromanipulator.
- Flytta bordet för att punktera embryot rakt igenom, sedan gå vidare till nästa embryot i raden. När du är klar såra den första raden, använd mikromanipulator att flytta nålen helt upp och bort från scenen innan du flyttar bilden, rotera manuellt sliden 180 ° och sårar den andra raden.
- Förvara embryon enligt Halocarbon olja vid rumstemperatur och fortsätt med embryo fixering vid att göra in situ hybridisering eller antikroppsfärgning (se Procedur steg 5). Alternativt, lagra embryon för 4-6 timmari Halocarbon olja och fortsätt med sår transkription fluorescerande reporter visualisering (Representativa resultat).
Anmärkningar: För visualisering av fluorescerande reporter, vi söva embryona som använder 50% 1-fenoxi-2-propanol 13. Embryona avlägsnas från Halocarbon olja och placerades på en ny bild. Vi lägger glaspärlor runt embryon, tillsätt några droppar av bedövningsmedel, och placera ett täckglas på embryona.
4. Embryo Mikroinjektion
Anmärkningar: Den mikroinjektion apparat som vi använder i protokollet är inte automatiserat leverera specifik volym under analysen. Vi lägger ett färgämne till lösningen för att visualisera mikroinjektion och försök att normalisera volymen levereras. Om för mycket vätska sprutas in i embryot, kommer vitellinmembranet brista.
- Ladda nål bakifrån med 1 l av kemisk lösning plus färgämne (t.ex. 0,6 MH 2 O 2). Tillåt kapilläråtgärder för att rita den kemiska lösningen till spetsen på nålen.
- För att bryta en nål, lägg ett täckglas i en vinkel på en bild och päls kanten med Halocarbon olja mix. Ta med den monterade nålen i fokus med kanten av den vinklade täckglas och försiktigt flytta täckglas kant över nålspetsen tills trasiga. Sätt press på mikroinjektion apparater och kontrollera att den kemiska lösningen plus färgämne flödar ut nålen.
- Placera objektglaset innehåller linje embryon på mikroskop scenen. Fortsätt att fokusera embryot och nålen i samma plan. Samtidigt punktering och mikroinjicera kemisk lösning plus färga in varje embryo.
Anteckningar: Igensatta nålar förekommer ofta, bryta en ny nål för att undvika ofullständig mikroinjektion. En trubbig nålspets inte sår så rent som en vinklad nålspets. Justering av täckglas till en icke-90 ° vinkel vid brott är optimalt för att åstadkomma en vinklad nålspetsen.
5. Formaldehyd Fixation
Anmärkningar: De kemikalier som används i denna Drosophila fixering är skadliga. Använd personlig skyddsutrustning (t.ex. handskar, laboratorierock och skyddsglasögon) vid hantering av kemikalier. Följ individuella institutionella riktlinjer för omhändertagande av reglerade kemikalier.
- Efter sårskada, vänta 15, 30, 60, eller fler minuter för den transkriptionella aktiveringen av sår-inducerade gener att uppträda. För att ta bort embryon från injektionsglas, försiktigt dränera Halocarbon olja mix från bilderna, luta bilden mot ett rack och blot änden med en Kimwipe.
- Använd ett glas pipett att skölja heptan över bilden och tvätta sköljvätska i ett glas petriskål. Heptan löser upp tejpen och släppa embryona. Fortsätt att skölja tills alla embryon tas bort från bilden. Gå vidare till nästa bild, tills alla embryon tas bort från diabilder.
- Överför heptan plus embryolösningen från glasskål in i en 20 ml scintillation flaskan. Skaka flaskan i 2-3 minuter, ta bort heptan och 5 ml färsk heptan.
- Tillsätt 5 ml färskt, fixeringslösningen (se reagenser lista för recept). Förslut flaskan och fäst till en omloppstid plattform shaker. Skaka flaskan med embryon för 25 min vid 220-230 rpm.
- Efter skakning, låt bubblorna i gränssnittet pop. Helt ta bort botten, vattenhaltiga fasen med en pipett, undvika att dra upp embryon. Det understa lagret består av fixeringslösningen och bör kasseras på rätt sätt.
- Tillsätt 5 ml metanol, cap flaskan och skaka kraftigt för hand i 20-30 sekunder, snurra och placera den på bänken. Sårade embryon kommer att stanna vid interfasen och kommer inte att sjunka till botten.
