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Bioengineering

मल्टी गहराई परिपत्र क्रॉस अनुभागीय Endothelialized microchannels पर एक चिप के विकास के लिए प्रक्रिया

Published: October 21, 2013 doi: 10.3791/50771
Automatic Translation
1, 1, 2, 1
1Lane Department of Computer Science and Electrical Engineering, West Virginia University, 2Department of Cell Biology and Neuroscience, University of California at Riverside

Summary

एक microchannels पर एक चिप मंच photolithographic reflowable photoresist तकनीक, मुलायम लिथोग्राफी, और microfluidics के संयोजन के द्वारा विकसित किया गया था. endothelialized microchannels मंच, विवो microvessels में की तीन आयामी (3 डी) ज्यामिति mimics नियंत्रित निरंतर छिड़काव प्रवाह के अंतर्गत चलाता है, उच्च गुणवत्ता और वास्तविक समय इमेजिंग के लिए अनुमति देता है और microvascular अनुसंधान के लिए लागू किया जा सकता है.

Abstract

Vivo में जानवरों के अध्ययन में अधिक समय लेने, महंगा, और प्रेक्षण और मात्रा का ठहराव बहुत चुनौती दे रहे हैं क्योंकि प्रयासों microvessels के अध्ययन के लिए इन विट्रो assays में विकास पर ध्यान केंद्रित किया गया है. तीन आयामी (3 डी) ज्यामिति के संबंध में विवो microvessels में प्रतिनिधित्व करने और सतत द्रव प्रवाह प्रदान हालांकि, जब इन विट्रो microvessel assays में पारंपरिक सीमाएं हैं. Photolithographic reflowable photoresist तकनीक, मुलायम लिथोग्राफी, और microfluidics का एक संयोजन का उपयोग करना, हम एक बहु गहराई परिपत्र पार के अनुभागीय endothelialized विकसित किया है नियंत्रित निरंतर छिड़काव के तहत विवो microvessels में से 3 डी ज्यामिति mimics और चलाता है, जो microchannels-a-चिप पर प्रवाह. एक सकारात्मक reflowable photoresist के एक semicircular पार के अनुभागीय microchannel के नेटवर्क के साथ एक मास्टर मोल्ड के निर्माण के लिए इस्तेमाल किया गया था. Repl दो polydimethylsiloxane (PDMS) microchannels के संरेखण और संबंधों सेमास्टर मोल्ड से icated, एक बेलनाकार microchannel के नेटवर्क बनाया गया था. microchannels की व्यास अच्छी तरह से नियंत्रित किया जा सकता है. इसके अलावा, चिप के अंदर वरीयता प्राप्त प्राथमिक मानव नाल की शिरा endothelial कोशिकाओं (HUVECs) कोशिकाओं 4 दिनों के लिए 2 सप्ताह के बीच एक समय अवधि के लिए स्थायी नियंत्रित छिड़काव के तहत microchannels की भीतरी सतह लाइन में खड़ा दिखाया.

Introduction

Microvessels, परिसंचरण तंत्र के एक भाग के रूप में, रक्त और ऊतकों के बीच बातचीत में मध्यस्थता चयापचय गतिविधियों का समर्थन, ऊतक microenvironment परिभाषित है, और कई स्वास्थ्य और रोग की स्थिति में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं. इन विट्रो में कार्यात्मक microvessels का संक्षिप्त जटिल संवहनी घटनाओं के अध्ययन के लिए एक मंच प्रदान कर सकता है. हालांकि, इस तरह endothelial सेल प्रवास assays है, endothelial ट्यूब गठन assays, और चूहा और माउस महाधमनी अंगूठी assays के रूप में इन विट्रो microvessel assays है, में पारंपरिक तीन आयामी (3 डी) ज्यामिति और निरंतर प्रवाह नियंत्रण के संबंध में विवो microvessels में विश्राम करने में असमर्थ हैं 1-8. पशु मॉडल और ऐसे कॉर्निया angiogenesis को परख, लड़की chorioallantoic झिल्ली angiogenesis को परख, और Matrigel प्लग परख के रूप में vivo assays है, में उपयोग कर microvessels का अध्ययन अधिक, समय लेने वाली लागत में उच्च, प्रेक्षण और quantifications के संबंध में चुनौती दे रहा है, और कर रहे हैंनैतिक मुद्दों 1, 9-13 बढ़ा.

नहीं होगा जो इस तरह आसानी से और कसकर नियंत्रित जैविक शर्तों और गतिशील fluidic वातावरण के रूप में पढ़ाई 14, जानवरों के साथ और इन विवो में जुड़े उच्च प्रयोगात्मक लागत और जटिलताओं कटौती करते हुए micromanufacturing और microfluidic चिप प्रौद्योगिकियों में अग्रिम जैव चिकित्सा विज्ञान में अंतर्दृष्टि की एक किस्म सक्षम है पारंपरिक macroscale तकनीक के साथ संभव हो गया.

यहाँ, हम एक endothelialized के निर्माण के लिए एक दृष्टिकोण पेश microchannels-a-चिप पर विवो microvessels में से 3 डी ज्यामिति mimics और photolithographic reflowable photoresist तकनीक, मुलायम लिथोग्राफी, और microfluidics के संयोजन का उपयोग करके नियंत्रित निरंतर छिड़काव प्रवाह के अंतर्गत चलाता है.

