Summary
Bir mikro-on-a-chip platformu fotolitografik reflowable ışığa tekniği, yumuşak litografi ve Mikroakiskan kombinasyonu tarafından geliştirilmiştir. Endothelialized mikro platformu, in vivo mikrodamar içinde üç boyutlu (3D) geometrisi ile taklit eden sürekli perfüzyon kontrollü akış altında çalışan, yüksek kaliteli ve gerçek zamanlı görüntü sağlar ve mikrovasküler araştırma için uygulanabilir.
Abstract
In vivo hayvan çalışmaları daha zaman alıcı, pahalı ve gözlem ve miktar çok zor olduğu, çünkü çabaları mikrodamarlar çalışma için in vitro tayinlerde geliştirmeye odaklanmıştır. Üç boyutlu (3D) geometrisi ile ilgili in vivo kılcal temsil eden ve sürekli sıvı akışı sağlayan Ancak, in vitro mikro-damar tahlillerde geleneksel sınırlamaları vardır. Fotolitografik reflowable fotorezist tekniği, yumuşak litografi ve Mikroakiskan bir arada kullanarak, bir çok derinlemesine dairesel kesit endothelialized geliştirdik kontrollü sürekli perfüzyon altında in vivo mikrodamarlar içinde 3 boyutlu geometri taklit ve çalışan, mikro--a-chip akış. Pozitif reflowable ışığa yarım daire kesit Mikrokanallı ağı ile bir ana kalıp imal etmek kullanıldı. Repl iki polidimetilsiloksan (PDMS) mikro uyum ve yapıştırma tarafındanana kalıp gili, silindirik bir Mikrokanallı ağ oluşturuldu. Mikrokanalların çapları iyi kontrol edilebilir. Buna ek olarak, bir çip içerisinde tohumlanmıştır Primer insan göbek bağı damarı endotel hücrelerinin (HUVEC'ler) sonra hücreler, 4 gün ile 2 hafta arasında bir süre boyunca sürekli olarak kontrol edilen perfüzyon altında mikro iç yüzeyi kaplı olduğunu gösterdi.
Introduction
Mikrodamarlar, dolaşım sisteminin bir parçası olarak, kan ve dokular arasındaki etkileşimi aracılık metabolik faaliyetlerini desteklemek, doku mikro tanımlamak, ve birçok sağlık ve patolojik durumlarda önemli bir rol oynamaktadır. In vitro fonksiyonel mikrodamarlar tekrarlama kompleks vasküler olayların çalışma için bir platform sağlayabilir. Ancak, bu tür endotelyal hücre göçü deneyleri, endotel tüp oluşumu deneyleri, sıçan ve fare aort halkası tahlilleri gibi in vitro mikro-damar deneyleri, geleneksel üç boyutlu (3D) geometrisi ve sürekli bir akış kontrolü ile ilgili olarak, in vivo olarak yeniden kılcal mümkün değildir 1-8. Hayvan modelleri ve bu kornea anjiojen deneyleri, civciv chorioallantoic membran anjiyogenez tahlil ve Matrigel fiş test olarak in vivo deneyleri,, kullanarak mikrodamarlar çalışmaları daha, zaman alıcı maliyeti yüksek, gözlem ve sayımsal ile ilgili zorlu ve olanetik konular 1, 9-13 yükseltmek.
Olmazdı böyle kolay ve sıkı kontrol biyolojik koşulları ve dinamik akışkan ortamlar olarak çalışmaları 14, hayvanlarla ve in vivo ilgili yüksek deneysel maliyetleri ve karmaşıklığı yavaşlatmada ise micromanufacturing ve mikroakışkan çip teknolojileri gelişmeler biyomedikal bilimler bakış açıları çeşitli etkin geleneksel makro tekniklerle mümkün.
Burada, bir endothelialized oluşturmak için bir yaklaşım mevcut mikro--a-chip in vivo mikrodamarlar içinde 3 boyutlu geometri taklit ve fotolitografik reflowable ışığa tekniği, yumuşak litografi ve Mikroakiskan kombinasyonu kullanarak kontrollü sürekli perfüzyon akış altında çalışır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Fotorezist Usta Kalıp Fotolitografi Fabrikasyon
Aşağıdaki protokol, 30-60 mikron arasında çaplara sahip mikro imal etmek için işlemleri gösterir. Daha küçük bir çapı (en az 30 mikron), çeliğin tek bir spin kaplama olan bir mikrokanal elde etmek için gereklidir.
- Kullanmadan önce temiz oda, 24 saat için 4 ° C sıcaklıkta buzdolabında gelen yeniden akış fotorezist aktarın ve bu sırada oda sıcaklığına ısınmasına izin verir.
- Bir silikon yonga temiz ve kurutmak için izin vermek için 150 ° C de bir saat boyunca pişirin. Dehidrasyon silikon substrat için ışığa yapışma yardımcı olacaktır.
- Spin-kat fotorezist ilk katman aşağıdaki tarifi kullanarak:
| Adım | Zaman (Saniye) | Hız (rpm) | Hızlanma |
| 1 | 2 </ Td> | 300 | en yüksek |
| 2 | 10 | 0 | |
| 3 | 3 | 300 | en yüksek |
| 4 | 60 | 600 | en yüksek |
| 5 | 10 | 500 | en yüksek |
| 6 | 10 | 600 | en yüksek |
- Daha sonra, 90 saniye boyunca 110 ° C arasında bir sıcaklığa sahip bir ocak gofret fırında. Yumuşak fırında sonra ışığa kalınlığı 20-30 mikron olacaktır.
