Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Procédure à suivre pour le développement de la multi-profondeur circulaire transversale endothélialisées microcanaux-on-a-chip

Published: October 21, 2013 doi: 10.3791/50771
Automatic Translation
1, 1, 2, 1
1Lane Department of Computer Science and Electrical Engineering, West Virginia University, 2Department of Cell Biology and Neuroscience, University of California at Riverside

Summary

Une plate-forme microcanaux-on-a-chip a été développé par la combinaison de la technique de photolithographie reflowable de résine photosensible, lithographie douce, et la microfluidique. La plate-forme de micro-canaux endothélialisée imite la géométrie en trois dimensions (3D) des microvaisseaux in vivo, fonctionne sous débit de perfusion continue contrôlée, permet l'imagerie de haute qualité et en temps réel et peut être appliqué pour la recherche microvasculaire.

Abstract

Des efforts ont été concentrés sur le développement des essais in vitro pour l'étude des micro-vaisseaux parce que in vivo les études animales sont plus chronophage, coûteux, et l'observation et la quantification sont très difficiles. Cependant, classique dans des essais in vitro microvaisseaux ont des limites lorsqu'il s'agit de représenter in vivo microvaisseaux par rapport à la géométrie en trois dimensions (3D) et fournir un flux continu de fluide. En utilisant une combinaison de la technique de photolithographie reflowable de résine photosensible, lithographie douce, et microfluidique, nous avons développé une multi-profondeur endothélialisées transversales circulaires microcanaux-on-a-chip, qui imite la géométrie 3D in vivo microvaisseaux et fonctionne sous perfusion continue contrôlée écoulement. Une résine photosensible refusionnable positif a été utilisé pour fabriquer un moule maître à un réseau de microcanaux de section transversale semi-circulaire. Par l'alignement et le collage des deux (PDMS) microcanaux polydiméthylsiloxane replicated du moule maître, un réseau de micro-canal cylindrique a été créé. Les diamètres des microcanaux peuvent être bien contrôlés. De plus, la veine ombilicale cellules endothéliales humaines primaires (HUVEC) ensemencées à l'intérieur de la puce ont montré que les cellules alignées de la surface intérieure des micro-canaux sous perfusion contrôlée durant pendant une période de temps entre 4 jours à 2 semaines.

Introduction

Microvaisseaux, comme une partie du système de circulation, la médiation des interactions entre le sang et les tissus, soutenir les activités métaboliques, définir microenvironnement tissulaire et jouent un rôle essentiel dans de nombreuses conditions pathologiques et de santé. Récapitulation des microvaisseaux fonctionnelles in vitro pourrait fournir une plate-forme pour l'étude des phénomènes vasculaires complexes. Cependant, classique dans des essais microvaisseaux in vitro, tels que les tests endothéliales de cellules de migration, des tests de formation de tubes endothéliaux et des analyses d'anneau aortique chez le rat et la souris, sont incapables de recréer in vivo microvaisseaux par rapport à trois dimensions géométrie (3D) et le contrôle de flux continu 1-8. Les études de microvaisseaux utilisant des modèles animaux et in vivo, comme test cornée de l'angiogenèse, essai d'angiogenèse de la membrane chorio poussin, et le dosage de Matrigel, sont plus de temps, un coût élevé, difficile en ce qui concerne l'observation et quantifications, etsoulever des questions éthiques 1, 9-13.

Les progrès de la microfabrication et technologies de puces microfluidiques ont permis à une variété de points de vue en sciences biomédicales tout en réduisant les coûts d'expérimentation élevés et la complexité associés aux animaux et in vivo études 14, tels que les conditions biologiques contrôlées facilement et solidement et des environnements fluides dynamiques, qui n'auraient pas été possible avec les techniques conventionnelles macroscopique.

Ici, nous présentons une approche pour construire un endothélialisée microcanaux-on-a-chip qui imite la géométrie 3D in vivo microvaisseaux et fonctionne sous débit de perfusion continue contrôlée en utilisant la combinaison de la technique de photolithographie reflowable de résine photosensible, lithographie douce, et la microfluidique.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Photolithographie Fabrication de Photoresist moule maître

Le protocole suivant montre le processus pour fabriquer des microcanaux avec des diamètres compris entre 30-60 um. Pour obtenir un micro-canal avec un diamètre plus faible (inférieure à 30 pm), un seul dépôt par centrifugation de résine photosensible est nécessaire.