Anmärkningar: Efter fixering vitellinmembranet av en oskadade embryo normalt brast under dehydratiseringssteget med metanol. Dock är vitellinmembranet i en sårad embryo redan brutit och dehydratiseringssteget kommer inte bort vitelline membRane. Hand devitellinzation krävs för att slutföra fixeringen protokollet. - Ta försiktigt bort det övre heptan lagret och tillsätt sedan 5 ml färsk metanol. Skaka flaskan och embryona skulle sjunka.
- Avlägsna metanol plus embryo lösning med ett glas överföringspipett och samla i en nylonnät uppsamlingsrör i en glasskål.
- Ta av metanol och skölj embryon med 1x PBS-lösning.
- Överför embryon från nylonnät till en äppeljuice platta. Sprid embryona ut längs ytan av plattan.
- Överför de embryon som en dubbel tejp glasskiva. Täck embryon med 1x PBS.
Anmärkningar: Embryona tenderar att klumpa grund av vitellinmembranet. Använda en äppeljuice plats möjliggör en snabb separation av de hopklumpade embryon. Embryona måste avlägsnas från plattan och överfördes till en dubbel tejp glasskiva eftersom embryon sjunka in i agarplatta när kraft anbringas för att avlägsna embryot frånvitellinmembranet. - Skjut försiktigt embryon med en dissekera nål för att "poppa" vitellinmembranet. Embryot ska sjunka i PBS.
- Använd en glaspipett för att överföra 1x PBS plus embryon till ett 1,5 ml rör. Skölj embryon med 1x PBS och förvara vid 4 ° C. Fortsätt att torka embryon med hjälp av en Etanol: PBS-serien och fortsätta med in situ hybridisering eller immunolokalisering protokoll 14.
Representative Results
För att erhålla resultaten som visas i denna metod är den öppna läsramen av grönt fluorescerande protein (GFP) fuserad till en promotor / sår-inducerade förstärkarsekvens från dopadekarboxylas (DDC) och DsRed är fuserad till ett sår förstärkarsekvens från tyrosinhydroxylas ( niskor) 4,6. I en levande Drosophila embryo, är mognaden av den fluorescerande såret rapportörprotein optimalt 4-6 h efter sårskada, vilket ger tid för ackumulering av tillräckligt med protein för att visualisera, samt tid för det fluorescerande proteinet för att oxidera till det fluorescerande tillståndet 15. För att observera reportern lokalisering, är en förening med fluorescensmikroskop tillräcklig. För att observera en högre förstoring av reporter lokalisering, är ett konfokalmikroskop optimalt för att generera en maximal projektion av flera optiska sektioner (figur 1). Konfokal in vivo avbildning av Drosophila embryon kompliceras av rapid vågrörelser i embryot. . En komplett bild av embryot kan erhållas med 20X objektiv och en närbild av sår webbplats kan fås med 40X objektiv. En topp-vy av epidermal sår reporter lokalisering kan avbildas med 10 på varandra följande 1 pm optiska sektioner. En lateral-vy av epidermal sår reporter lokalisering kan avbildas med 40 på varandra följande 1 um optiska sektioner.
Med användning av standard genetiska korsningsmetoder är det möjligt att kombinera lindade reportrar med genetiska mutationer. Ett exempel som presenteras i denna uppsats är Flotillin-2 (Flo-2), eftersom förlust-av-funktion (null allel genereras med P-elementet insättning) och få-av-funktion (överuttryck som genereras med allestädes närvarande uttryck i alla celler) mutanter av FLO-2 demonstrera Flo-2-genprodukten är nödvändig och tillräcklig för att inhibera lokaliseringen av DDC-GFP lindad reportrar 9 (fig 2A och 2B). Använda milcroinjection protokoll, är det möjligt att testa huruvida införandet av kemiska lösningar superactivates eller inhiberar lokaliseringen av lindade reporters. Kemiskt-sårade embryon samtidigt sårade och injiceras med en 01:04 förhållandet 1% toluidinblått och upplösta föreningar. Toluidinblått tillåts för visuell bekräftelse av solubiliserade föreningar som injiceras in i kroppshåligheten. Embryon Kontroll skadades med en bruten nål innehållande 01:04 förhållandet 1% toluidinblått och löst ämne utan kemikalier. Två exempel som presenteras i detta dokument är väteperoxid (H 2 O 2) och metyl-β-cyklodextrin (MβCD), eftersom båda kemiska lösningar är tillräckliga för att globalt aktivera lokalisering av DDC-GFP sår reportrar 9 (figur 2C och 2D) . Väteperoxid (H 2 O 2) späddes i H2O till 0,6 M. metyl-β-cyklodextrin (MβCD) solubiliserades i 1 mM NaOH till 3 mM. Med användning av embryo fixering protokoll är det möjligt att detektera transkriptionsaktivering av upprullade responsgener i ett lokaliserat område, som omger ett sårställe. Ett exempel som presenteras i denna uppsats är situ hybridisering av RNA-sonder den i att upptäcka Ddc och PLE avskrifter 4,6,9 (fig. 3A och 3B).