- Kat ilk kat için kullanılan aynı tarifi takip ışığa bir ikinci kat Spin.
- Yumuşak fırında 90 saniye 110 ° C lik bir sıcaklık ile bir ocak üzerine yerleştirerek tekrar gofret. Bu yumuşak fırında sonra ışığa kalınlığı 40-60 mikron olacaktır.
- PhotoR açarak olumlu ana desenleri oluşturmakbir film maske ile 14.500 mJ / cm 2 bir maruz kalma doz UV ışığına esist.
- Deiyonize (Dİ) su (01:02 (v / v)) ile geliştirici seyreltin. Desen tam gelişmiş kadar çözümünde tekrar tekrar gofret durulayın. Daha sonra DI su ile gofret yıkayın ve azot gazı kullanarak kurulayın.
- Reflow: 4 dakika ve solvent buharlaşmasını önlemek için bir cam Petri kabı ile kapak için 120 ° C lik bir sıcaklık ile bir ocak yeri gofret. Ocak gelen gofret çıkarın ve oda sıcaklığına kadar soğumasını bekleyin. Reflow sonra ışığa kalınlığı 50-60 mikron olacaktır.
2. PDMS Mikrokanal Ağ Yumuşak Litografi Fabrikasyon
- 10:1 ağırlık oranı (baz: sertleştirici) de polidimetilsiloksan (PDMS) çözeltisi hazırlayın ve bir gezegen santrifüj mikser kullanarak iyice karıştırın.
- Yeniden akıtılan çeliğin ana kalıp üzerine PDMS çözüm Cast. Gazdan arındırmak için 15 dakika boyunca bir desikatör içinde döküm PDMS yerleştirin. Gerekirse kalan kabarcıklarını çıkarmak için azot gazı kullanın.
- Bunun tedavisi için izin vermek için, 3 saat boyunca 60 ° C arasında bir sıcaklıkta bir fırında PDMS pişirilir. Daha sonra ana kalıp tedavi PDMS katmanı kaldırmak.
- Kanal ağı delik delme tarafından giriş / çıkış delikleri oluşturmak için bilenmiş zımba kullanın. Azot gazı kullanarak PDMS yüzeyini temizlemek.
- 4,5 x 10 -2 Torr ve 3,5 m 3 / dk oksijen akış hızı bir çalışma basıncında bir plazma temizleyici içinde 30 saniye oksijen plazma ile iki PDMS katmanları davranın. Daha sonra, bir optik mikroskop altında elle PDMS yüzeyleri hizalayın. Bir damla su hizalama daha iyi bir kontrolü için gerekli kullanın.
- 60 ° C de sürekli yapışma elde etmek için 30 dakika boyunca bir fırında pişirmeye cihaz.
3. Chip içinde HUVEC Kültür ve Yayımlama
- Kültür L-glutamin ile kültür ortamı ile HUVEC'ler,% 10 fetal sığır serumu (FBS) ile desteklenmiş. Th2 ile 5 arasında e deney pasajlar kullanılmıştır.
- HUVEC'lere birleşik bir kez, 37 ° C de 2-6 dakika hücreleri saymak ve ilk HEPES (HEPES-BSS) serum fizyolojik tamponlu ile hücreleri durulama bunları hasat ve sonra tripsin / EDTA ve inkübe ile hücrelerin tedavi Tripsinizasyon tamamlandıktan sonra, Tripsin çözeltisi ile nötralize tripsin / EDTA ile etkisiz hale getirir. Santrifüj ve toplamak için 8% dekstran ile kültür ortamı içinde hücre askıya. Dekstran iyi hücre tohumlama ve ek yardımcı olması için orta viskositesini artırmak için kullanılmıştır.
- 5 4,5 x 10 -2 Torr bir çalışma basıncı ile dakika ve 3.5 bir oksijen akış hızı ft 3 / dk oksijen plazma cihazı tedavi. Daha sonra DI su ile cihaz yük ve sterilizasyon için bir laminer biyogüvenlik kaput 8 saat UV ışığı ile tedavi.
- Hücrelerin hazır bir gün önce, 1x fosfat ile cihaz yıkayın fibronektin (100 mg / ml, dil ile kat sonra (1x PBS) tamponlu salin1X PBS ile uted) ve 4 ° C'de bir gece boyunca buzdolabında inkübe edin.
- Fibronektin kaplama sonra, 1x PBS sonra kültür ortamı ile yük cihazı yıkayın. 15 dakika boyunca 37 ° C arasında bir sıcaklıkta, cihaz inkübe edin.
- 3-4 x 10 6 hücre / ml 'lik bir hücre konsantrasyonu ile% 8 dekstran kültür ortamı içinde HUVEC hücreleri yerleştirin. Cihazın bir girişine bir hücre 20 ul damlacık yerleştirin ve mikroakışkan kanal içine hücreleri tanıtmak için eğilme. 15-20 dakika sonra, hücreler kanallarının yan duvarlara bağlamak için başlayacaktır. Cihaz hücreleri daha homojen bir dağılım oluşturmak için her 15 dakika döndürün. Gerekirse ek yükleme yapılabilir.
