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Behavior

禁欲ラットで探しているヘロインに長期の食事制限の影響を研究するための手順

doi: 10.3791/50751 Published: November 11, 2013

Summary

食物制限されたラットで薬物探索のロバスト増強のデモンストレーションを可能にする手順が記載されている。ヘロイン自己投与の訓練後、ラットは、彼らは穏やかに制限された食品である時に、薬物のない環境で、禁欲期間を経る。薬物探索はその後、薬物に関連した環境でテストされています。

Abstract

人間の麻薬中毒者には、以前に薬物服用と関連していた薬剤に関連する手がかりや環境への暴露は、禁欲中に再発をトリガすることができます。さらに、様々な環境問題は、この効果を悪化させるだけでなく、継続的な薬物摂取を増加させることができる。

我々はここで説明する手順は、禁欲ラットで求めた薬物の増強として表現さ​​れている薬物渇望に共通の環境課題、食事制限の影響を強調しています。

ラットは慢性静脈静脈カテーテルを移植した後、レバーを押すように訓練されています 10〜12日の期間にわたってIVヘロイン。ヘロイン自己投与段階後のラットは、オペラント条件付けチャンバーから取り出し、少なくとも14日間、動物ケア施設に収容された。 1グループは、食品(飽きるグループ)への無制限のアクセスの下で維持されている間、第二群(FDR群)MIにさらされているその非制限体重の90%に維持し、体重をもたらすのld食事制限レジメン。食事制限の14日目にラットを背薬剤トレーニング環境に転送され、薬物探索試験( すなわち 。レバーを押したヘロインの配信をもたらさない)絶滅の条件の下で実行されている。

ここで紹介する手順では、食べ物が制限ラットでの試験の日にしようとヘロインの非常に堅牢増強になる。また、我々は以前に使用した急性絶食操作に比べて、現在の手順では、薬物探索にカロリー制限の影響を、より臨床的に関連するモデルです。また、ラットを人気回復手順の不可欠な要素である薬物探索テスト、前に絶滅 - 訓練段階を通過する必要はありませんように人間の状態に近いかもしれません。

Introduction

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薬物中毒の治療における主要な問題の一つでも禁欲1,2の延長された期間の後、再発率が高いことである。人間の中毒者での研究は、再発に、このような薬剤に関連する個別の手がかりや環境3とストレスの多い生活上の出来事4への暴露のように、環境問題の重要な貢献を同定した。薬物の服用及び渇望に対する効果を有することが見出された共通の環境課題は、慢性の食事制限である。例えば、慢性のカロリー制限が5増加したシガレット喫煙に関連していることが報告されている。  さらに、ダイエット重症度(カロリー制限)を積極的に若い女性6における薬物使用の有病率の増加と相関している。しかし、基盤となる脳のメカニズムは完全には理解されていません。

人為的な研究、動物モデルhに関連する実用的かつ倫理的配慮に関連する神経機構を同定するために開発されAVE。我々は以前、急性(24〜48時間)絶食9,10にさらされたラットで求めて消火薬剤の再開を実証するために復職手順7,8を使用している。しかし、回復手順の不可欠な部分は、薬物依存症治療11の一般的な機能ではありません(ただし、回復手順の有効性に関する包括的な議論についてはエプスタイン 12参照 )消光期間である。さらに、ヒトにおける食事性操作の特定の場合のみ慢性食物制限はなく、急性の食物欠乏に、効果的に薬物を服用5,13を増加させること示された。

その結果、我々は薬物探索に慢性的な食糧制限の効果の研究を可能にする「禁欲手順」14を示唆している。この手順を使用すると、我々は最近、Hの堅牢な増加が示された穏やかな食事制限15日から14日に暴露した後禁欲ラットで求めeroin。

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Protocol

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1。動物

全てのラットは、動物管理カナダ評議会のガイドラインに沿って処理され、すべての実験手順のための承認はコンコルディア大学動物研究倫理委員会によって許可された。

  1. 275〜300グラム(男性)または225〜250グラム(メス)でラットを入手します。トウモロコシの穂軸寝具やシュレッダー紙を含む標準的なプラスチックケージに手術まで、ペアでの家のラット。
  2. 逆に明暗サイクル(午前9時30分消灯)にラットを維持する。
  3. 食料と水は禁欲期間中を除いて、 自由に摂取可能なことを確認してください。我々は、通常のラット飼料(20.9%タンパク質、67.2%炭水化物11.8%の脂肪)を使用します。