Figur 1. DDC-GFP och pel-DsRed sår reporter lokalisering. Ljusfält och fluorescerande bilder på skadade embryon vild typ. (A) Top-bild av Ddc-GFP sår reporter. (B) Top-bild av pel-DsRed sår reporter. Alla bilder togs på en Leica SP2 konfokalmikroskop med 20X objektiv. Pilarna markerar platsen för såret. Streckade linjer i datapanelens markera konturerna av embryon. Klicka här för att visa en större bild .
Figur 2. Lokalisering av DDC-GFP sår reporter i genetisk mutant bakgrunder och kemiska idag injiceras embryon. Bright och fluorescerande bilder av sårade Flotillin-2 (Flo-2) mutant embryon. (A) förlust-av-funktion Flo-2 {KG00210} mutanter, expansion av reporter aktivitet i alla hudceller. (B) Gain-av-funktionen Flo-2 (bältdjur-GAL4, UAS-Flo2) mutanter, hämning av reporter aktivitet i alla hudceller. (C) Väteperoxid (H 2 O 2 ) lösning mikroinjektion, utbyggnad av repÖrter aktivitet genom alla epidermala celler. (D) metyl-β-cyklodextrin (MβCD) lösning mikroinjektion, expansion av reporteraktivitet i alla epidermala celler. Alla bilder togs på en Leica SP2 konfokalmikroskop med 20X objektiv. Pilarna markerar platsen för såret. Streckade linjer i datapanelerna markera konturerna av embryon. Klicka här för att visa en större bild .
Figur 3. Detektion av såret responsgenen RNA-transkript. Fluorescerande bilder av in situ hybridisering och RNA-detektion i sårade embryon av vildtyp. Ddc (A) och PLE (B) RNA-transkriptioner ackumuleras runt sårstället. Alla bilder var kollekted på en Leica SP2 konfokalmikroskop med 20X objektiv. Pilarna markerar platsen för såret. Streckade linjer i datapanelerna markera konturerna av embryon. Klicka här för att visa en större bild .
Tabell 1. Sammanfattning av epidermal sår svars reportrar. Inser för de fyra lindade svars reportrar (DDC, pel, msn, KKV) finns på både andra och tredje kromosomer. Samtliga sår respons reportrar aktivera fluorescens genen (GFP eller DsRed) i ett begränsat antal av epidermala celler i närheten av platsen för punktering skada i vildtyp bakgrund (t.ex. "lokal" fenotyp). DdC och msn lindade respons reportrar kräva GRH för aktivering av fluorescence-gen efter punktering skada (t.ex. "ingen" fenotyp). Alla sår reportrar kräver Flo-2 för lokalisering av fluorescens-genen efter punktering skada (t.ex. "global" fenotyp). Klicka här för att visa en större bild .
Discussion
En omedelbar transkriptionsreglerande svar på yttre signaler tillåter celler att samordna ett lokaliserat svar på extracellulära stimuli, som kan inkludera stress, skada eller infektion. Felaktig styrning av en lokal reaktion kan ha skadliga effekter på angränsande celler, såväl som ett slöseri med resurser att reparera skadan. The Drosophila embryo ger ett utmärkt system för att utföra grundläggande sårläknings experiment på ett billigt och enkelt att underhålla modellorganism. Potentialen för samarbeten mellan forskning i andra modellorganismer och Drosophila ger en unik möjlighet att utforska många biologiska frågor.
En ytterligare teknik för de lindade reportrar är den genetiska kombination av mutanta bakgrunder, att tillhandahålla en effektiv metod för att testa bidraget av nya gener till aktiveringen av den epidermala sår svarsvägen. Vi har epidermala sår-inducerad transkriptions reportrar AV-AILABLE på både 2: a och 3: e kromosomer 5. I denna studie använder vi UAS och GAL4 system överuttryck 16. För studier med dödliga muterade alleler vi bestämma den genetiska bakgrunden med hjälp av en fluorescerande balanse kromosom, t.ex. Kruppel-GFP 17. Vi har analyserat såret reportern lokalisering i flera genetiska bakgrund (tabell 1).