4. Uzun vadeli Perfüzyon Kurulum
Statik kültür 5-6 saat sonra, ekli HUVEC'lere tam yaymak başlar. 10 ul / saat sürekli bir akış ile bir uzaktan kumandalı şırınga pompası sistemini kullanarak perfüzyon kurun. Perfüzyon F ayarlanabilirya da daha yüksek bir akış hızı, ve 2 hafta ile 4 gün arasında bir süre sürebilir.
5. Hücre Boyama ve Mikroskop Karakterizasyonu
- Hücre, cihazın içindeki birleştiği ulaştığında, ilk olarak, iyice ortam maddesinin ayrılması için 1X PBS ile yıkayın cihaz. Daha sonra bir seyreltici (4-ul, 1 ml) ile seyreltildi, kırmızı bir boya ile, cihazın yük. Hücre yükleme prosedürüne benzer boya yükleyin. Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca karanlıkta inkübe cihazı ve daha sonra boyama durdurmak için kültür ortamı ile yıkayın cihaz. Boya uzun bir kuluçka hücresel toksisite ve disadhesion neden olabilir.
- 1x PBS (ml başına 2 damlacıkları) ile seyreltilmiş mavi boya ile aracı yükleyin. Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca karanlıkta inkübe sonra iyice 1X PBS ile yıkayın cihaz.
- Ters bir optik mikroskop altında hücre boyama inceleyin. Boyama iyi ise, (1x PBS ile sulandırılmış% 3.5 paraformaldehid) sabitleme orta mikro yük, daha sonra batığınorta ve tamamen alüminyum folyo ile örtün sabitleme cihazı. 4 arasındaki bir sıcaklıkta buzdolabında cihazını ° C'de kurutarak Photobleaching cihazın önlemek için. Sabit cihaz şimdi konfokal mikroskop bir lazer tarama yapılabilir konfokal görüntüleme, hazır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Çok derinlemesine Mikrokanallı ağ imal yaklaşımımız mikro kesitler 15 yuvarlak var olduğu, in vivo mikrodamarlar içinde karmaşık 3D geometrileri taklit eder. Ayrıca, ana dallanma kanallarının çapları ve kızı kanalları yaklaşık genel kanal direnci düşüktür ve akım hızları ağ 16-18 boyunca daha düzgün böylece gerekli düzeyde sıvı akışı korumak için Murray yasası uyun. Yarım daire şeklinde bir fotorezist ana kalıp, imalat ve dairesel bir yarı kesit PDMS mikrokanal ağı için süreçler ve sonuçlar Film 1, Şekil 2 ve sırasıyla film 2, gösterildi. PDMS mikrokanal ağı geometrik özellikleri karakterize olan ve Şekil 2'de gösterildi. Sonuçlarımız ışığa yeniden akış tekniği çok derinlemesine dallanma kanalı ağlar oluşturabilirsiniz olduğunu göstermektedir ina daha uygun ışığa yeniden akış teknikleri ile yaklaşım ve yaklaşık Murray Yasası itaat mikrovasküler biomimetic sistemleri tasarımı sağlar.
In vitro modeller birçok olarak vasküler hücrelerin normal düzlemsel levha, filtreler veya hidrojel ile kaplanmış, bu yüzeyler üzerinde kültürlenmiştir. Bu koşullar altında mikrodamarlar rastgele kendinden montaj hücresel tarafından oluşturulur. Buna ek olarak, konvansiyonel deneyler endotel hücreleri üzerinde sabit bir akış sağlanması doğasında güçlükleri vardır. Uzun vadeli ve sürekli medya akışının olmaması uygun bariyer fonksiyonları ile endotel hücre tek tabaka istikrarı korumak için yeteneği önler. Bizim modelde, uygulama Mikroakiskan yararına sıvı erişim ve kontrol (akış hızı, süresi ve desenleri değişen) yanı sıra atık kurtulmak için kolaylık sağlıyor. Biz birincil insan umbilikal ven endotel hücreleri için süreçler (HUVEC'lere) Mikrokanallarda tohumlama göstermek ve ayarlamak ting hücre kültürü için uzun vadeli bir perfüzyon sıvısı sistemi (Şekil 3). Ayrıca, çünkü karmaşık geometrileri in vivo mikrovasküler, bu küçük damarların gerçek zamanlı izleme zordur. Geliştirilen PDMS tabanlı çip iyi optik özellikler sunar ve endothelialized mikro yüksek kaliteli ve gerçek zamanlı görüntüleme için izin verir. (Şekil 4 ve Movie 3)
Film 1. Fotorezist ana kalıp için şematik imalat işlemleri. Başlangıçta, önceden temizlenmiş silikon substrat hazırlandı. Pozitif yeniden akış fotorezist tabaka silikon alt-tabaka üzerine spin kaplı ve pişmiş ve kurutuldu. Fotorezist desenli bir maske aracılığıyla UV ışığına maruz bırakıldı ve daha sonra, desenli mikro geliştirilmiştir. Bir yarım daire şeklinde enine kesitsel bir mikrokanal ağı 4 dakika boyunca 120 ° C'de yeniden akış sonra oluşturuldu.movie1.wmv "target =" _blank "> filmi görmek için buraya tıklayın.