2。カテーテルとコネクタ

  1. 一括でカテーテルを作成し、オートクレーブ滅菌、次長期に渡って必要に応じて使用します。
  2. 長さ12cmの部分にシラスティックチューブをカット。
    1. 小さなを配置するには、つまようじを使用して、カテーテルの周りのシリコンのドロップ、先端から3センチメートル。
    2. 24時間シリコン乾燥させると、オートクレーブおよびカテーテルを格納します。
  3. ベンドは、プラスチックの台座に対して直角に、コネクタとなる「5アップ」カニューレの長い管は、オートクレーブとストア。
  4. プラスチックの台座に半分の方法については、「5アップ」カニューレの屈曲金属管を介してシラスティックチューブの「長い」側を押すことにより、無菌的に、手術当日にカテーテルを組み立てます。
    1. タイゴンチューブと滅菌生理食塩水で満たされた1ミリリットル注射器に鈍化22 G針を介して "5アップ」チューブを接続します。
    2. 遮るもののない流れを確保するために、カテーテルを介して生理食塩水をフラッシュします。

3。静脈内カテーテル手術

  1. 手術前に動物飼育施設(ACF)のラット順化の1週間に許可します。低体重のラットに手術をしないでください300〜325グラム(男性)または250〜275グラム(メス)より。
  2. 手術前に計量し、ケタミン/キシラジン混合物でラットを麻酔(13分の90 mg / kgを、IP)。
    1. 剃る、その後、アルコールおよび外科スクラブで頭と(首の付け根に近い)右肩の領域を清掃してください。
    2. 感染から保護するためにペニシリン(45万IU /ラット、皮下)を注入し、水分補給のための生理食塩水(SC)の2ミリリットル。麻酔によって誘導された乾燥を防ぐために、ラットの目に涙ゲルを適用します。
  3. その腹部にラットを置き、目の間、頭の上に、メスを用いて、切開を行い、尾側にラットの耳に向けた。
  4. 表面にテープで前腕との背中にラットを配置します。ピンセットで、ちょうど鎖骨の吻側、切開領域内の皮膚を持ち上げ、小さなハサミで1センチメートル縦カットを行う。
  5. 2まっすぐに鉗子を使用して、外頚のVEIまで脂肪や他の組織を分離nが露出している。
  6. 周囲の組織から静脈を持ち上げ、分離するために静脈の下でまっすぐに鉗子の先端を押してください。慎重に付着する組織から静脈をきれいにし、それが持ち上げられ、やや伸び保つために静脈の下に曲がった鉗子を挿入します。
  7. 小さく、V字型の小型のばねはさみを用いて静脈の上面に切断した。
    1. カットは、血管拡張器を使用して開いたまま、シリコーン降下が切開点になるまで、心に向かって静脈にカテーテルの「短い」、3センチメートル先端を進める。
    2. 可能な限り尾1、シリコーン降下だけ吻側1、可能な限り吻側第三1:3縫合糸で静脈にカテーテルを接続します。
    3. それが妨げられていないままで、縫合糸があまりにもタイトではないことをことを保証するために各縫合糸、次のカテーテルを介して生理食塩水を渡します。
  8. 腕周りにテープを外し、下にラットの腹側に配置します。
    1. 止血剤tを挿入する頭部切開の尾側hroughおよび皮下 "ポケット"を作成するために、下層組織から皮膚を分離するためにプッシュする。
    2. カテーテルが挿入された肩の上に開口部に向かって皮膚の下に止血剤を導く。
    3. 止血剤を使用した結合組織を突破し、しっかりのベースの下に、最も吻側の時点でカテーテルをクランプ "5アップ。"
  9. "5アップ」外し、ラットの頭の上にある切開皮膚の下や外カテーテルの長い方の端を通します。
    1. 止血剤を固定したところ、以下のカテーテルをカットしての長い方の端再接続するはさみを使用して、 "5アップ。"
    2. プラスチック台座に「5アップ」のすべての方法の金属軸に沿ってカテーテルを引っ張る。自由な流れを確保するために通って生理食塩水を渡します。
  10. その背中にラットを置き、鎖骨の近くにだけ切開を縫合。頭部切開べきREMAオープン中。
  11. 定位固定装置にラットを配置します。ブルドッグクランプとクリーンを使って頭の上に切開で皮膚を引き離すと、頭蓋骨の表面を乾燥させます。
  12. 頭蓋骨に四から五穴を開けてヘッドキャップのための足場として機能するように穴に機械ねじを挿入するために、手動のドリルビットを使用してください。
    1. 以前に止血剤を使用して行われ、ねじの間の「5アップ」のコネクタを配置して、皮下の「ポケット」へのカテーテルの余分な長さを挟む。
  13. 頭蓋骨の上部に「5アップ "固定する歯科用セメントを使用しています。セメントが完全に乾燥させた後、定位装置からラットを削除します。
  14. 生理食塩水の2ミリリットル(SC)、ケトプロフェンで構成されたラット術後ケア、(5 mg / kgを、SC鎮痛剤)を得た。疼痛管理を支援するために手術後の追加の2日間、ケトプロフェンを管理します。
  15. 手術後48時間以降、W毎日フラッシュラット滅菌生理食塩水でのヘパリンおよびゲンタマイシンのi番目の混合物(7.5 IU + 12μgの、0.2〜0.3ミリリットル)〜2日間の回復期間を通じてヘロイン自己投与のフェーズを。