  1. Transférer la résine photosensible de refusion du réfrigérateur à 4 ° C à la salle blanche 24 heures avant de l'utiliser et de le laisser se réchauffer à température ambiante.
  2. Nettoyer une plaquette de silicium et faire cuire pendant une heure à 150 ° C pour lui permettre de se déshydrater. La déshydratation va aider l'adhérence de résine photosensible sur le substrat de silicium.
  3. Spin-couche de la première couche de résine photosensible en utilisant la formulation suivante:
Étape Temps (en secondes) Vitesse (rpm) Accélération
1 2 </ Td> 300 le plus haut
2 10 0
3 3 300 le plus haut
4 60 600 le plus haut
5 10 500 le plus haut
6 10 600 le plus haut
  1. Ensuite, cuire la plaquette sur une plaque chauffante à une température de 110 ° C pendant 90 sec. Après la cuisson douce de l'épaisseur de la résine photosensible sera de 20 à 30 um.
  2. Spin couche une seconde couche de résine photosensible suivant la même recette utilisée pour la première couche.
  3. Doux cuire la galette à nouveau en le plaçant sur une plaque de cuisson avec une température de 110 ° C pendant 90 secondes. Après cette cuisson douce de l'épaisseur de la résine photosensible sera de 40 à 60 um.
  4. Générer les maîtres-modèles positifs en exposant le PhotoRESIST à la lumière UV avec une dose d'exposition de 14 500 mJ / cm 2 à travers un masque de film.
  5. Diluer le développeur avec déminéralisée (DI) de l'eau (1:2 (v / v)). Rincer la plaquette à plusieurs reprises dans la solution jusqu'à ce que le motif est complètement développée. Ensuite laver la plaquette avec de l'eau DI et le sécher à l'aide d'azote gazeux.
  6. Refusion: La place de la plaquette sur une plaque de cuisson avec une température de 120 ° C pendant 4 min et couvrir avec une boîte de Pétri en verre pour éviter l'évaporation du solvant. Retirer la plaque de la plaque de cuisson et laisser refroidir à température ambiante. L'épaisseur de résine photosensible après refusion sera 50-60 um.

2. Doux Lithographie Fabrication de PDMS Réseau Microchannel

  1. Préparer une solution de polydiméthylsiloxane (PDMS) sur le rapport en poids de 10:01 (base: agent de réticulation) et la mélanger à fond l'aide d'un malaxeur centrifuge planétaire.
  2. Moulage la solution PDMS sur le moule maître de résine photosensible refondue. Placez le PDMS coulé dans un dessiccateur pendant 15 min pour dégazer. Utilisez de l'azote gazeux pour éliminer les bulles restantes si nécessaire.
  3. Cuire le PDMS dans un four à une température de 60 ° C pendant 3 heures pour lui permettre de guérir. Ensuite, retirer la couche de PDMS durci du moule maître.
  4. Utilisation d'un perforateur aiguisée pour créer d'entrée / sortie par les trous des trous dans le réseau de canaux de perforation. Nettoyer la surface du PDMS en utilisant de l'azote gazeux.
  5. Traiter les deux couches PDMS avec un plasma d'oxygène pendant 30 secondes à l'intérieur d'un filtre à plasma à une pression de service de 4,5 x 10 -2 Torr et d'un débit d'oxygène de 3,5 m 3 / min. Ensuite, aligner les surfaces du PDMS manuellement sous un microscope optique. Utilisez une goutte d'eau si nécessaire pour un meilleur contrôle de l'alignement.
  6. Cuire le dispositif dans un four à 60 ° C pendant 30 min pour obtenir une liaison permanente.

3. Culture HUVEC et ensemencement dans la puce

  1. Culture des HUVECs avec un milieu de culture avec L-glutamine complété avec 10% de sérum de veau fœtal (FBS). Pour èmee passages d'expérience entre 2 et 5 ont été utilisés.
  2. Une fois que les HUVEC sont confluentes, compter les cellules et les récolter en premier rinçage des cellules avec une solution saline tamponnée HEPES (HEPES-BSS), puis traiter les cellules avec de la trypsine / EDTA et incuber pendant 2-6 min à 37 ° C. Après le traitement à la trypsine est terminée, neutraliser la trypsine / EDTA avec une solution neutralisante trypsine. Centrifugeuse et les cellules en suspension dans un milieu de culture avec 8% de dextran pour les recueillir. Le dextran est utilisé pour augmenter la viscosité du milieu pour faciliter une meilleure ensemencement des cellules et d'attachement.
  3. Traiter le dispositif avec un plasma d'oxygène pendant 5 min avec une pression de service de 4,5 x 10 -2 Torr et d'un débit d'oxygène de 3,5 m 3 / min. Puis charger l'appareil avec de l'eau DI et de traiter avec la lumière UV pendant 8 heures dans une hotte laminaire biosécurité pour la stérilisation.
  4. Un jour avant que les cellules sont prêtes, laver l'appareil avec 1x tampon phosphate salin (PBS 1x) puis les enrober avec la fibronectine (100 pg / ml, dilbué avec 1x PBS) et incuber dans le réfrigérateur à 4 ° C pendant la nuit.
  5. Après le revêtement fibronectine, laver l'appareil avec PBS 1x charger puis avec un milieu de culture. Incuber le dispositif à une température de 37 ° C pendant 15 min.
  6. Charger les cellules HUVEC dans un milieu de culture de 8% de dextran à une concentration de cellules de 10 6 cellules / ml 4.3 x. Placer une goutte de 20 pl de cellules à une entrée du dispositif et de l'incliner pour introduire les cellules dans le canal microfluidique. Après 15 à 20 minutes, les cellules commencent à se fixer sur les parois latérales des canaux. Faites pivoter l'appareil toutes les 15 minutes pour créer une distribution plus uniforme des cellules. Si nécessaire, une charge supplémentaire peut être effectuée.