En eventuell ändring av tekniken är att kombinera mikroinjektion och såra. Mikroinjektion kan användas för att införa en kemisk lösning i embryot. Flera kemiska föreningar har testats och befanns att reglera aktiviteten hos de epidermal lindade reportrar 9. Denna metod för samtidig sårskada och mikroinjektion kan vara användbart för att öka antalet celler i Drosophila embryo som reagerar ett sår signal och kan direkt användas för att övervaka genuttryck förändringar efter sårbildning 18. En framtida tillämpning av mikroinjektion tekniken är att testa nya kemikalier för reglering av epidermal såret svar.
Drosophila som modellsystem för genetiska studier erbjuder ett brett utbud av enkla protokoll för att effektivt ta itu med komplexa frågor. Nya rapporter om genomförbarheten av Drosophila tekniker belyser användningen av hemocyte migration 19 och parasit geting infektion 20 som ett sätt att ytterligare bredda effekterna av Drosophila forskarsamhället. Förutom sårläkning studier, Drosophila ger en klassisk modell för regenerering med den imaginal skivsystemet 21,22. De kombinerade framsteg inom imaginal skiva regenereringsstudier och punktering / mikroinjektion såra ger ett utmärkt system för att upptäcka väl bevarade komponenter i vävnad reparera.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Detta protokoll har utvecklats i samarbete med tidigare medlemmar av McGinnis Lab, Kim A. Mace och Joseph C. Pearson. Vi tackar de fortsatta ansträngningar från Bloomington Drosophila Lager Center för sitt arbete för att organisera och fördela värdefulla bestånd. Detta arbete stöddes av finansiering från National Institutes of Health (R01 GM077197 och K12 GM68524) och familjen Herbert Stern. MTJ stöds för närvarande av Grant Number 5G12RR003060-26 från National Center for Research Resources och Grant Number 8G12MD7603-27 från National Institute on Minoritet Hälsa och skillnader i hälsa. Innehållet är ensamt ansvarig för författare och inte nödvändigtvis representerar officiella ståndpunkter National Institute on Minority Hälsa och skillnader i hälsa och National Institutes of Health.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| yeast | Sigma Aldrich | 51475 | |
| apple juice | Generic | ||
| agar | Fisher Scientific | 50-824-297 | |
| bleach | Generic | ||
| halocarbon oil, 700 W | Sigma Aldrich | H8898 | |
| halocarbon oil, 27 W | Sigma Aldrich | H8773 | |
| 1-phenoxy-2-propanol | Sigma Aldrich | 484423 | |
| hydrogen peroxide | Fisher Scientific | H324 | |
| methyl-β-cyclodextrin | Sigma Aldrich | C4555 | |
| toluidine blue | Sigma Aldrich | 89640 | |
| formaldehyde, 16% | Polysciences, Inc | 18814-20 | toxic chemical |
| heptane | Fisher Scientific | H360-1 | toxic chemical |
| methanol | Fisher Scientific | A412-1 | toxic chemical |
| 10x PBS | Fisher Scientific | 50-899-90013 | |
| 0.5 M EGTA | Fisher Scientific | 50-255-956 | |
| RNase free H2O | Fisher Scientific | BP2819-100 | |
| Drosophila incubator | Genessee Scientific | 59-197 | |
| fly cage | Genessee Scientific | 59-100 | |
| embryo collection tube | Genessee Scientific | 46-101 | |
| plastic Petri dish | Fisher Scientific | 50-202-037 | |
| double-stick tape | Generic | ||
| paintbrush | Generic | ||
| dissection needle | Fisher Scientific | 08-965A | sharp object |
| glass cover slip | Thermo Scientific | 3306 | sharp object |
| microscope slide | Thermo Scientific | 4445 | sharp object |
| dissecting microscope | Carl Zeiss | Stemi-2000 | |
| capillary needle | FHC | 30-30-1 | sharp object |
| needle puller | Narishige | PC10 | |
| microinjection needle holder | Narishige | MINJ4 | |
| micromanipulator | Narishige | MN151 | |
| inverted microscope | Carl Zeiss | Primo-Vert | |
| glass Petri dish | Fisher Scientific | 08-747A | sharp object |
| glass Pasteur pipette | Fisher Scientific | 22-063-172 | sharp object |
| transfer bulb | Fisher Scientific | 03-448-25 | |
| Kimwipe | Fisher Scientific | 06-666A | |
| scintillation vial | Fisher Scientific | 03-337-7 | sharp object |
| orbital shaker | Fisher Scientific | 14-259-260 | |
| 1.5 ml tube | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| laser scanning confocal | Leica | SP2 | |
| fixation solution | (5 ml) | ||
| 16% formaldehyde | 2.5 ml | toxic chemical | |
| 10x PBS | 0.5 ml | ||
| 0.5 M EGTA | 0.5 ml | ||
| RNase free H2O | 1.5 ml | ||
| Halocarbon oil mix | (10 ml) | ||
| halocarbon oil, 700 W | 5 ml | ||
| halocarbon oil, 27 W | 5 ml |
References
- Germeraad, S. Genetic transformation in Drosophila by microinjection of DNA. Nature. 262 (5565), 229-231 (1976).