4。行動手順

ヘロイン探索の食物制限誘導性増大の手順のためのタイムラインを図1に示されている。

  1. オペラント条件付け室。
    1. 家のラットは個別にオペラント条件付けチャンバー内のファンを搭載した木製のコンパートメントを減衰音に囲まれて。
    2. 各チャンバは、ステンレス鋼、金属格子床、表裏プレキシグラス壁と二つの金属板の側壁からなる。マウント9センチメートル右側壁の床から2格納式レバー、そして各レバーの上にキューライトを探します。非薬物対合(非アクティブ)のレバーに対応しながら、薬剤ペア(アクティブ)レバーで応答すると、注入ポンプを作動させる何のプログラム可能な結果を​​持っていません。</李>
    3. アクティブレバーの上にトーンモジュール(2.9 kHz)を探し、左側の側壁の上部中央にある赤い家光を置きます。
    4. 金属バネで保護液体スイベルとタイゴン管を介してカテーテルに薬剤ポンプを接続します。また、食品のホッパーと食料と水への無制限のアクセスを許可する水のボトルを各室を装備。
  2. 馴化日:
    1. 手術からの回復の後には、オペラント訓練室にラットを移動して、24時間の馴化期間を可能にします。
    2. 金属スプリングにラットを接続しないでくださいとcue-light/tone複合体を活性化しない。
    3. アクティブレバーが後退残っていることを確認したが、非アクティブレバーがトレーニング中に二つのレバーの間の識別を支援するために拡張されていることを確認してください。
  3. ヘロイン自己投与:
    1. タイゴンチューブに5アップ用コネクタに接続し、金属ばねに取り付けます。
    2. 自己ADMにラットを許可する3時間間隔で区切られた3つの3時間のセッション中に10日間inisterヘロイン(0.1 mg / kgの/注入)。
    3. アクティブおよび非アクティブレバーの延長だけでなく、家の光とするためcue-light/tone複合体の活性化の照明で(私たちの研究室で午前9時30分頃)、暗期の開始次の各セッションを開始する30秒。
    4. 薬剤ポンプ(5秒、0.13ミリリットル/注入)及びハウスライトがオフになって、アクティブレバー前記キューライト/音質複合体がされている間の20秒のタイムアウト期間の開始の活性化におけるアクティブレバー結果に応答(FR-1、20秒のタイムアウト)活性化した。タイムアウト期間中に、アクティブレバー応答が記録されますが、補強されていない。非アクティブレバーの応答が記録されますが、何のプログラム可能な結果を​​もたらすことはありません。
    5. 非アクティブレバーは、次の日の最初のセッションの前に1時間まで延長ままである各3時間のセッションに続いて、アクティブレバーが後退する。
  4. 禁欲と食事制限:
    1. 自己管理のトレーニングの後、オペラント条件付け室からネズミを削除して、個別にACFでそれらを収容し、1薬物ウォッシュアウト日の食料と水への無制限のアクセスを与える。
    2. 食品(FDR)が制限または飽きる、体重、トレーニングの最後の5日間にわたる点滴とアクティブレバー応答の数に応じてマッチ:2グループにラットを分ける。
    3. 薬物ウォッシュアウト日に続いて、FDRのラットの餌を削除し、午後1時30分、彼らにラット飼料の約15グラムを養う。独自のベースラインBWの約90%にFDRのラットの体重(BW)を維持するために、禁酒の14日間を越え食事の量を調整します。
  5. 薬物探索テスト:禁断の14日目の朝、オペラント条件付け室にラットを戻し、金属ばねに取り付けます。アクティブおよび非アクティブレバーの応答が、同じ結果があり、この間、1時間または3時間のセッションを使用( すなわち 、消光条件下で)、薬剤の有効性を除いた自己管理のトレーニング中のS、。

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Representative Results

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経時的な体重は :典型的な結果は、体重がヘロイン自己投与トレーニングを通して安定なままであることを実証している。食品が制限されているものが自分の元の体重の約90%又は満腹ラットの体重( 図2)の75〜80%に自分の体重を減少させながら、禁欲中に、無制限のアクセスを有するラットは、それらの体重を増加させちゃうする。

煎茶、訓練以上のアクティブおよび非アクティブレバーの応答 :輸液やトレーニング日間増加応答アクティブレバーのに対し、応答非アクティブレバーがないではない( 図3)。一般的に、アクティブレバー訓練を通じて増加して応答し、応答の速い速度で安定します。応答非アクティブレバーは、ラットが正常に両方のレバーの間で区別していることを意味する、訓練を通じて、最小限のまま。最後に、撮影回数の注入は、訓練を通じて増加し、アクティブレバー応答のより低い速度で安定したままである。この解離は、薬物注入後20秒でタイムアウトすることが可能である。

試験日に、アクティブおよび非アクティブレバーの応答 :アクティブレバーは食べ物が制限ラット応答を大幅に飽きるラット(我々は、多くの場合、治療群間で250%の差が見られ、15を参照)と比較して増加します。応答非アクティブレバーが制限された食品や飽きるラット( 図4)間の最小と同程度である。

図1
図1。実験手順のタイムライン。手順は、3つのフェーズで構成されています。動物が最初のキュー/トーン複合体(ヘロイン自己投与相)の存在下で自己投与する薬剤に訓練され、その後、別のコンテキストに移動し、1日の薬​​の休薬期間を経る。休薬日はラットを食事制限や食品への無制限のアクセスのレジメンを与えられている禁欲、長期間続いている。禁断の14日に、ラットを絶滅条件(薬物探索·テスト·フェーズ)の下で薬物ペア手がかりの存在下での薬物探索試験のための自己管理環境に戻ります。 拡大画像を表示するには、ここをクリックしてください

図2
図2。 (FDR)と飽きるグループ制限された食品中の体重は、実験日を越え全てのラットは、オペラント訓練室でのヘロイン自己投与訓練と動物のケア施設での1日の薬のウォッシュアウトの10日間を受ける。ラットを身体我に従って対応付けられますIGHT、FDRまたは飽きるのグループに分離する前に応答し、薬物注入のアクティブレバー。 拡大画像を表示するには、ここをクリックしてください

図3
図3。ヘロイン自己投与の訓練中に行われた輸液、アクティブおよび非アクティブのレバー応答の数はヘロイン(0.13 mg / kgの/注入)のFR-1、20秒の下で、10日間に3 3時間のセッションで自己管理されている強化のタイムアウトスケジュール。 拡大画像を表示するには、ここをクリックしてください

図4
Fiのグレ4。禁欲ラットで求めてヘロインに長引く食事制限(FDR)への暴露の影響。データは、試験日に応答する代表的なアクティブおよび非アクティブのレバーを表しています。試験日は、FDRまたは飽きる条件で禁欲のヘロイン自己投与訓練と14日に続いて、絶滅の条件の下で1 1時間(または3時間)テストセッションから構成されています。 拡大画像を表示するには、ここをクリックしてください

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Discussion

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1)それは自発的な薬物摂取と薬剤投与の制御のために、2)それは、人間の中毒者では一般的である投与経路を使用して可能にするため、ここで説明する手順は、強力な表面的妥当性がある、3)それは薬物曝露の(比較的)長期間を反映していると禁欲、および4)には、回復手順に不可欠ですが、稀に、人間の中毒者14に観察されない薬物探索試験前の絶滅の訓練を避けることができます。また、プロシージャ·モデル5を探している薬物に対するカロリー制限の効果を考慮する際に重要であると考えられている延長された食品の制約条件。