4. Configuration de perfusion à long terme

Après 5-6 h de culture statique, les HUVECs attachées vont commencer à se répandre pleinement. Mettre en place une perfusion à l'aide d'un système de pompe à seringue avec télécommande et un flux constant de 10 l / h. Perfusion peut être ajustée fou une vitesse d'écoulement plus élevée, et qui peut durer pendant une période de temps entre 4 jours à 2 semaines.

5. coloration des cellules et caractérisation de microscope

  1. Lorsque les cellules atteignent la confluence intérieur de l'appareil, d'une part, laver l'appareil avec 1x PBS pour éliminer complètement le milieu. Puis charger l'appareil avec un colorant rouge dilué avec le diluant (4 pi-1 ml). Chargez le colorant similaire à la procédure de chargement de la cellule. Incuber le dispositif à l'obscurité pendant 5 min à température ambiante, puis laver le dispositif à milieu de culture pour empêcher la formation de taches. Longue période d'incubation de la teinture peut provoquer une toxicité cellulaire et disadhesion.
  2. Chargez l'appareil avec un colorant bleu dilué avec PBS 1x (2 gouttes par ml). Incuber dans l'obscurité pendant 5 min à température ambiante, puis lavez soigneusement l'appareil avec 1x PBS.
  3. Examiner le marquage de cellules sous un microscope optique inversé. Si la coloration était bon, charger les microcanaux avec support de fixation (3,5% paraformaldéhyde dilué avec 1x PBS), puis plongezle dispositif de fixation à moyen et couvrir complètement avec du papier d'aluminium. Stocker l'appareil dans le réfrigérateur à une température de 4 ° C pour empêcher le dispositif de se dessécher et de photoblanchiment. Le dispositif fixe est maintenant prêt pour l'imagerie confocale, ce qui peut être fait par un microscope confocal à balayage laser.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Notre méthode pour fabriquer le réseau de microcanaux à plusieurs profondeur imite les géométries 3D complexes in vivo des microvaisseaux, dans lequel les micro-canaux ont des sections transversales arrondies 15. En outre, les diamètres des parents canaux de dérivation et les canaux de fille d'environ obéissent à la loi de Murray pour le maintien de l'écoulement du fluide à un niveau requis de sorte que la résistance globale du canal est faible et les vitesses d'écoulement sont plus uniformes dans tout le réseau 16-18. Les processus et les résultats pour la fabrication d'un moule maître de résine photosensible semi-circulaire et un réseau de microcanaux PDMS transversale circulaire ont été démontrées dans Movie 1, figure 2, et Movie 2, respectivement. Les caractéristiques géométriques du réseau de microcanaux PDMS ont été caractérisés et présentés dans la figure 2. Nos résultats montrent que la technique de refusion photosensible peut créer des réseaux multi-profondeur de branchement canal ina approche plus pratique en techniques de refusion résine photosensible, et permettre la conception des systèmes biomimétiques microvasculaires dont environ obéir à la loi de Murray.

Dans de nombreux modèles in vitro, les cellules vasculaires sont normalement cultivées sur des plaques planes, des filtres ou ces substrats revêtus hydrogels. Dans ces conditions, les microvaisseaux sont générés aléatoirement par cellulaire auto-assemblage. En outre, des analyses classiques ont des difficultés inhérentes à la réalisation d'un débit constant sur les cellules endothéliales. L'absence d'un flux de média à long terme et continue empêche la capacité de maintenir la stabilité de la monocouche de cellules endothéliales avec des fonctions de barrière appropriés. Dans notre modèle, le bénéfice de l'application de la microfluidique est la commodité de l'accès de fluide et de contrôle (des débits variables, la durée et les motifs), ainsi que de se débarrasser des déchets. Nous démontrons les processus de la veine ombilicale cellules endothéliales primaires humaines (HUVEC) semis dans les microcanaux et mis ting un système de perfusion liquide à long terme pour la culture cellulaire (Figure 3). En outre, en raison des géométries complexes in vivo microvasculaire, la surveillance en temps réel de ces petits vaisseaux est difficile. La puce basée PDMS développé offre de bonnes propriétés optiques et permet l'imagerie de haute qualité et en temps réel des microcanaux endothélialisées. (Figures 4 et le film 3)

Film 1. Procédés de fabrication schématiques pour moules maîtres résine photosensible. Initialement, un substrat de silicium préalablement nettoyé a été préparé. La couche de résine photosensible de refusion positive est appliquée par centrifugation sur le substrat de silicium et a été cuit et séché. La résine photosensible a été exposé à la lumière UV à travers un masque à motifs, et puis, les microcanaux motifs ont été développés. Un réseau de microcanaux de section transversale semi-circulaire a été créé après la refusion à 120 ° C pendant 4 min."target =" movie1.wmv _blank "> Cliquez ici pour voir le film.

Figure 1
Figure 1. MEB montre la résine photosensible développée a) avant refusion;. B) après la refusion, c) moulé PDMS montre la section transversale de la résine avant refusion; l'image montre une section transversale rectangulaire, d) moulé PDMS montrant une section transversale semi-circulaire de l' résister après refusion; La section après la refusion a été contrôlé par la conception initiale de dimension du motif et de la température de refusion. (Reproduit avec la permission de la référence 15). Cliquez ici pour agrandir la figure .