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Protocol

1. Photoresist मास्टर मोल्ड के photolithography निर्माण

निम्नलिखित प्रोटोकॉल 30-60 माइक्रोन के बीच व्यास के साथ microchannels के निर्माण के लिए प्रक्रिया को दर्शाता है. एक छोटे व्यास (कम से कम 30 माइक्रोन), photoresist की एक भी स्पिन कोटिंग के साथ एक microchannel प्राप्त करने के लिए आवश्यक है.

  1. उपयोग करने से पहले cleanroom के 24 घंटे के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर फ्रिज से reflow के photoresist के स्थानांतरण और यह कमरे के तापमान को गर्म करने के लिए अनुमति देते हैं.
  2. एक सिलिकॉन वेफर साफ और यह निर्जलीकरण के लिए अनुमति देने के लिए 150 डिग्री सेल्सियस से कम एक घंटे के लिए सेंकना. निर्जलीकरण सिलिकॉन सब्सट्रेट करने के लिए photoresist के आसंजन की सहायता करेंगे.
  3. स्पिन कोट photoresist की पहली परत निम्नलिखित नुस्खा उपयोग कर:
कदम समय (सेकंड) गति (आरपीएम) त्वरण
1 2 </ P> 300 उच्चतम
2 10 0
3 3 300 उच्चतम
4 60 600 उच्चतम
5 10 500 उच्चतम
6 10 600 उच्चतम
  1. फिर, 90 सेकंड के लिए 110 डिग्री सेल्सियस के तापमान के साथ एक hotplate पर वफ़र सेंकना. मुलायम सेंकना बाद photoresist की मोटाई 20-30 माइक्रोन होगा.
  2. कोट पहली परत के लिए इस्तेमाल एक ही विधि का पालन photoresist की एक दूसरी परत स्पिन.
  3. शीतल सेंकना 90 सेकंड के लिए 110 डिग्री सेल्सियस के तापमान के साथ एक hotplate पर रखकर फिर वेफर. इस नरम सेंकना बाद photoresist की मोटाई 40-60 माइक्रोन होगा.
  4. Photor उजागर करके सकारात्मक मास्टर पैटर्न उत्पन्नएक फिल्म नकाब के माध्यम से 14,500 MJ / 2 सेमी की एक जोखिम खुराक के साथ पराबैंगनी प्रकाश में esist.
  5. विआयनीकृत (डी) पानी (1:2 (v / v)) के साथ डेवलपर पतला. पैटर्न पूरी तरह से विकसित कर रहा है जब तक समाधान में बार बार वेफर कुल्ला. तब डि पानी मे से धोने और नाइट्रोजन गैस का उपयोग कर इसे सूखा.
  6. Reflow: 4 मिनट और विलायक वाष्पीकरण को रोकने के लिए एक गिलास पेट्री डिश के साथ कवर करने के लिए 120 डिग्री सेल्सियस के तापमान के साथ एक hotplate पर रखें वेफर. Hotplate से वेफर निकालें और उसे कमरे के तापमान को शांत करने के लिए अनुमति देते हैं. reflow के बाद photoresist मोटाई 50-60 माइक्रोन होगा.

2. PDMS Microchannel नेटवर्क की शीतल लिथोग्राफी निर्माण

  1. 10:1 वजन अनुपात (आधार: इलाज एजेंट) पर polydimethylsiloxane (PDMS) समाधान तैयार है और एक ग्रहों केन्द्रापसारक मिक्सर का उपयोग कर इसे अच्छी तरह से मिला लें.
  2. पुनः प्रवाहित photoresist के मास्टर मोल्ड पर PDMS समाधान डाली. देगास से 15 मिनट के लिए एक desiccator में casted PDMS रखें. यदि आवश्यक हो तो किसी भी शेष बुलबुले को दूर करने के लिए नाइट्रोजन गैस का प्रयोग करें.
  3. इसे इलाज के लिए अनुमति देने के लिए 3 घंटे के लिए डिग्री सेल्सियस 60 के तापमान पर एक ओवन में PDMS सेंकना. तब मास्टर मोल्ड से ठीक PDMS परत को हटा दें.
  4. चैनल नेटवर्क में छेद छिद्रण द्वारा इनलेट / आउटलेट छेद बनाने के लिए एक तेज छेदने का प्रयोग करें. नाइट्रोजन गैस का उपयोग PDMS की सतह को साफ करें.
  5. 4.5 एक्स 10 -2 Torr और 3.5 फुट 3 / मिनट की एक ऑक्सीजन का प्रवाह दर का एक ऑपरेटिंग दबाव में एक प्लाज्मा क्लीनर के अंदर 30 सेकंड के लिए ऑक्सीजन प्लाज्मा साथ दो PDMS परतों समझो. फिर, एक ऑप्टिकल माइक्रोस्कोप के तहत मैन्युअल PDMS की सतहों संरेखित. पानी की एक बूंद के संरेखण का एक बेहतर नियंत्रण के लिए यदि आवश्यक हो तो का प्रयोग करें.
  6. 60 डिग्री सेल्सियस पर स्थायी संबंधों को प्राप्त करने के लिए 30 मिनट के लिए एक ओवन में डिवाइस सेंकना.