Şekil 1. SEM geliştirilmiş gösteren bir fotorezist) yeniden akış önce;. Yeniden akış b) sonra, c) PDMS akıtmadan önce karşı enine kesitini göstermektedir kalıplanmış, resim, dikdörtgen şeklinde bir enine kesiti göstermektedir, d) PDMS yarım daire şeklinde bir kesiti gösteren kalıplanmış akıtmadan sonra karşı; sonra yeniden akış kesit şekli ve yeniden akış sıcaklığı başlangıç boyut tasarım tarafından kontrol edildi. (Referans 15 izni ile yayımlanmaktadır). büyük rakam görmek için buraya tıklayın .
Film 2. PDM silindirik Mikrokanallı ağ için şematik imalat işlemleriG. Bir PDMS çözeltisi fotorezist kalıp üzerine dökülür ve 3 saat boyunca 60 ° C arasındaki bir sıcaklıkta fırın içinde vulkanize edildi. İki özdeş tedavi PDMS katmanları, bir yarım daire kesit Mikrokanallı ağına sahip her biri, uyumlu ve dairesel kesitli mikro oluşturmak için bir araya bağlandı. filmi görmek için buraya tıklayın .
Şekil 2. a) PDMS. bd içinde bir uyumlu ve gümrük silindirik Mikrokanallı ağ) Dairesel PDMS kalıp kesitleri her dallanma seviyesi (1-1 ', 2-2' ve 3-3 ') de kanal boyutları göstermektedir. Buna ek olarak, bu rakamlar bir multibranching ve multidepth dairesel kesit mikroakışkan kanal ağı oluşturulması göstermektedir.
sayfa = "her zaman"> 
Şekil 3,. Şematik bir uzaktan kumandalı şırınga pompası kullanarak çip ile uzun vadeli perfüzyon gösteren.
Şekil 4. Floresan hücre zarı boya (kırmızı) ve bu HUVEC'ler hat, farklı dallanma bölgelerde silindirik bir mikrokanal ağı iç yüzeyi a.) En iyi, B) Orta ve c) alt kısmı. D) hücre nükleer boya (mavi), show kullanarak mikroskobu görüntüleri Konfokal mikroskopi görüntü kanal ağı astar HUVEC'ler arasında dairesel bir enine kesit görünüşünü göstermektedir. Ölçek çubukları: 100 mikron.
Film 3. Dairesel kanal ağı boyunca hücre astar gösteren Konfokal film.iles/ftp_upload/50771/50771movie3.wmv "target =" _blank "> filmi görmek için buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
1. Ana kalıp imalat
Vasküler morfometri için tasarımı ve yol gösterici ilkelerinden biri ağ boyunca damar çapları dağılımının minimum enerji dikkate tarafından yönetilir belirten Murray yasası 16, olarak bilinir. Ayrıca bir çatallanma bir ana geminin çaplarının küp kızı gemilerin çapları küp toplamına eşittir belirtiyor ( 
Buna ek olarak) 19, Poiseuille yasası olarak damar çoğunda makaslama stresinin büyüklüğünü tahmin etmek için kullanılmıştır 
. hangi1eq3.jpg "src =" / files/ftp_upload/50771/50771eq3.jpg "width =" 25px "/>, μ, kan viskozitesi hemodinamik kayma gerilmesi olduğunu Q debi ve R ve yarıçapı gemi 20,21. simetrik çatallanma, Murray yasası ve Poiseuille yasası dayalı önemli bir sonucu için duvar kayma gerilmesi damar ağı boyunca sabit kalır olmasıdır. Böylece, dairesel kesitli bir fabrikasyon simetrik mikroakışkan kanal ağı için, eğer kanal çatallanma itaat Murray yasası de boyutları, endotel hücreleri yaşadığı kayma gerilmesi farklı dallanma kanallar sabit olmalıdır.
Birçok imalat teknikleri ve süreçleri vasküler hücrelerde 22-25 için kullanılan mikro imalatı için uygulanmıştır Bununla birlikte, ortaya çıkan mikro kanallar, dikdörtgen, kare veya yamuk kesitleri ile sonuçlanmıştır. Kanallarının dikdörtgen kesitler conböylece hücre fizyolojisi 26,27 farklılıklar sonuçlanan, çok farklı kanal pozisyonlarda hücreleri üzerinde sıvı kayma gerilmeleri ve fizyolojik olmayan geometrileri farklı empoze edebilirsiniz çatallanma, keskin köşeleri ve ani geçişler ile kurmufltu.
Bir fotorezist akış süreci, yuvarlak bir kanal profili ile sonuçlanan iki prosedür, 1) desenli fotorezist erime ve sıvı karşı yüzeyleri sistemi 28,29 ve 2'nin enerji en aza indiren bir şekle çekilmektedir) bir soğutma ve karıştırmak katılaşma fazı eritme işlemi takip eder. Yeniden akıtılan kanallarının şekilleri de bir yarı silindirik yüzey tarafından yaklaştırılır. Yeniden akıtılan ana kalıp imalatı izledi, standart bir yumuşak litografi yaklaşım kesitli bir genelge ile PDMS mikroakışkan kanal ağı imal etmek için kullanılmıştır. Sonuçlarımız ışığa yeniden akış tekniği daha kent içinde çok derinlemesine dallanma Mikrokanallı ağlar oluşturabilirsiniz gösterdit ileri yaklaşım ve bizi farklı dallanma düzeylerde yaklaşık genel kanal direnci düşüktür, böylece Murray Yasası itaat ve in vivo mikrovasküler içinde geometrisini taklit mikrovasküler biyomimetik sistemleri ve kayma gerilmesi değişimleri tasarım sağlayan fabrikasyon olarak minimize edilebilir mikroakışkan kanal ağı.
Fizyolojik kan mikrodamarlar 30-300 mikron 30 arasında yarıçapı ile kabaca dairesel kesit benimsenmesi. Bu yazıda ortaya Mikrokanallı ağ için boyutları farklı dallanma düzeylerde 60 mikron ile 100 mikron civarında değişik. In vivo mikrodamarlar de taklit için çapları farklı yelpazesi ile mikro imal etmek, biz karşı tek ip katman yeniden akış kullanmanızı öneririz (30 mikron sınırlı) ya da diğer düşük viskozite direnir. Daha büyük bir çapa (30-60 mikron) olan bir mikrokanal, bir çift kaplama işlemi, daha kalın bir fotorezist filmi elde etmek için uygulanabilir15. Spin-kaplamalar iki katmanları üzerinde ek bir yanlış pozlama doz neden olabilir düzgün olmayan film kalınlığı, önlemek için kaçınılmalıdır. 60 mikron üzerinde bir film kalınlığı için, diğer yüksek viskoz yeniden akış photoresistler tavsiye edilir.
İdeal durumda, imal etmek bir yarım daire kesitli kalıp karşı, film kalınlığı başlangıçta Mikrokanallı gerekli bir genişlik ve odak uzaklığı olarak vererek önceden belirlenmiş olabilir 
, Burada H, gerekli bükülmüş bir film kalınlığı, r kanal genişliğinin yarısı kadar olduğu, R eğrilik sabit yarıçaplı, h eğrilik merkez yüksekliği, ve E önce ve sonra mikrokanal hacimleri karşı oranıdır 31 yeniden akıtmak. Mikrokanal belirli bir genişliği olan bir silindirik yüzeyi, karşı belirli bir hacmi yeniden olduğunuquired. Bununla birlikte, bazı parametreler yeniden akıtılan ışığa etkiler ve bu ışığa ve katı substrat, akış süreci için yeniden akış pişirme, sıcaklık ve ölçümü sırasında malzeme buharlaştırılarak arasındaki kritik sınır açısı ve hareket olarak sonuçlanmıştır kanal profilleri daha karmaşık hale bildirilmiştir , gazın atılması yüzey düzgünlüğü ve özellikleri 32-34 karşı. Örneğin, yeniden akış sıcaklığında ve zamanlama sınır hareketlerini neden olan bir hacim değişikliğine neden olabilir ve bu nedenle önemli bir açısı ve son profil 33 karşı yeniden düzenlenebilir farklı olabilir. Olarak önceki çalışmaları 15 tarafından bildirilen, reflow sürecine çünkü ışığa hacmi indirimleri ve sınır hareketinin ortalama% 2 kanal genişlikleri azalmıştır. Buna ek olarak, silindirik bir yüzey elde etmek için ses reflow sürecine 35,36 sırasında malzemenin buharlaşma etkisini hesaba katmak gerekiyor. Farklı yarıçap ile silindirik yüzeyleri boyunca gerekirsebir mikrokanal ağı ağ 15 farklı bölgelerde hacim değişimleri ile sonuçlanan, mikrokanal genişliğini değiştirmek için gereklidir. Başarılı bir şekilde farklı çaplarda, genişlikleri / birimleri, yeniden akış sıcaklık ve zamanlama, kritik açıları, sınır hareketi, viskozite ve spin kaplama protokolleri karşı, ve yüzey özellikleri direnir kabul edilir ve test edilmelidir ile silindirik bir kanal ağı imal etmek.
2. Uzun süreli hücre kültürü
Akışı ve ilgili duvar kayma gerilmesi önemi de endotel biyoloji düzenlenmesinde kabul edilmiştir. Bu, hücre şekli ve yönlendirme, salgı ve organizasyon, çoğalması ve farklılaşması değişiklikler, hücre içi sinyal, hücre iskeleti protein üretimi ve gen ifadesi, damar olgunlaşma ve yapısı, ve bariyer işlevleri 37-47 uyaran gibi alanlarda görülmüştür. Uç oluşturmak için in vitro yöntemler mevcutothelial tüpler genellikle 'endotel hücreleri güveniyor (EC) veya hücre dışı matriks (ECM) (tip I kollajen, fibrin veya Matrigel) 48-54 içinde mezenkimal hücreler olmadan öz-örgütlenme. Bu kültürlerin başarılı birkaç mikrovasküler davranışları, istenen mekansal tekrarlanabilirlik ve yönlendirme eksikliği morfogenez bir rastgele sürecinde oluşan yapay damar model olmasına rağmen. Bu kendini monte damarları kolayca bariyer fonksiyonları ve uzun vadeli vasküler istikrar mühendislik kan damarları için bir meydan okuma poz, bir 3D boru organizasyonu 55 ile lümen akışı Kombine mümkün değildir çünkü Ayrıca, mikrovasküler istikrar akımının etkisi büyük ölçüde bilinmemektedir.
Mikroakışkan sistemleri biyokimyasal ve biyolojik analiz 56,57 çeşitli akımları tanıtmak için pratik ve yararlı olduğu kanıtlanmıştır. Yaklaşımımız kültür hücreleri üzerinde sıvı akışını tanıtmak için uygun bir yol sağlar. Biz kullanılanuzun süreli hücre kültürü için mikro (4 gün ile 2 hafta arasında) üzerinden bir henüz istikrarlı ve doğru akış kontrolü sağlamak için gelişmiş uzaktan kumandalı şırınga pompası.