Movie 2. Les procédés de fabrication schématiques pour le réseau de microcanaux cylindrique PDMS. Une solution PDMS est coulé sur le moule de résine photosensible et durci dans le four à une température de 60 ° C pendant 3 heures. Deux couches identiques PDMS guéris, dont chacun dispose d'un réseau de microcanaux de section transversale semi-circulaire, ont été alignées et collées ensemble pour former des microcanaux avec des sections circulaires. Cliquez ici pour voir le film .

Figure 2
Figure 2. a) Un réseau microcanal cylindrique alignée et collée dans PDMS. bd) de section circulaire de moules PDMS montrent dimensions du canal de dérivation à chaque niveau (1-1 ', 2-2', et 3-3 '). En outre, ces chiffres montrent la création d'un réseau de multidepth canal microfluidique de section transversale circulaire et multibranching.

page = "always"> Figure 3
Figure 3. Schéma montrant la perfusion à long terme grâce à la puce en utilisant une pompe seringue télécommandé.

Figure 4
Figure 4. images de microscopie en utilisant un colorant fluorescent de la membrane cellulaire (rouge) et cellule à colorant (bleu) montrent nucléaire que la ligne HUVECs la surface intérieure d'un réseau de microcanaux cylindrique à différentes régions de branchement. a) Haut, b) Moyen-Orient, et c) Bottom. d) image microscopie confocale montre la vue en coupe transversale circulaire de HUVECs tapissent le réseau de canaux. barres d'échelle: 100 um.

Film 3. Du film confocale montrant la paroi de cellule le long du réseau de canal circulaire."target =" iles/ftp_upload/50771/50771movie3.wmv ​​_blank "> Cliquez ici pour voir le film.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

1. Maître fabrication de moule

L'un des principes directeurs pour la conception et la morphométrie vasculaire est connue comme la loi de Murray 16, qui stipule que la distribution de diamètre des vaisseaux dans tout le réseau est régi par des considérations d'énergie minimale. Il indique également que le cube des diamètres d'un vaisseau mère à une bifurcation est égale à la somme des cubes des diamètres des vaisseaux fille ( Équation 1 ) 19 En outre, la loi de Poiseuille a été utilisé pour estimer l'ampleur de la contrainte de cisaillement dans la plupart des vaisseaux comme Équation 2 . dans lequel1eq3.jpg "src =" / files/ftp_upload/50771/50771eq3.jpg "largeur =" 25px "/> est la contrainte de cisaillement hémodynamique, μ est la viscosité du sang, Q est le débit d'écoulement, et R est le rayon de la navire 20,21. Pour bifurcations symétriques, une conséquence importante sur la base de la loi de Murray et la loi de Poiseuille est que la contrainte de cisaillement à la paroi reste constante tout au long du réseau vasculaire. Ainsi, pour un symétrique réseau de canaux microfluidiques fabriqués avec des sections transversales circulaires, si le canal dimensions à la loi de bifurcations obéissez à Murray, la contrainte de cisaillement subie par les cellules endothéliales devraient être constante à différents canaux de dérivation.

Beaucoup de techniques et procédés de microfabrication ont été appliquées à la fabrication de microcanaux utilisés pour les cellules vasculaires 22-25, cependant, les microcanaux résultant ont donné lieu à section rectangulaire, carrée ou trapézoïdale des canaux. Les sections rectangulaires des canaux sont conconstruits avec des angles vifs et des transitions abruptes aux bifurcations, qui peuvent imposer très variables contraintes de cisaillement des fluides et des géométries non physiologiques sur des cellules dans différentes positions de canaux, ce qui entraîne des variations de physiologie cellulaire 26,27.

Un processus de refusion résine photosensible, résultant en un profil de canal arrondi, implique deux procédures, 1) la fusion de la résine photosensible à motifs et de résister aux liquides surfaces sont tirés dans une forme qui minimise l'énergie du système 28,29 et 2) un refroidissement et phase de solidification suit le processus de fusion. Les formes des canaux refusion sont bien estimés par une surface semi-cylindrique. Suivie par refusion maître fabrication de moule, une approche de lithographie douce standard a été utilisé pour fabriquer le réseau PDMS microfluidique canal avec une section transversale circulaire. Nos résultats ont montré que la technique de refusion photosensible peut créer de branchement des réseaux de microcanaux multi-profondeur dans une plus straight approche vers l'avant, et nous permet de concevoir des systèmes biomimétiques microvasculaires qu'environ obéir à la loi de Murray et imitent la géométrie in vivo microvasculaire, de sorte que la résistance globale du canal est faible, et les variations de la contrainte de cisaillement à différents niveaux de branchement peuvent être minimisés dans le fabriquée réseau de canaux microfluidique.