3. चिप में HUVEC संस्कृति और सीडिंग

  1. संस्कृति एल glutamine के साथ संस्कृति के माध्यम से HUVECs 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) के साथ पूरक. वें के लिए2 और 5 के बीच ई प्रयोग मार्ग का उपयोग किया गया.
  2. HUVECs मिला हुआ हो जाने के बाद 37 डिग्री सेल्सियस पर 2-6 मिनट के लिए कोशिकाओं गिनती और पहली HEPES (HEPES-बीएसएस) खारा समाधान बफर के साथ कोशिकाओं rinsing द्वारा उन्हें फसल, और तब / trypsin EDTA और सेते साथ कोशिकाओं का इलाज Trypsinization के बाद पूरा हो गया, trypsin निष्क्रिय समाधान के साथ / trypsin EDTA बेअसर. अपकेंद्रित्र और उन्हें इकट्ठा करने के लिए 8% dextran के साथ संस्कृति के माध्यम में कोशिकाओं को निलंबित. Dextran बेहतर सेल बोने और लगाव में सहायता करने के लिए मध्यम चिपचिपाहट बढ़ाने के लिए इस्तेमाल किया गया था.
  3. 5 4.5 एक्स 10 -2 Torr का एक ऑपरेटिंग दबाव से मिनट और 3.5 का एक ऑक्सीजन का प्रवाह दर फुट 3 / मिनट के लिए ऑक्सीजन प्लाज्मा साथ डिवाइस समझो. तब डि पानी के साथ डिवाइस लोड और नसबंदी के लिए एक लामिना जैव सुरक्षा हुड में 8 घंटे के लिए यूवी प्रकाश के साथ व्यवहार करते हैं.
  4. कोशिकाओं को तैयार कर रहे हैं एक दिन पहले, 1x फॉस्फेट के साथ डिवाइस धोने फ़ाइब्रोनेक्टिन (100 माइक्रोग्राम / एमएल, दिल के साथ कोट तो (1x पीबीएस) buffered खारा1x पीबीएस के साथ uted) और 4 डिग्री सेल्सियस रातोंरात पर फ्रिज में सेते.
  5. फ़ाइब्रोनेक्टिन कोटिंग के बाद, 1x पीबीएस फिर संस्कृति के माध्यम से लोड के साथ डिवाइस धो लो. 15 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस के तापमान पर डिवाइस सेते हैं.
  6. 3-4 x 10 6 कोशिकाओं / एमएल के एक सेल एकाग्रता के साथ 8% dextran संस्कृति के माध्यम में HUVEC कोशिकाओं लोड. डिवाइस का एक इनलेट पर कोशिकाओं की एक 20 μl छोटी बूंद प्लेस और microfluidic चैनल में कोशिकाओं को लागू करने के लिए यह झुकाव. 15-20 मिनट के बाद कोशिकाओं चैनलों की ओर दीवारों को संलग्न करने के लिए शुरू हो जाएगा. डिवाइस कोशिकाओं का एक और अधिक समान वितरण बनाने के लिए हर 15 मिनट घुमाएँ. यदि आवश्यक हो, अतिरिक्त लोड किया जा सकता है.

4. लंबी अवधि के छिड़काव सेटअप

स्थिर संस्कृति के 5-6 घंटे के बाद, संलग्न HUVECs पूरी तरह से बाहर फैल शुरू कर देंगे. 10 μl / घंटा की एक सतत प्रवाह के साथ एक रिमोट नियंत्रित सिरिंज पंप प्रणाली का उपयोग कर छिड़काव सेट करें. छिड़काव च समायोजित किया जा सकता हैया एक उच्च प्रवाह दर, और 2 सप्ताह से 4 दिन के बीच एक समय अवधि के लिए पिछले कर सकते हैं.

5. सेल धुंधला और माइक्रोस्कोप विशेषता

  1. कोशिकाओं डिवाइस के अंदर संगम तक पहुँचते हैं, सबसे पहले, अच्छी तरह से मध्यम हटाने के लिए 1x पीबीएस के साथ डिवाइस धो लो. फिर मंदक (4 μl-1 एमएल) के साथ पतला लाल रंग के साथ डिवाइस लोड. सेल लोडिंग प्रक्रिया के समान डाई लोड. कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए अंधेरे में डिवाइस सेते हैं, और तब धुंधला रोकने के लिए संस्कृति के माध्यम से डिवाइस धो लो. डाई की लंबी ऊष्मायन सेलुलर विषाक्तता और disadhesion पैदा कर सकता है.
  2. 1x पीबीएस (मिलीग्राम प्रति 2 बूंदों) के साथ पतला नीले रंग के साथ डिवाइस लोड. कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए अंधेरे में सेते हैं तो अच्छी तरह 1x पीबीएस के साथ डिवाइस धो लो.
  3. एक औंधा ऑप्टिकल माइक्रोस्कोप के तहत सेल धुंधला जांच करते हैं. धुंधला हो जाना अच्छा था, (1x पीबीएस के साथ पतला 3.5% paraformaldehyde) फिक्सिंग मध्यम साथ microchannels लोड, तो डूबमध्यम और पूरी तरह से एल्यूमीनियम पन्नी के साथ कवर फिक्सिंग में डिवाइस. 4 के तापमान पर फ्रिज में डिवाइस स्टोर डिग्री सेल्सियस बाहर सुखाने और photobleaching से डिवाइस को रोकने के लिए. निश्चित डिवाइस अब confocal खुर्दबीन स्कैनिंग लेजर द्वारा किया जा सकता है, जो confocal इमेजिंग के लिए तैयार है.