3. Çip Hücre kültürü
PDMS mikro plazma-destekli oksidasyon daha fazla protein kaplamalarda yüzey hidrofilik ve yardımlar vermektedir yüzeylerde silanol grupları (SiOH) tanıttı. Farklı ECM proteinleri için (fibronektin, jelatin ve kolajen) hücre bağlanma için test edildi, ve en iyi sonucu fibronektin kaplama olduğu bulunmuştur. HUVEC'ler 3 x 10 6 hücre / tohum için% 8, dekstran (70 kDa) ile takviyeli kültür ortamında ml 'lik bir konsantrasyonda hazırlandı. Dextran'ın EC yoğunluğu ekim üzerinde hassas kontrol sağlamak için ortamın viskozitesi artar.
Bir konfluent tek tabaka sabit bir orta akışına maruz HUVEC'lere 2-4 gün arasında geliştirilmiştir. Sonra hücreler görselleştirmek içinHücre kültürü, böylece zar boyanması ve çekirdekler boyama boyalarla işaretlenmiş hücreler, bu boyalar, düşük sitotoksisite 58 sergiledi. Bu çip içinde kültürlendi bir yapışkan katman olarak lekeli hücreler. Tam bir 1x PBS yıkama çip içinde sıkışıp ekstra boyalar önlemek için gereklidir.
Özet olarak, yeniden akış çeliğin teknik ve PDMS çoğaltma kombinasyonu ile, gelişmiş çok derinlemesine Mikrokanallı ağ dairesel bir yüzey tarafından yaklaşık ve her bifürkasyonunda kanal çapları yaklaşık Murray yasası itaat edildi. Farklı dallanma düzeylerde kayma gerilmesi değişimleri fabrikasyon mikroakışkan kanal ağında minimize edilebilir. Buna ek olarak, hücre kültüründen elde edilen sonuçlar, endotel hücrelerinin sağlıklı bir durum gösterilmiştir. Bu nedenle, geliştirilmiş endothelialized mikro-on-a-çip taklit eden daire şeklinde bir enine kesit dallanması ve multidepth mikrokanal ağlar oluşturmak için hızlı bir şekilde ve yeniden üretilebilir bir yaklaşım sağlarin vivo mikrodamarlar içinde geometrisi. Prosedür gelişmiş micromanufacturing ve uzun vadeli, sürekli perfüzyon kontrolü yanı sıra, yüksek kaliteli ve gerçek zamanlı görüntüleme yeteneğine sahip bir mikrovasküler model oluşturmak için mikroakışkan teknolojileri benzersiz yetenekleri kullanımını göstermektedir. Hücre biyolojisi, doku mühendisliği ve biyomühendislik uygulamaları için mikroakışkan kanallarının artan programı ile, endothelialized mikro-on-a-chip mikrovasküler araştırmalar için potansiyel bir testtir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarlarının olmadığını beyan ederim.
Acknowledgments
Bu araştırma kısmen Ulusal Bilim Vakfı (NSF 1.227.359), sırasıyla Ulusal Bilim Vakfı (EPS-1.003.907), Ulusal Bilim Vakfı (1.007.978) tarafından desteklenen WVU ADVANCE ofis ve WVU PSCoR tarafından finanse WVU EPSCoR programı, tarafından desteklenmiştir. Mikroimalat iş WVU Ortak Araştırma Olanakları (Temiz oda tesisleri) ve Batı Virginia Üniversitesi Chip Laboratuvarı (mikroçip Lab) üzerinde mikroakışkan Bütünleştirici Hücresel Araştırma yapıldı. Konfokal görüntüleme WVU Mikroskop Görüntüleme Tesisleri'nde yapıldı.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent/Material | |||
| Reflow Photoresist | AZ Electronic Materials | AZP4620 | |
| Developer | AZ Electronic Materials | AZ 400K | |
| PDMS | Dow Corning Corporation | Sylgard 184 | |
| MCDB 131 Culture Medium | Invitrogen | 10372-019 | |
| NacBlue Nuclei Staining | Invitrogen | H1399 | |
| PKH Red Stain | Sigma | MINI26 and PKH26GL | |
| Fibronectin | Gibco | PHE0023 | |
| L-Glutamine | Sigma | G7513 | |
| Phosphate Buffered Saline | Invitrogen | 14040-133 | |
| HEPES Buffered Saline Solution | Lonza | CC-5024 | |
| Trypsin/EDTA | Invitrogen | 25300-062 | |
| Trypsin Neutralizing Solution | Lonza | CC-5002 | |
| PDMS Curing Agent | Dow Corning Corporation | Sylgard 184 | |
| Primary Human Umbilical Vein Endothelial Cells | Lonza | CC-2517 | |
| Fetal Bovine Serum | Lonza | 14-501F | |
| Diluent C | Sigma | CGLDIL | |
| Hoechst33342 | Invitrogen, Molecular Probes | R37605 | |
| Dextran | Sigma | 95771 | |
| 3.5% Paraformaldehyde | Electron Microscopy Science | 15710-S | |
| Equipment | |||
| Spinner | Laurell Technologies Corporation | WS-400BZ-6NPP/LITE | |
| Desiccator | BelArt Products | 999320237 | |
| Inverted Microscope | Nikon | Eclipse Ti | |
| Syringe Pump System | Harvard Apparatus | PHD Ultra | |
| Laminar Biosafety Hood | Thermo Scientific | 1300 Series A2 | |
| Planetary Centrifugal Mixer | Thinky | ARE-310 | |
| Isotemp Oven | Fisher Scientific | 13-246-516GAQ | |
| Optical Microscope | Zeiss | Invertoskop 40C | |
| Plasma Cleaner | Harrick Plasma | PDC-32G | |
| Hotplate | Barnstead/Thermolyne Cimarec | SP131635 | |
| Laser Scanning Confocal Microscope | Zeiss | LSM 510 |
References
- Adair, T. H. Angiogenesis: Integrated systems physiology: from molecule to function to disease. , 1st edition, Biota Publishing. (2011).