Les micro-vaisseaux sanguins physiologiques adopter une section transversale sensiblement circulaire avec des rayons compris entre 30 à 300 um 30. Les dimensions du réseau de microcanaux démontré dans ce document ont été variées autour de 60 pm à 100 pm à différents niveaux de branchement. Pour fabriquer des microcanaux avec différentes gammes de diamètres pour mimer in vivo microvaisseaux, nous vous recommandons d'utiliser unique refusion de la couche filée résister (limité à 30 um) ou autre viscosité plus faible résistance. Pour un micro-canal avec un diamètre plus grand (30 à 60 pm), une procédure de double revêtement peut être appliqué pour obtenir un film de résine photosensible épaisse15. Supplémentaires spin-revêtements-dessus de deux couches doit être évitée afin de prévenir l'épaisseur du film non uniforme, ce qui peut entraîner une dose d'exposition inexactes. Pour une épaisseur de couche au-dessus de 60 microns, d'autres résines photosensibles de refusion visqueux élevés sont recommandés.

Dans un état idéal, pour la fabrication d'un moule avec une section transversale semi-circulaire de résist, l'épaisseur du film peut être initialement prédéterminée, en donnant une largeur requise et la distance focale du microcanal que L'équation 4 , Où H est l'épaisseur tourné à film requise, r est égal à la moitié de la largeur de canal, R est le rayon de courbure constant, h est la hauteur centrale de la courbure, et E est le rapport de résister volumes du microcanal avant et après refusion 31. Pour une surface cylindrique d'une largeur donnée du microcanal, un volume particulier de la résine est rerequise. Cependant, plusieurs paramètres ont été rapportés à affecter la résine photosensible refusion et de faire les profils de canal entraîné plus complexes, tels que l'angle critique et le mouvement de séparation entre la résine photosensible et le substrat solide, l'évaporation de la matière lors de la cuisson par refusion, de la température et de synchronisation pour le processus de refusion, dégazage, l'uniformité du substrat, et de résister à des propriétés de 32 à 34. Par exemple, la température de refusion et le calendrier peuvent entraîner un changement de volume provoquant le déplacement de la limite et donc faire varier l'angle critique et dernière refondu résister à profil 33. Tel que rapporté par notre travail antérieur 15, le processus de refusion réduit les largeurs de canal de 2% en moyenne en raison de la diminution des volumes de résine photosensible et mouvements de frontière. En outre, le volume pour obtenir une surface cylindrique doit tenir compte de l'effet de l'évaporation du matériau pendant le processus de refusion 35,36. Si les surfaces cylindriques de rayons différents sont nécessaires à traversun réseau de microcanaux, il est nécessaire de faire varier la largeur des microcanaux, ce qui entraîne des variations dans les volumes à des régions différentes du réseau 15. Pour fabriquer avec succès un réseau de canaux cylindriques de différents diamètres, l'résiste largeurs / volumes, les températures de refusion et le calendrier, les angles critiques, le mouvement de frontière, de résister viscosités et les protocoles de spin coating et les propriétés du substrat doivent être examinés et testés.

2. Culture cellulaire long terme

L'importance de l'écoulement et la paroi contrainte de cisaillement associée a été bien reconnu dans la régulation de la biologie endothéliale. On l'a vu dans des domaines comme induisant des changements dans la forme des cellules et de l'orientation, la sécrétion et de l'organisation, de la prolifération et de la différenciation, de la signalisation intracellulaires, la production de protéines du cytosquelette et de l'expression des gènes, la maturation et la structure navire, et des fonctions de barrière 37-47. Le courant des méthodes in vitro pour former fintubes othelial s'appuient généralement sur ​​les cellules endothéliales "(ECS) l'auto-organisation, avec ou sans cellules mésenchymateuses dans la matrice extracellulaire (MEC) (collagène de type I, la fibrine, ou Matrigel) 48-54. Bien que ces cultures ont réussi à modéliser plusieurs comportements microvasculaires, les vaisseaux artificiels formés par un processus aléatoire de la morphogenèse n'ont pas la reproductibilité spatiale souhaitée et l'orientation. En outre, l'impact de la circulation sur la stabilité microvasculaire reste largement inconnu parce que ces navires auto-assemblées ne sont pas facilement combiner flux luminal avec une organisation tubulaire 3D de 55, ce qui pose un défi aux vaisseaux sanguins d'ingénierie pour des fonctions de barrière et la stabilité vasculaire à long terme.

Les systèmes microfluidiques sont révélés être pratique et utile pour l'introduction de flux à une variété d'analyses biochimiques et biologiques 56,57. Notre approche offre un moyen pratique d'introduire écoulement de fluide sur les cellules en culture. Nous avons utilisé unavancé pompe à distance de la seringue pour atteindre une régulation du débit pratique encore stable et précise à travers les microcanaux pour la culture cellulaire à long terme (entre 4 jours et 2 semaines).

3. Culture cellulaire dans la puce

Oxydation assistée par plasma des microcanaux en PDMS introduit des groupes silanol (SiOH) sur les surfaces qui rend la surface hydrophile et les aides à d'autres revêtements de protéines. Différentes protéines de la MEC (fibronectine, la gélatine et le collagène) ont été testés pour la fixation des cellules, et le meilleur résultat a été jugée revêtement fibronectine. Les HUVEC ont été préparées à une concentration de 3 x 10 6 cellules / ml dans un milieu de culture additionné de 8% dextran (70 kDa) pour l'ensemencement. Dextran augmente la viscosité des médias pour permettre un contrôle précis de la densité d'ensemencement des EC.