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Representative Results

बहु गहराई microchannel के नेटवर्क के निर्माण के लिए हमारा दृष्टिकोण microchannels के पार वर्गों 15 गोल है, जिसमें इन विवो microvessels में की जटिल 3 डी geometries के mimics. इसके अलावा, माता पिता शाखाओं चैनलों के व्यास और बेटी चैनलों लगभग समग्र चैनल प्रतिरोध कम है और प्रवाह वेग नेटवर्क 16-18 भर में और अधिक समान हैं ताकि अपेक्षित स्तर पर द्रव का प्रवाह बनाए रखने के लिए मरे के कानून का पालन करना. एक semicircular photoresist के मास्टर मोल्ड के निर्माण और एक परिपत्र पार के अनुभागीय PDMS microchannel के नेटवर्क के लिए प्रक्रियाओं और परिणामों मूवी 1, चित्रा 2, और क्रमशः 2 मूवी, में प्रदर्शन किया गया. PDMS microchannel के नेटवर्क के ज्यामितीय सुविधाओं की विशेषता और चित्रा 2 में दिखाया गया. हमारे परिणाम photoresist reflow तकनीक बहु गहराई शाखाओं चैनल नेटवर्क बना सकते हैं पता चलता है कि मैंन अधिक सुविधाजनक photoresist reflow तकनीक से दृष्टिकोण, और लगभग मरे के कानून का पालन करना जो माइक्रोवैस्कुलर biomimetic सिस्टम को डिजाइन करने की अनुमति देते हैं.

इन विट्रो मॉडल में कई में, नाड़ी कोशिकाओं को सामान्य रूप से तलीय प्लेटें, फिल्टर, या हाइड्रोजेल साथ लेपित इन substrates पर संवर्धित कर रहे हैं. इन शर्तों के तहत microvessels बेतरतीब ढंग से स्वयं विधानसभा सेलुलर द्वारा उत्पन्न कर रहे हैं. इसके अलावा, पारंपरिक assays के endothelial कोशिकाओं पर एक निरंतर प्रवाह को प्राप्त करने में निहित कठिनाइयों है. एक लंबे समय तक और लगातार मीडिया प्रवाह की कमी उचित बाधा कार्यों के साथ endothelial सेल monolayer के स्थिरता बनाए रखने की क्षमता को रोकता है. हमारे मॉडल में, लागू करने की microfluidics लाभ तरल पदार्थ का उपयोग और नियंत्रण (प्रवाह दर, अवधि और पैटर्न अलग) के साथ ही कचरे से छुटकारा पाने के लिए सुविधा है. हम प्राथमिक मानव नाल की शिरा endothelial कोशिकाओं के लिए प्रक्रियाओं (HUVECs) microchannels में बोने का प्रदर्शन और सेट टिंग सेल संस्कृति के लिए एक लंबी अवधि के तरल पदार्थ छिड़काव प्रणाली (चित्रा 3). इसके अलावा, क्योंकि की जटिल geometries के vivo microvasculature में, उन छोटे जहाजों के वास्तविक समय की निगरानी के लिए मुश्किल है. विकसित PDMS आधारित चिप अच्छा ऑप्टिकल गुण प्रदान करता है और endothelialized microchannels की उच्च गुणवत्ता और वास्तविक समय इमेजिंग के लिए अनुमति देता है. (आंकड़े 4 और मूवी 3)

मूवी 1. Photoresist के मास्टर molds के लिए योजनाबद्ध निर्माण प्रक्रियाओं. प्रारंभ में, एक पूर्व साफ सिलिकॉन सब्सट्रेट तैयार किया गया था. सकारात्मक reflow के photoresist परत सिलिकॉन सब्सट्रेट पर स्पिन लेपित था और पके हुए और सूख गया था. photoresist के एक नमूनों मुखौटा के माध्यम से पराबैंगनी प्रकाश के संपर्क में था, और तब, नमूनों microchannels विकसित किए गए. एक अर्द्धवृत्ताकार पार के अनुभागीय microchannel के नेटवर्क के 4 मिनट के लिए 120 डिग्री सेल्सियस पर reflow के बाद बनाया गया था.movie1.wmv "लक्ष्य =" _blank "> फिल्म देखने के लिए यहां क्लिक करें.