- Goodwin, A. M. In vitro assays of angiogenesis for assessment of angiogenic and anti-angiogenic agents. Microvasc. Res. 74, 172-183 (2007).
- Smith, E. J., Staton, C. A. Tubule formation assays. Angiogenesis assays: A critical appraisal of current techniques. , John Wiley & Sons Ltd. West Sussex, UK. 65-87 (2006).
- Nakatsu, M. N., Davis, J. J., Hughes, C. C. W. Optimized fibrin gel bead assay for the study of angiogenesis. J. Vis. Exp. (3), e186 (2007).
- Nicosia, R. F., Ottinetti, A. Growth of microvessels in serum-free matrix culture of rat aorta. A quantitative assay of angiogenesis in vitro. Lab. Invest. 63, 115-122 (1990).
- Aplin, A. C., Fogel, E., Zorzi, P., Nicosia, R. F. The aortic ring model of angiogenesis. Methods Enzymol. 443, 119-136 (2008).
- Nicosia, R. F. The aortic ring model of angiogenesis: A quarter century of search and discovery. J. Cell. Mol. Med. 13, 4113-4136 (2009).
- Griffith, L. G., Swart, M. A. Capturing complex 3D tissue physiology in vitro. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 7, 211-224 (2006).
- Folkman, J. History of angiogenesis. Angiogenesis: An integrative approach from science to medicine. , Springer. (2008).
- Auerbach, R., Lewis, R., Shinners, B., Kubai, L., Akhtar, N. Angiogenesis assays: A critical overview. Clin. Chem. 49, 32-40 (2003).
- Auerbach, R., Akhtar, N., Lewis, R. L., Shinners, B. L. Angiogenesis assays: Problems and pitfalls. Cancer Metastasis Rev. 19, 167-172 (2000).
- Staton, C. A., Reed, M. W., Brown, N. J. A critical analysis of current in vitro and in vivo angiogenesis assays. Int. J. Exp. Pathol. 90, 195-221 (2009).
- Staton, C. A., Stribbling, S. M., et al. Current methods for assaying angiogenesis in vitro and in vivo. Int. J. Exp. Pathol. 85, 233-248 (2004).
- Moraes, C., Mehta, G., Lesher-Perez, S. C., Takayama, S. Organs-on-a-Chip: A focus on compartmentalized microdevices. Ann. Biomed. Eng. 40 (6), 1211-1227 (2012).
- Huang, Z., Li, X., Martins-Green, M., Liu, Y. Microfabrication cylindrical microfluidic channel networks for microvascular research. Biomedical Microdevices. 14 (5), 873-883 (2012).
- Murray, C. D. The physiological principle of minimum work applied to the angle of branching of arteries. J. Gen. Physiol. 9 (6), 835-841 (1926).
- Zamir, M., Medeiros, J. A. Arterial branching in man and monkey. J. Gen. Physiol. 79, 353-360 (1982).
- Gafiychuk, V. V., Lubashevsky, I. A. On the principles of the vascular network branching. J. Theor. Biol. 212, 1-9 (2001).
- Sherman, T. F. On connecting large vessels to small. The meaning of Murray's law. J. Gen. Physiol. 78 (4), 431-453 (1981).
- Kamiya, A., Bukhari, R., Togawa, T. Adaptive regulation of wall shear stress optimizing vascular tree function. Bull Math Biol. 46 (1), 127-137 (1984).
- LaBarbera, M. Principles of design of fluid transport systems in zoology. Science. 249, 992-1000 (1990).
- Emerson, D. R., Cieslicki, K., Gu, X., Barber, R. W. Biomimetic design of microfluidic manifolds based on a generalized Murray's law. Lab Chip. 6, 447-454 (2006).
- Lu, H., Koo, L. Y., et al. Microfluidic shear devices for quantitative analysis of cell adhesion. Anal. Chem. 76, 5257-5264 (2004).
- Shevkoplyas, S. S., Gifford, S. C., Yoshida, T., Bitensky, M. W. Prototype of an in vitro model of the microcirculation. Microvasc. Res. 65, 132-136 (2003).
- Kaihara, S., Borenstein, J., et al. Silicon micromachining to tissue engineer branched vascular channels for liver fabrication. Tissue Eng. 6, 105-117 (2000).
- Fisher, A. B., Chien, S., Barakat, A. I., Nerem, R. M. Endothelial cellular response to altered shear stress. Am. J. Physiol. Lung Cell. Mol. Physiol. 281 (3), L529-L533 (2001).
- Nerem, R. M., Alexander, R. W., et al. The study of the influence of flow on vascular endothelial biology. Am. J. Med. Sci. 316 (3), 169-175 (1998).