我々はここに記述プロトコルにおいて、ラットは、薬物自己投与期間(24時間/日)を介してオペラント条件付けチャンバー内に収容されている。これは、ラットACF aに戻された「班」プロトコルを使用して、データ収集の効率を向上させることが可能かもしれない毎日訓練するために、複数のグループを可能FTER一日一回のトレーニングセッション、。ヘロインは、好ましくは、「ホーム」環境16内投与されるので、このアプローチは、コカインの訓練に適している可能性があります。我々は分隊オプションを使用して手順の効率を評価していない。手順のスループットを向上させる別の方法は、10〜12日までのラットの2つのグループ薬物自己投与トレーニングをずらすことである。最初のグループは、ACF内禁欲期間を通過しながら、この設計を使用すると、第2グループのラットは、自己投与のために訓練されています。第二のグループのための薬剤の自己管理のトレーニングは、チャンバーの徹底したクリーニングを可能にするために、少なくともその日最初のグループのために計画されたテストの前に締結されなければならない。

私たちは、Eの求めてヘロインを強化するために失敗した食事制限の3〜5日で、制限期間の長さが重要であることを15の前に報告している禁欲期間の購入する。我々は、増加露光期間(;未発表データ〜28日)で食事制限操作の有効性の増加は確認されていません。

また、自己投与相との間の禁断期間コンテキストの変化が薬物探索の増強のために重要であると思われることは注目に値する。我々は、ラットを禁欲期間(未発表観察)の間に薬物トレーニング環境で維持されると食事制限のため大いに減少効果を示唆するデータを収集した。

結論として、ヘロインシークの食事制限によって誘導される増加は、堅牢、簡単に複製可能な効果である。したがって、神経化学的または神経活動のオンラインモニタリングが微量透析または電気生理学的手法、事後-Tを使用して、薬理学的な前処理を使用して、禁酒後の再発の根底にある神経メカニズムに関する研究の効率的な設計が可能になりますESTの組織学的分析。

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Disclosures

すべての実験手順のための承認は動​​物管理カナダ評議会のガイドラインに従って、コンコルディア大学動物実験倫理委員会によって付与された。著者は、彼らが競合する経済的利益を持っていないことを宣言します。 FSおよびTDは同じようにここで紹介する手順の開発に原稿の執筆に貢献した。

Acknowledgments

この作品は、自然科学·技術評議会ディスカバリープログラム(米国:298915)によってサポートされていました、フォン·ド·ルシェルシュデュケベック - サンテ(CSBN)、およびカナダの研究プログラム(米国)椅子。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Name Company Catalogue Number
Ketamine (Vetalar, 100 mg/ml) Bioniche Animal Health Obtained through local distributer
Xylazine (Rompun, 100 mg/ml) Bayer Obtained through local distributer
Heroin HCl National Institute for Drug Abuse, Research Triangle Park, NC, USA
Anafen injection 1 mg/ml Vial/20 ml CDMV, Canada 12868
Equipment
Name Company Catalogue Number
Silastic tubing (ID 0.02, OD 0.037) Fisher Scientific 1118915A
GE marine silicon GE SE-1134
Tygon tubing (ID 0.02, OD 0.060) VWR 63018-044
Cannulae (22 G, 5-up) Plastics One C313G-5up
Liquid swivels, plastic, 22 G Lomir Biomedical, Inc. RSP1
Fixed speed infusion pump (3.3 rpm) Coulbourn Instruments A73-01-3.3
Rat test cage Coulbourn Instruments H10-11R-TC
Stainless steal grid floor Coulbourn Instruments H10-11R-TC-SF
House light-rat Coulbourn Instruments H11-01R
Single high-bright cue-rat Coulbourn Instruments H11-03R
Tone module 2.9 kHz Coulbourn Instruments H12-02R-2.9
Retractable lever-rat Coulbourn Instruments H23-17RA
Balance arm Coulbourn Instruments H29-01
Sound attenuation boxes Concordia University Home made
System controller 2 Coulbourn Instruments SYS CTRL 2
System power base Coulbourn Instruments H01-01
Habitest Universal Linc Coulbourn Instruments H02-08
Environment connection board & Linc cable Coulbourn Instruments H03-04
Graphic State Notation 3 Coulbourn Instruments GS3

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References

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Sedki, F., D'Cunha, T., Shalev, U. A Procedure to Study the Effect of Prolonged Food Restriction on Heroin Seeking in Abstinent Rats. J. Vis. Exp. (81), e50751, doi:10.3791/50751 (2013).More

Sedki, F., D'Cunha, T., Shalev, U. A Procedure to Study the Effect of Prolonged Food Restriction on Heroin Seeking in Abstinent Rats. J. Vis. Exp. (81), e50751, doi:10.3791/50751 (2013).

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