- Payre, F. Genetic control of epidermis differentiation in Drosophila. Int. J. Dev. Biol. 48 (2-3), 207-215 (2004).
- Gurtner, G. C., Werner, S., Barrandon, Y., Longaker, M. T. Wound repair and regeneration. Nature. 453 (7193), 314-321 (2008).
- Mace, K. A., Pearson, J. C., McGinnis, W. An epidermal barrier wound repair pathway in Drosophila is mediated by grainy head. Science. 308 (5720), 381-385 (2005).
- Ting, S. B., Caddy, J., et al. A homolog of Drosophila grainy head is essential for epidermal integrity in mice. Science. 308 (5720), 411-413 (2005).
- Pearson, J. C., Juarez, M. T., Kim, M., Drivenes, Ø, McGinnis, W. Multiple transcription factor codes activate epidermal wound-response genes in Drosophila. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106 (7), 2224-2229 (2009).
- Campos, I., Geiger, J. A., Santos, A. C., Carlos, V., Jacinto, A. Genetic screen in Drosophila melanogaster uncovers a novel set of genes required for embryonic epithelial repair. Genetics. 184 (1), 129-140 (2010).
- Lesch, C., Jo, J., Wu, Y., Fish, G. S., Galko, M. J. A targeted UAS-RNAi screen in Drosophila larvae identifies wound closure genes regulating distinct cellular processes. Genetics. 186 (3), 943-957 (2010).
- Juarez, M. T., Patterson, R. A., Sandoval-Guillen, E., McGinnis, W. Duox, Flotillin-2, and Src42A are required to activate or delimit the spread of the transcriptional response to epidermal wounds in Drosophila. PLoS Genet. 7 (12), e1002424 (2011).
- Allemand, R. Influence of light condition modification on the circadian rhythm of vitellogenesis and ovulation in Drosophila melanogaster. J. Insect Physiol. 22 (8), 1075-1080 (1976).
- Allemand, R. Rhythm of vitellogenesis and ovulation in photoperiod ld 12:12 of Drosophila melanogaster. Insect Physiol. 22 (7), 1031-1035 (1976).
- Pierre, S. E., Thurmond, J. FlyBase 101 - the basics of navigating FlyBase. Nucleic Acids Res. 40 (D1), D706-D714 (2012).
- Wyeth, R. C., Croll, R. P., Willows, A. O. D., Spencer, A. N. 1-Phenoxy-2-propanol is a useful anaesthetic for gastropods used in neurophysiology. J. Neurosci. Methods. 176 (2), 121-128 (2009).
- Kosman, D., Mizutani, C. M., Lemons, D., Cox, W. G., McGinnis, W., Bier, E. Multiplex detection of RNA expression in Drosophila embryos. Science. 305 (5685), 846 (2004).
- Barolo, S., Castro, B., Posakony, J. W. New Drosophila transgenic reporters: insulated P-element vectors expressing fast-maturing RFP. BioTechniques. 36 (3), 436-440 (2004).
- Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118 (2), 401-415 (1993).
- Casso, D., Ramírez-Weber, F., Kornberg, T. B. GFP-tagged balancer chromosomes for Drosophila melanogaster. Mech. Dev. 91 (1-2), 451-454 (2000).
- Patterson, R. A., Juarez, M. T., Hermann, A., Sasik, R., Hardiman, G., McGinnis, W. Serine proteolytic pathway activation reveals an expanded ensemble of wound response genes in Drosophila. PloS one. 8 (4), e61773 (2013).
- Evans, I. R., Zanet, J., Wood, W., Stramer, B. M. Live imaging of Drosophila melanogaster embryonic hemocyte migrations. J. Vis. Exp. (36), e1696 (2010).
- Small, C., Paddibhatla, I., Rajwani, R., Govind, S. An introduction to parasitic wasps of Drosophila and the antiparasite immune response. J. Vis. Exp. (63), e3347 (2012).
- Repiso, A., Bergantiños, C., Corominas, M., Serras, F. Tissue repair and regeneration in Drosophila imaginal discs. Dev. Growth Differ. 53 (2), 177-185 (2011).
- Worley, M. I., Setiawan, L., Hariharan, I. K. Regeneration and transdetermination in Drosophila imaginal discs. Annu. Rev. Genet. 46, 289-310 (2012).