- Daly, D., Stevens, R. F., Hutley, M. C., Davies, N. The manufacture of microlenses by melting photoresist. Meas. Sci. Technol. 1 (8), 759-766 (1990).
- Schilling, A., Merz, R., Ossmann, C., Herzig, H. P. Surface profiles of reflow microlenses under the influence of surface tension and gravity. Opt. Eng. 39 (8), 2171-2176 (2000).
- Young, B., Heath, J. W. Wheater's functional histology: A text and colour atlas. , 4th edition, Churchill Livingstone. (2000).
- O'Neill, F. T., Sheridan, J. T. Photoresist reflow method of microlens production. Part 1: Background and experiments. Optik Int. J. Light Electron Opt. 113, 391-404 (2002).
- de Gennes, P. G.
- Elias, H. G. An Introduction to Polymer Science. , VCH Publishers. New York. (1997).
- Voinov, O. V. Dynamic edge angles of wetting upon spreading of a drop over a solid surface. J. Appl. Mech. Tech. Phys. 40, 86-92 (1999).
- Daly, D., Stevens, R. F., Hutley, M. C., Davies, N. The manufacture of microlenses by melting photoresist. Meas. Sci. Technol. 1, 759 (1990).
- Jay, T. R., Stern, M. B. Preshaping photoresist for refractive microlens fabrication. Opt. Eng. 33, 3552-3555 (1994).
- Nerem, R. M., Alexander, R. W., et al. The Study of the influence of flow on vascular endothelial biology. Am. J. Med. Sci. 316 (3), 169-175 (1998).
- Chien, S., Li, S., Shyy, Y. J. Effects of mechanical forces on signal transduction and gene expression in endothelial cells. Hypertension. 31, 162-169 (1998).
- Li, Y. S., Haga, J. H., Chien, S. Molecular basis of the effects of shear stress on vascular endothelial cells. J. Biomech. 38, 1949-1971 (2005).
- Lee, E. J., Vunjak-Novakovic, G., Wang, Y., Niklason, L. E. A biocompatible endothelial cell delivery system for in vitro tissue engineering. Cell Transplant. 18, 731-743 (2009).
- Lee, E. J., Niklason, L. E. A novel flow bioreactor for in vitro microvascularization. Tissue Eng. Part C Methods. 16, 1191-1200 (2010).
- Chau, L., Doran, M., Cooper-White, J. A novel multishear microdevice for studying cell mechanics. Lab Chip. 9, 1897-1902 (2009).
- Meeson, A., Palmer, M., Calfon, M., Lang, R. A relationship between apoptosis and flow during programmed capillary regression is revealed by vital analysis. Development. 122, 3929-3938 (1996).
- Van Royen, N. J., Piek, J., Schaper, W., Bode, C., Buschmann, I. Arteriogenesis: mechanisms and modulation of collateral artery development. J. Nucl. Cardiol. 8, 687-693 (2001).
- Schaper, W.
- Tarbell, J. M. Shear stress and the endothelial transport barrier. Cardiovas. Res. 87 (2), 320-330 (2010).
- Potter, C. M., Lundberg, M. H., et al. Role of shear stress in endothelial cell morphology and expression of cyclooxygenase isoforms. Arterioscler. Thromb. Vasc Biol. 31, 384-391 (2011).
- Montesano, R. In vitro rapid organization of endothelial cells into capillary-like networks is promoted by collagen matrices. J. Cell Biol. 97, 1648-1652 (1983).
- Darland, D. C., D'Amore, P. A. TGF beta is required for the formation of capillary-like structures in three-dimensional cocultures of 10T1/2 and endothelial cells. Angiogenesis. 4 (1), 11-20 (2001).
- Lawley, T. J., Kubota, Y. Induction to morphologic differentiation of endothelial cells in culture. J. Invest. Dermatol. 93, 59S-61S (1989).
- Kanzawa, S., Endo, H., Shioya, N. Improved in vitro angiogenesis model by collagen density reduction and the use of type III collagen. Ann. Plast. Surg. 30, 244-251 (1993).
- Davis, G. E., Bayless, K. J., Mavila, A. Molecular basis of endothelial cell morphogenesis in three-dimensional extracellular matrices. Anat. Rec. 268, 252-275 (2002).
- Velazquez, O. C., Snyder, R., Liu, Z., Fairman, R. M., Herlyn, M. Fibroblast-dependent differentiation of human microvascular endothelial cells into capillary-like 3-dimensional networks. FASEB J. 16, 1316-1318 (2002).
- Donovan, D., Brown, N. J., Bishop, E. T. Comparison of three in vitro human "angiogenesis" assays with capillaries formed in vivo. Angiogenesis. 4, 113-121 (2001).
- Tang, D. G., Conti, C. J. Endothelial cell development, vasculogenesis, angiogenesis, and tumor neovascularization: an update. Semin. Thromb. Hemost. 30, 109-117 (2004).
- Takayama, S., McDonald, J. C., et al. Patterning cells and their environments using multiple laminar fluid flows in capillary networks. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96, 5545-5548 (1999).
- Cho, B. S., Schuster, T. G., et al. Passively driven integrated microfluidic system for separation of motile sperm. Anal. Chem. 75, 1671-1675 (2003).
- Parsa, H., Upadhyay, R., Sia, S. K. Uncovering the behaviors of individual cells within a multicellular microvascular community. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108 (12), 5133-5138 (2011).