Une monocouche confluente a été développé entre 2-4 jours des HUVECs étant exposés à un débit moyen constant. Pour visualiser les cellules après l'la culture de cellules, on étiqueté cellules avec une coloration de la membrane et des colorants de coloration des noyaux, ces colorants présentent une cytotoxicité inférieure 58. Nous avons coloré les cellules en une monocouche adhérente en culture dans la puce. A 1x PBS lavage complet est nécessaire pour éviter les colorants supplémentaires piégés à l'intérieur de la puce.

En résumé, par la combinaison de refusion technique photosensible et la réplication PDMS, le réseau de microcanaux multi-profondeur développée a été approchée par une surface circulaire et les diamètres des canaux à chaque bifurcation environ obéir à la loi de Murray. Les variations de contrainte de cisaillement à différents niveaux de branchement peuvent être minimisés dans le réseau de canaux microfluidique fabriqué. En outre, les résultats issus de la culture cellulaire indiquaient la bonne santé des cellules endothéliales. Ainsi, les microcanaux-on-a-chip endothélialisées développés fournit une approche rapide et reproductible pour créer circulaire transversale multi-succursales et les réseaux de microcanaux multidepth, qui imite l'géométrie in vivo microvaisseaux. La procédure illustre l'utilisation des capacités uniques en microfabrication de pointe et des technologies microfluidiques pour créer un modèle microvascularisation avec une longue durée, contrôle de la perfusion continue ainsi que de haute qualité et en temps réel la capacité d'imagerie. Avec l'utilitaire croissant de canaux microfluidiques pour la biologie cellulaire, l'ingénierie tissulaire, et les applications de bio-ingénierie, les microcanaux-on-a-chip endothélialisées est un test potentiel pour la recherche microvasculaire.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Les auteurs déclarent qu'ils n'ont aucun intérêt financier concurrents.

Acknowledgments

Cette recherche a été financée en partie par la National Science Foundation (NSF 1227359), programme EPSCoR WVU financé par la National Science Foundation (EPS-1003907), bureau ADVANCE WVU parrainé par la National Science Foundation (1007978), et WVU PSCoR, respectivement. Les travaux de microfabrication a été fait dans WVU partagé des installations de recherche (équipements pour salles blanches) et de la recherche intégrative cellulaire microfluidique Laboratoire Chip (puce Lab) de l'Université West Virginia. L'imagerie confocale a été faite à WVU Imaging Facility de microscope.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagent/Material
Reflow Photoresist AZ Electronic Materials AZP4620
Developer AZ Electronic Materials AZ 400K
PDMS Dow Corning Corporation Sylgard 184
MCDB 131 Culture Medium Invitrogen 10372-019
NacBlue Nuclei Staining Invitrogen H1399
PKH Red Stain Sigma MINI26 and PKH26GL
Fibronectin Gibco PHE0023
L-Glutamine Sigma G7513
Phosphate Buffered Saline Invitrogen 14040-133
HEPES Buffered Saline Solution Lonza CC-5024
Trypsin/EDTA Invitrogen 25300-062
Trypsin Neutralizing Solution Lonza CC-5002
PDMS Curing Agent Dow Corning Corporation Sylgard 184
Primary Human Umbilical Vein Endothelial Cells Lonza CC-2517
Fetal Bovine Serum Lonza 14-501F
Diluent C Sigma CGLDIL
Hoechst33342 Invitrogen, Molecular Probes R37605
Dextran Sigma 95771
3.5% Paraformaldehyde Electron Microscopy Science 15710-S
Equipment
Spinner Laurell Technologies Corporation WS-400BZ-6NPP/LITE
Desiccator BelArt Products 999320237
Inverted Microscope Nikon Eclipse Ti
Syringe Pump System Harvard Apparatus PHD Ultra
Laminar Biosafety Hood Thermo Scientific 1300 Series A2
Planetary Centrifugal Mixer Thinky ARE-310
Isotemp Oven Fisher Scientific 13-246-516GAQ
Optical Microscope Zeiss Invertoskop 40C
Plasma Cleaner Harrick Plasma PDC-32G
Hotplate Barnstead/Thermolyne Cimarec SP131635
Laser Scanning Confocal Microscope Zeiss LSM 510