चित्रा 1
चित्रा 1. SEM के विकसित photoresist से पता चलता है एक) reflow के पहले;. Reflow ख) के बाद, ग) PDMS reflowing से पहले विरोध के पार अनुभाग से पता चलता है ढाला, चित्र एक आयताकार पार अनुभाग से पता चलता है, घ) PDMS की एक semicircular पार अनुभाग दिखा ढाला reflowing के बाद विरोध, reflow के बाद क्रॉस सेक्शन पैटर्न और reflow तापमान के प्रारंभिक आयाम डिजाइन द्वारा नियंत्रित किया गया था. (संदर्भ 15 से अनुमति के साथ पुनर्प्रकाशित). बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें .

मूवी 2. PDM में बेलनाकार microchannel के नेटवर्क के लिए योजनाबद्ध निर्माण प्रक्रियाओंएस. एक PDMS समाधान photoresist के मोल्ड पर डाली और 3 घंटे के लिए 60 डिग्री सेल्सियस के तापमान पर ओवन में ठीक हो गया था. दो समान ठीक PDMS परतों, एक semicircular पार के अनुभागीय microchannel के नेटवर्क है, जिनमें से प्रत्येक गठबंधन और परिपत्र पार वर्गों के साथ microchannels के लिए फार्म एक साथ बंधुआ रहे थे. फिल्म देखने के लिए यहां क्लिक करें .

चित्रा 2
चित्रा 2. एक) PDMS. बी में एक गठबंधन और बंधुआ बेलनाकार microchannel के नेटवर्क) परिपत्र PDMS molds के पार वर्गों प्रत्येक शाखाओं स्तर (1-1, 2-2, और 3-3 ') पर चैनल आयाम दिखा. इसके अलावा, ये आंकड़े एक multibranching और multidepth परिपत्र पार के अनुभागीय microfluidic चैनल नेटवर्क के निर्माण दिखा.

पृष्ठ = "हमेशा"> चित्रा 3
चित्रा 3. योजनाबद्ध आरेख एक रिमोट नियंत्रित सिरिंज पंप का उपयोग कर चिप के माध्यम से लंबी अवधि के छिड़काव दिखा.

चित्रा 4
4 चित्रा. फ्लोरोसेंट कोशिका झिल्ली डाई (लाल) और कि HUVECs लाइन विभिन्न शाखाओं क्षेत्रों में एक बेलनाकार microchannel के नेटवर्क की भीतरी सतह. एक) ऊपर, ख) मध्य, और ग) नीचे. घ) सेल परमाणु डाई (नीला) शो का उपयोग कर माइक्रोस्कोपी छवियों Confocal माइक्रोस्कोपी छवि चैनल नेटवर्क अस्तर HUVECs के परिपत्र पार के अनुभागीय दृश्य दिखाता है. स्केल सलाखों: 100 माइक्रोन.

मूवी 3. परिपत्र चैनल नेटवर्क के साथ सेल अस्तर दिखा Confocal फिल्म.iles/ftp_upload/50771/50771movie3.wmv ​​"लक्ष्य =" _blank "> फिल्म देखने के लिए यहां क्लिक करें.

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Discussion

1. मास्टर ढालना निर्माण

संवहनी morphometry के लिए डिजाइन और मार्गदर्शक सिद्धांतों में से एक नेटवर्क भर पोत व्यास का वितरण न्यूनतम ऊर्जा ध्यान से नियंत्रित होता है कि जिसमें कहा गया है मूर्रे कानून 16, के रूप में जाना जाता है. यह भी एक विभाजन पर एक माता पिता के पोत का व्यास के घन बेटी वाहिकाओं के व्यास के घनों के योग के बराबर होती है जो बताता है ( 1 समीकरण इसके अतिरिक्त) 19, Poiseuille के कानून के रूप में वाहिका संरचना के अधिकांश में कतरनी तनाव की भयावहता का अनुमान लगाने के लिए इस्तेमाल किया गया है 2 समीकरण . जिसमें1eq3.jpg "src =" / files/ftp_upload/50771/50771eq3.jpg "चौड़ाई =" 25px "/>, μ, रक्त चिपचिपापन रक्तसंचारप्रकरण कतरनी तनाव है क्यू प्रवाह दर है, और अनुसंधान की त्रिज्या है पोत 20,21. सममित bifurcations, मूर्रे कानून और Poiseuille के नियम पर आधारित एक महत्वपूर्ण परिणाम के लिए दीवार कतरनी तनाव संवहनी नेटवर्क भर में निरंतर बनी हुई है. इस प्रकार, परिपत्र पार वर्गों के साथ एक गढ़े सममित microfluidic चैनल नेटवर्क के लिए, अगर चैनल bifurcations पालन मूर्रे कानून में आयामों, endothelial कोशिकाओं द्वारा अनुभवी कतरनी तनाव विभिन्न शाखाओं में चैनलों पर लगातार होना चाहिए.

कई तकनीक microfabrication और प्रक्रियाओं नाड़ी कोशिकाओं 22-25 के लिए इस्तेमाल किया microchannels के निर्माण के लिए लागू किया गया है, तथापि, जिसके परिणामस्वरूप microchannels के चैनलों का, आयताकार वर्ग या समलम्बाकार पार वर्गों में हुई. चैनलों के आयताकार पार वर्गों चोर हैंइस प्रकार सेल फिजियोलॉजी 26,27 में बदलाव, जिसके परिणामस्वरूप में व्यापक रूप से अलग चैनल पदों में कोशिकाओं पर द्रव कतरनी तनाव और nonphysiological geometries के अलग लागू कर सकते हैं जो bifurcations, पर तेज कोनों और अचानक बदलाव के साथ structed.

एक photoresist reflow प्रक्रिया, एक गोल चैनल प्रोफाइल, जिसके परिणामस्वरूप दो प्रक्रियाओं, 1) नमूनों photoresist के पिघलने और तरल विरोध सतहों प्रणाली 28,29 और 2 की ऊर्जा जो कम से कम एक आकार में खींच रहे हैं) एक ठंडा और शामिल सम्पिण्डन चरण के पिघलने की प्रक्रिया इस प्रकार है. पुनः प्रवाहित चैनलों का आकार अच्छी तरह से एक semicylindrical सतह से approximated हैं. पुनः प्रवाहित मास्टर ढालना निर्माण के द्वारा पीछा किया, एक मानक नरम लिथोग्राफी दृष्टिकोण पार अनुभाग एक परिपत्र के साथ PDMS microfluidic चैनल नेटवर्क के निर्माण के लिए इस्तेमाल किया गया था. हमारे परिणाम photoresist reflow तकनीक एक अधिक straigh में बहु गहराई शाखाओं microchannel के नेटवर्क बना सकते हैं कि पता चलाटी आगे दृष्टिकोण, और हमें विभिन्न शाखाओं के स्तर पर लगभग समग्र चैनल प्रतिरोध कम है, इसलिए है कि मरे के कानून का पालन करना और इन विवो microvasculature में की ज्यामिति कि नकल माइक्रोवैस्कुलर biomimetic प्रणालियों, और कतरनी तनाव विविधताओं डिजाइन करने के लिए अनुमति देता है गढ़े में कम से कम किया जा सकता है microfluidic चैनल नेटवर्क.

शारीरिक रक्त microvessels 30-300 माइक्रोन के बीच 30 त्रिज्या के साथ एक लगभग परिपत्र पार अनुभाग अपनाने. इस पत्र में प्रदर्शन microchannel के नेटवर्क के लिए आयाम विभिन्न शाखाओं के स्तर पर 60 माइक्रोन से 100 माइक्रोन के आसपास विविध थे. विवो microvessels में नकल उतार के लिए व्यास के विभिन्न श्रृंखला के साथ microchannels के निर्माण करने के लिए, हम विरोध एकल काता परत reflow के उपयोग करने की सलाह देते हैं (30 माइक्रोन तक सीमित) या अन्य कम चिपचिपापन तैयार नहीं. एक बड़ा व्यास (30-60 माइक्रोन) के साथ एक microchannel लिए, एक डबल कोटिंग प्रक्रिया एक मोटा photoresist फिल्म पाने के लिए लागू किया जा सकता15. स्पिन कोटिंग्स दो परतों के ऊपर अतिरिक्त एक गलत जोखिम खुराक में परिणाम कर सकते हैं जो असमान फिल्म मोटाई, को रोकने के लिए बचा जाना चाहिए. 60 माइक्रोन से ऊपर एक फिल्म मोटाई के लिए, अन्य उच्च चिपचिपा reflow के photoresists सिफारिश कर रहे हैं.

एक आदर्श स्थिति में, निर्माण करने के लिए एक एक semicircular पार अनुभाग के साथ मोल्ड विरोध, फिल्म मोटाई शुरू में microchannel की एक आवश्यक चौड़ाई और फोकल लंबाई के रूप में देने से पूर्व निर्धारित किया जा सकता है समीकरण 4 , जहां एच आवश्यक काता फिल्म मोटाई है, आर चैनल चौड़ाई का आधा है, आर वक्रता की लगातार त्रिज्या है, ज वक्रता की केंद्रीय ऊंचाई है, और ई से पहले और बाद microchannel की मात्रा विरोध का अनुपात है 31 reflowing. Microchannel की दी चौड़ाई का एक बेलनाकार सतह के लिए, विरोध की एक खास मात्रा पुनः हैकरनी. हालांकि, कई मापदंडों, पुनः प्रवाहित photoresist को प्रभावित करते हैं और इस तरह के photoresist और ठोस सब्सट्रेट, reflow प्रक्रिया के लिए reflow पाक, तापमान और समय के दौरान सामग्री वाष्पीकरण के बीच महत्वपूर्ण कोण और सीमा आंदोलन के रूप में हुई चैनल प्रोफाइल और अधिक जटिल बनाने के लिए सूचित किया गया है , outgassing सब्सट्रेट एकरूपता, और गुण 32-34 विरोध. उदाहरण के लिए, reflow के तापमान और समय सीमा के आंदोलन के कारण एक मात्रा परिवर्तन में परिणाम और इसलिए महत्वपूर्ण कोण और अंतिम प्रोफाइल 33 विरोध पुनः प्रवाहित अलग कर सकते हैं. जैसा कि हमारे पिछले काम 15 द्वारा रिपोर्ट, reflow प्रक्रिया क्योंकि photoresist मात्रा में कटौती और सीमा आंदोलन की औसतन 2% से चैनल चौड़ाई कम किया है. इसके अलावा, एक बेलनाकार सतह प्राप्त करने के लिए मात्रा reflow प्रक्रिया 35,36 दौरान सामग्री वाष्पीकरण के प्रभाव के लिए भत्ता बनाने की जरूरत है. अलग त्रिज्या के साथ बेलनाकार सतहों के माध्यम से आवश्यक हैंएक microchannel नेटवर्क नेटवर्क 15 में विभिन्न क्षेत्रों में संस्करणों में बदलाव, जिसके परिणामस्वरूप microchannels की चौड़ाई भिन्न करने के लिए यह आवश्यक है. सफलतापूर्वक अलग व्यास, चौड़ाई / संस्करणों, reflow के तापमान और समय, महत्वपूर्ण कोण, सीमा आंदोलन, viscosities और स्पिन कोटिंग प्रोटोकॉल का विरोध, और सब्सट्रेट गुणों को तैयार नहीं माना जाता है और परीक्षण किया जाना चाहिए के साथ एक बेलनाकार चैनल नेटवर्क बनाना.

2. लंबे समय तक सेल संस्कृति

प्रवाह और संबद्ध दीवार कतरनी तनाव के महत्व को अच्छी तरह से एन्दोथेलिअल जीव विज्ञान को विनियमित करने में पहचाना गया है. इस तरह के सेल आकार और अभिविन्यास, स्राव और संगठन, प्रसार और भेदभाव में परिवर्तन, intracellular संकेतन, cytoskeleton के प्रोटीन के उत्पादन और जीन अभिव्यक्ति, पोत परिपक्वता और संरचना, और बाधा कार्यों 37-47 उत्प्रेरण जैसे क्षेत्रों में देखा गया है. अंत बनाने के लिए इन विट्रो तरीकों में वर्तमानothelial ट्यूब आम तौर पर 'endothelial कोशिकाओं पर भरोसा (ईसीएस) के साथ या बाह्य मैट्रिक्स (ईसीएम) (प्रकार मैं कोलेजन, आतंच, या Matrigel) 48-54 में mesenchymal कोशिकाओं के बिना आत्म संगठन. इन संस्कृतियों सफलतापूर्वक कई माइक्रोवैस्कुलर व्यवहार, वांछित स्थानिक reproducibility और अभिविन्यास की कमी morphogenesis के एक यादृच्छिक प्रक्रिया के माध्यम से बनाई कृत्रिम जहाजों मॉडलिंग की है हालांकि. इन आत्म इकट्ठे वाहिकाओं आसानी बाधा कार्य करता है और लंबे समय तक नाड़ी स्थिरता के लिए इंजीनियरिंग रक्त वाहिकाओं के लिए एक चुनौती खड़ी, एक 3 डी ट्यूबलर संगठन 55 से luminal प्रवाह गठबंधन नहीं है क्योंकि इसके अतिरिक्त, माइक्रोवैस्कुलर स्थिरता पर प्रवाह के प्रभाव को काफी हद तक अनजान बनी हुई है.

सिस्टम microfluidic जैव रासायनिक और जैविक विश्लेषण 56,57 की एक किस्म के प्रवाह को शुरू करने के लिए व्यावहारिक और उपयोगी साबित किया है. हमारा दृष्टिकोण संवर्धित कोशिकाओं से अधिक तरल पदार्थ का प्रवाह शुरू करने के लिए एक सुविधाजनक तरीका प्रदान करता है. हम एक प्रयोग किया जातालंबी अवधि के सेल संस्कृति के लिए microchannels (4 दिन और 2 सप्ताह के बीच) के माध्यम से एक सुविधाजनक अभी तक स्थिर और सटीक प्रवाह नियंत्रण हासिल करने के लिए उन्नत रिमोट नियंत्रित सिरिंज पंप.

3. चिप में सेल संस्कृति

PDMS microchannels की प्लाज्मा की मदद से ऑक्सीकरण आगे प्रोटीन कोटिंग्स में सतह हाइड्रोफिलिक और एड्स renders जो सतहों पर silanol समूहों (SiOH) का परिचय. अलग ईसीएम प्रोटीन (फ़ाइब्रोनेक्टिन, जिलेटिन, और कोलेजन) सेल लगाव के लिए परीक्षण किया गया है, और सबसे अच्छा परिणाम फ़ाइब्रोनेक्टिन कोटिंग हो पाया था. HUVECs 3 x 10 6 कोशिकाओं / बोने के लिए 8% dextran (70 केडीए) के साथ पूरक संस्कृति मीडिया में एमएल के एक एकाग्रता में तैयार किए गए थे. Dextran ईसीएस के घनत्व बोने पर ठीक नियंत्रण सक्षम करने के लिए मीडिया की चिपचिपाहट बढ़ जाती है.

एक मिला हुआ monolayer की एक निरंतर मध्यम प्रवाह से अवगत कराया जा रहा है HUVECs के 2-4 दिनों के बीच विकसित किया गया था. बाद कोशिकाओं कल्पनासेल संस्कृति, हम झिल्ली धुंधला और नाभिक धुंधला रंगों के साथ कोशिकाओं लेबल, इन रंगों कम cytotoxicity 58 प्रदर्शन किया. हम चिप में सभ्य एक पक्षपाती monolayer के रूप में कोशिकाओं दाग. एक पूरा 1x पीबीएस धोने चिप के अंदर फंस अतिरिक्त रंगों को रोकने के लिए आवश्यक है.

सारांश में, reflow के photoresist तकनीक और PDMS प्रतिकृति के संयोजन से, विकसित बहु गहराई microchannel के नेटवर्क के एक परिपत्र सतह से approximated और प्रत्येक विभाजन पर चैनल व्यास लगभग मरे के नियम का पालन किया गया था. विभिन्न शाखाओं के स्तर पर कतरनी तनाव विविधताओं गढ़े microfluidic चैनल नेटवर्क में कम से कम किया जा सकता है. इसके अलावा, सेल संस्कृति से परिणाम endothelial कोशिकाओं के स्वस्थ हालत का संकेत दिया. इस प्रकार, विकसित endothelialized microchannels पर एक चिप mimics जो परिपत्र पार के अनुभागीय बहु - शाखाओं में बंटी और multidepth microchannel के नेटवर्क बनाने के लिए एक तेजी से और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य दृष्टिकोण प्रदान करता हैविवो microvessels में की ज्यामिति. प्रक्रिया उन्नत micromanufacturing और एक दीर्घकालिक, सतत छिड़काव नियंत्रण के साथ ही उच्च गुणवत्ता और वास्तविक समय इमेजिंग क्षमता के साथ एक microvasculature मॉडल बनाने के लिए microfluidic प्रौद्योगिकी में अद्वितीय क्षमताओं का उपयोग दिखाता है. कोशिका जीव विज्ञान, ऊतक इंजीनियरिंग, और bioengineering अनुप्रयोगों के लिए microfluidic चैनलों की बढ़ती उपयोगिता के साथ, endothelialized microchannels पर एक चिप माइक्रोवैस्कुलर अनुसंधान के लिए एक संभावित परख है.

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Disclosures

लेखकों वे कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों की है कि घोषित.

Acknowledgments

इस शोध आंशिक रूप से राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन (NSF 1227359), क्रमश: राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन (ईपीएस-1003907), राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन (1007978) द्वारा प्रायोजित WVU अग्रिम कार्यालय, और WVU PSCoR द्वारा वित्त पोषित WVU EPSCoR कार्यक्रम द्वारा समर्थित किया गया था. microfabrication काम WVU साझा रिसर्च सुविधाएं (cleanroom सुविधाएं) और पश्चिम वर्जीनिया विश्वविद्यालय में चिप प्रयोगशाला (माइक्रोचिप लैब) पर Microfluidic एकीकृत सेलुलर अनुसंधान में किया गया था. confocal इमेजिंग WVU माइक्रोस्कोप इमेजिंग सुविधा पर किया गया था.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagent/Material
Reflow Photoresist AZ Electronic Materials AZP4620
Developer AZ Electronic Materials AZ 400K
PDMS Dow Corning Corporation Sylgard 184
MCDB 131 Culture Medium Invitrogen 10372-019
NacBlue Nuclei Staining Invitrogen H1399
PKH Red Stain Sigma MINI26 and PKH26GL
Fibronectin Gibco PHE0023
L-Glutamine Sigma G7513
Phosphate Buffered Saline Invitrogen 14040-133
HEPES Buffered Saline Solution Lonza CC-5024
Trypsin/EDTA Invitrogen 25300-062
Trypsin Neutralizing Solution Lonza CC-5002
PDMS Curing Agent Dow Corning Corporation Sylgard 184
Primary Human Umbilical Vein Endothelial Cells Lonza CC-2517
Fetal Bovine Serum Lonza 14-501F
Diluent C Sigma CGLDIL
Hoechst33342 Invitrogen, Molecular Probes R37605
Dextran Sigma 95771
3.5% Paraformaldehyde Electron Microscopy Science 15710-S
Equipment
Spinner Laurell Technologies Corporation WS-400BZ-6NPP/LITE
Desiccator BelArt Products 999320237
Inverted Microscope Nikon Eclipse Ti
Syringe Pump System Harvard Apparatus PHD Ultra
Laminar Biosafety Hood Thermo Scientific 1300 Series A2
Planetary Centrifugal Mixer Thinky ARE-310
Isotemp Oven Fisher Scientific 13-246-516GAQ
Optical Microscope Zeiss Invertoskop 40C
Plasma Cleaner Harrick Plasma PDC-32G
Hotplate Barnstead/Thermolyne Cimarec SP131635
Laser Scanning Confocal Microscope Zeiss LSM 510

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जैव अभियांत्रिकी अंक 80 जैव अभियांत्रिकी ऊतक इंजीनियरिंग miniaturization Microtechnology Microfluidics reflow photoresist PDMS छिड़काव प्रवाह प्राथमिक endothelial कोशिकाओं
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Li, X., Mearns, S. M.,… More

Li, X., Mearns, S. M., Martins-Green, M., Liu, Y. Procedure for the Development of Multi-depth Circular Cross-sectional Endothelialized Microchannels-on-a-chip. J. Vis. Exp. (80), e50771, doi:10.3791/50771 (2013).

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