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Adair, T. H. Angiogenesis: Integrated systems physiology: from molecule to function to disease. , 1st edition, Biota Publishing. (2011).
  2. Goodwin, A. M. In vitro assays of angiogenesis for assessment of angiogenic and anti-angiogenic agents. Microvasc. Res. 74, 172-183 (2007).
  3. Smith, E. J., Staton, C. A. Tubule formation assays. Angiogenesis assays: A critical appraisal of current techniques. , John Wiley & Sons Ltd. West Sussex, UK. 65-87 (2006).
  4. Nakatsu, M. N., Davis, J. J., Hughes, C. C. W. Optimized fibrin gel bead assay for the study of angiogenesis. J. Vis. Exp. (3), e186 (2007).
  5. Nicosia, R. F., Ottinetti, A. Growth of microvessels in serum-free matrix culture of rat aorta. A quantitative assay of angiogenesis in vitro. Lab. Invest. 63, 115-122 (1990).
  6. Aplin, A. C., Fogel, E., Zorzi, P., Nicosia, R. F. The aortic ring model of angiogenesis. Methods Enzymol. 443, 119-136 (2008).
  7. Nicosia, R. F. The aortic ring model of angiogenesis: A quarter century of search and discovery. J. Cell. Mol. Med. 13, 4113-4136 (2009).
  8. Griffith, L. G., Swart, M. A. Capturing complex 3D tissue physiology in vitro. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 7, 211-224 (2006).
  9. Folkman, J. History of angiogenesis. Angiogenesis: An integrative approach from science to medicine. , Springer. (2008).
  10. Auerbach, R., Lewis, R., Shinners, B., Kubai, L., Akhtar, N. Angiogenesis assays: A critical overview. Clin. Chem. 49, 32-40 (2003).
  11. Auerbach, R., Akhtar, N., Lewis, R. L., Shinners, B. L. Angiogenesis assays: Problems and pitfalls. Cancer Metastasis Rev. 19, 167-172 (2000).
  12. Staton, C. A., Reed, M. W., Brown, N. J. A critical analysis of current in vitro and in vivo angiogenesis assays. Int. J. Exp. Pathol. 90, 195-221 (2009).
  13. Staton, C. A., Stribbling, S. M., et al. Current methods for assaying angiogenesis in vitro and in vivo. Int. J. Exp. Pathol. 85, 233-248 (2004).
  14. Moraes, C., Mehta, G., Lesher-Perez, S. C., Takayama, S. Organs-on-a-Chip: A focus on compartmentalized microdevices. Ann. Biomed. Eng. 40 (6), 1211-1227 (2012).
  15. Huang, Z., Li, X., Martins-Green, M., Liu, Y. Microfabrication cylindrical microfluidic channel networks for microvascular research. Biomedical Microdevices. 14 (5), 873-883 (2012).
  16. Murray, C. D. The physiological principle of minimum work applied to the angle of branching of arteries. J. Gen. Physiol. 9 (6), 835-841 (1926).
  17. Zamir, M., Medeiros, J. A. Arterial branching in man and monkey. J. Gen. Physiol. 79, 353-360 (1982).
  18. Gafiychuk, V. V., Lubashevsky, I. A. On the principles of the vascular network branching. J. Theor. Biol. 212, 1-9 (2001).
  19. Sherman, T. F. On connecting large vessels to small. The meaning of Murray's law. J. Gen. Physiol. 78 (4), 431-453 (1981).
  20. Kamiya, A., Bukhari, R., Togawa, T. Adaptive regulation of wall shear stress optimizing vascular tree function. Bull Math Biol. 46 (1), 127-137 (1984).
  21. LaBarbera, M. Principles of design of fluid transport systems in zoology. Science. 249, 992-1000 (1990).
  22. Emerson, D. R., Cieslicki, K., Gu, X., Barber, R. W. Biomimetic design of microfluidic manifolds based on a generalized Murray's law. Lab Chip. 6, 447-454 (2006).
  23. Lu, H., Koo, L. Y., et al. Microfluidic shear devices for quantitative analysis of cell adhesion. Anal. Chem. 76, 5257-5264 (2004).
  24. Shevkoplyas, S. S., Gifford, S. C., Yoshida, T., Bitensky, M. W. Prototype of an in vitro model of the microcirculation. Microvasc. Res. 65, 132-136 (2003).
  25. Kaihara, S., Borenstein, J., et al. Silicon micromachining to tissue engineer branched vascular channels for liver fabrication. Tissue Eng. 6, 105-117 (2000).
  26. Fisher, A. B., Chien, S., Barakat, A. I., Nerem, R. M. Endothelial cellular response to altered shear stress. Am. J. Physiol. Lung Cell. Mol. Physiol. 281 (3), L529-L533 (2001).
  27. Nerem, R. M., Alexander, R. W., et al. The study of the influence of flow on vascular endothelial biology. Am. J. Med. Sci. 316 (3), 169-175 (1998).
  28. Daly, D., Stevens, R. F., Hutley, M. C., Davies, N. The manufacture of microlenses by melting photoresist. Meas. Sci. Technol. 1 (8), 759-766 (1990).
  29. Schilling, A., Merz, R., Ossmann, C., Herzig, H. P. Surface profiles of reflow microlenses under the influence of surface tension and gravity. Opt. Eng. 39 (8), 2171-2176 (2000).
  30. Young, B., Heath, J. W. Wheater's functional histology: A text and colour atlas. , 4th edition, Churchill Livingstone. (2000).
  31. O'Neill, F. T., Sheridan, J. T. Photoresist reflow method of microlens production. Part 1: Background and experiments. Optik Int. J. Light Electron Opt. 113, 391-404 (2002).
  32. de Gennes, P. G. Wetting: statics and dynamics. Rev. Mod. Phys. 57, 827-863 (1985).
  33. Elias, H. G. An Introduction to Polymer Science. , VCH Publishers. New York. (1997).
  34. Voinov, O. V. Dynamic edge angles of wetting upon spreading of a drop over a solid surface. J. Appl. Mech. Tech. Phys. 40, 86-92 (1999).
  35. Daly, D., Stevens, R. F., Hutley, M. C., Davies, N. The manufacture of microlenses by melting photoresist. Meas. Sci. Technol. 1, 759 (1990).
  36. Jay, T. R., Stern, M. B. Preshaping photoresist for refractive microlens fabrication. Opt. Eng. 33, 3552-3555 (1994).
  37. Nerem, R. M., Alexander, R. W., et al. The Study of the influence of flow on vascular endothelial biology. Am. J. Med. Sci. 316 (3), 169-175 (1998).
  38. Chien, S., Li, S., Shyy, Y. J. Effects of mechanical forces on signal transduction and gene expression in endothelial cells. Hypertension. 31, 162-169 (1998).
  39. Li, Y. S., Haga, J. H., Chien, S. Molecular basis of the effects of shear stress on vascular endothelial cells. J. Biomech. 38, 1949-1971 (2005).
  40. Lee, E. J., Vunjak-Novakovic, G., Wang, Y., Niklason, L. E. A biocompatible endothelial cell delivery system for in vitro tissue engineering. Cell Transplant. 18, 731-743 (2009).
  41. Lee, E. J., Niklason, L. E. A novel flow bioreactor for in vitro microvascularization. Tissue Eng. Part C Methods. 16, 1191-1200 (2010).
  42. Chau, L., Doran, M., Cooper-White, J. A novel multishear microdevice for studying cell mechanics. Lab Chip. 9, 1897-1902 (2009).
  43. Meeson, A., Palmer, M., Calfon, M., Lang, R. A relationship between apoptosis and flow during programmed capillary regression is revealed by vital analysis. Development. 122, 3929-3938 (1996).
  44. Van Royen, N. J., Piek, J., Schaper, W., Bode, C., Buschmann, I. Arteriogenesis: mechanisms and modulation of collateral artery development. J. Nucl. Cardiol. 8, 687-693 (2001).
  45. Schaper, W. Therapeutic arteriogenesis has arrived. Circulation. 104 (17), 1994-1995 (2001).
  46. Tarbell, J. M. Shear stress and the endothelial transport barrier. Cardiovas. Res. 87 (2), 320-330 (2010).
  47. Potter, C. M., Lundberg, M. H., et al. Role of shear stress in endothelial cell morphology and expression of cyclooxygenase isoforms. Arterioscler. Thromb. Vasc Biol. 31, 384-391 (2011).
  48. Montesano, R. In vitro rapid organization of endothelial cells into capillary-like networks is promoted by collagen matrices. J. Cell Biol. 97, 1648-1652 (1983).
  49. Darland, D. C., D'Amore, P. A. TGF beta is required for the formation of capillary-like structures in three-dimensional cocultures of 10T1/2 and endothelial cells. Angiogenesis. 4 (1), 11-20 (2001).
  50. Lawley, T. J., Kubota, Y. Induction to morphologic differentiation of endothelial cells in culture. J. Invest. Dermatol. 93, 59S-61S (1989).
  51. Kanzawa, S., Endo, H., Shioya, N. Improved in vitro angiogenesis model by collagen density reduction and the use of type III collagen. Ann. Plast. Surg. 30, 244-251 (1993).
  52. Davis, G. E., Bayless, K. J., Mavila, A. Molecular basis of endothelial cell morphogenesis in three-dimensional extracellular matrices. Anat. Rec. 268, 252-275 (2002).
  53. Velazquez, O. C., Snyder, R., Liu, Z., Fairman, R. M., Herlyn, M. Fibroblast-dependent differentiation of human microvascular endothelial cells into capillary-like 3-dimensional networks. FASEB J. 16, 1316-1318 (2002).
  54. Donovan, D., Brown, N. J., Bishop, E. T. Comparison of three in vitro human "angiogenesis" assays with capillaries formed in vivo. Angiogenesis. 4, 113-121 (2001).
  55. Tang, D. G., Conti, C. J. Endothelial cell development, vasculogenesis, angiogenesis, and tumor neovascularization: an update. Semin. Thromb. Hemost. 30, 109-117 (2004).
  56. Takayama, S., McDonald, J. C., et al. Patterning cells and their environments using multiple laminar fluid flows in capillary networks. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96, 5545-5548 (1999).
  57. Cho, B. S., Schuster, T. G., et al. Passively driven integrated microfluidic system for separation of motile sperm. Anal. Chem. 75, 1671-1675 (2003).
  58. Parsa, H., Upadhyay, R., Sia, S. K. Uncovering the behaviors of individual cells within a multicellular microvascular community. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108 (12), 5133-5138 (2011).

Tags

Bio-ingénierie Numéro 80 bio-ingénierie l'ingénierie tissulaire la miniaturisation microtechnique la microfluidique refusion résine photosensible PDMS le débit de perfusion les cellules endothéliales primaires
Procédure à suivre pour le développement de la multi-profondeur circulaire transversale endothélialisées microcanaux-on-a-chip
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Li, X., Mearns, S. M.,… More

Li, X., Mearns, S. M., Martins-Green, M., Liu, Y. Procedure for the Development of Multi-depth Circular Cross-sectional Endothelialized Microchannels-on-a-chip. J. Vis. Exp. (80), e50771, doi:10.3791/50771 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter