Summary
Uma plataforma de microcanais-on-a-chip foi desenvolvido pela combinação da técnica fotolitográfica refluído fotossensível, litografia macia, e microfluidos. A plataforma de microcanais reendotelizados imita a geometria tridimensional (3D) de microvasos in vivo, é executado sob fluxo de perfusão contínua controlada, permite a imagem de alta qualidade e em tempo real, e pode ser aplicado para a pesquisa microvascular.
Abstract
Os esforços têm sido focados no desenvolvimento de ensaios in vitro para o estudo de microvasos porque estudos em animais in vivo é mais demorado, caro e de observação e quantificação são muito desafiante. No entanto, em ensaios in vitro convencional microvasos têm limitações quando representar microvasos in vivo no que diz respeito a geometria tridimensional (3D) e fornecer o fluxo de fluido contínuo. Usando uma combinação de técnicas de fotolitografia reflowable photoresist, litografia macia e microfluídica, temos desenvolvido um multi-profundidade reendotelizados transversais circulares microcanais-on-a-chip, que imita a geometria 3D in vivo microvasos e é executado sob perfusão contínua controlada fluxo. Um fotosensitivo refluído positivo foi usada para fabricar um molde mestre, com uma rede de microcanais transversal semicircular. No alinhamento e união das duas (PDMS) microcanais polidimetilsiloxano replicated do molde mestre, uma rede de microcanais cilíndrico foi criado. Os diâmetros dos microcanais pode ser bem controlada. Além disso, as células primárias endoteliais da veia umbilical humana (HUVEC) semeadas dentro do chip mostraram que as células revestidas a superfície interior dos microcanais em perfusão controlada duradouro durante um período de tempo entre 4 dias a 2 semanas.
Introduction
Microvasos, como uma parte do sistema de circulação, medeiam as interacções entre o sangue e os tecidos, suporta as actividades metabólicas, definir microambiente do tecido, e desempenham um papel fundamental em muitos estados patológicos e de saúde. Recapitulação de microvasos funcionais in vitro pode fornecer uma plataforma para o estudo de fenômenos vasculares complexos. No entanto, em ensaios convencionais microvasos in vitro, tais como ensaios de migração de células endoteliais, ensaios de formação de tubos endoteliais e de rato e ensaios de anel da aorta do rato, são incapazes de recriar o microvasos in vivo no que diz respeito à geometria tridimensional (3D) e controlo de fluxo contínuo 1-8. Estudos de microvasos com modelos animais e em ensaios in vivo, tais como o ensaio de angiogénese da córnea, pinto corioalantóico ensaio de angiogénese da membrana e ensaio de tampão de Matrigel, são mais demorado, alto custo, um desafio no que diz respeito à observação e quantificação, elevantar questões éticas 1, 9-13.
Avanços em Microfabricação e tecnologias de chips microfluídicos têm permitido uma variedade de insights sobre ciências biomédicas, enquanto reduzindo os altos custos experimentais e as complexidades associadas com animais e estudos in vivo de 14, como condições biológicas de forma fácil e rigidamente controlada e ambientes fluidos dinâmicos, que não teriam foi possível com as técnicas convencionais macroescala.
Aqui, apresentamos uma abordagem para a construção de uma reendotelizados microcanais-on-a-chip que imita a geometria 3D in vivo microvasos e é executado sob fluxo de perfusão contínua controlada usando a combinação da técnica de fotolitografia reflowable photoresist, litografia macia e microfluídica.
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Protocol
1. Fotolitografia Fabricação de Moldes Mestre Photoresist
O protocolo seguinte ilustra o processo para fabricar os microcanais com diâmetros entre 30-60 um. Para obter um microcanal com um diâmetro mais pequeno (inferior a 30 um), numa única rotação de revestimento de material fotosensitivo é necessário.
- Transferir o material fotosensitivo de refluxo do frigorífico a 4 ° C e a sala limpa 24 horas antes da utilização e permitir que aqueça até à temperatura ambiente.
- Limpar uma bolacha de silício e cozê-la durante uma hora a 150 ° C, para permitir que a desidratar. A desidratação irá ajudar a adesão fotossensível à base de silício.
- Spin-revestir a primeira camada de material fotosensitivo utilizando a seguinte receita:
| Passo | Tempo (segundos) | Velocidade (rpm) | Aceleração |
| 1 | 2 </ Td> | 300 | maior |
| 2 | 10 | 0 | |
| 3 | 3 | 300 | maior |
| 4 | 60 | 600 | maior |
| 5 | 10 | 500 | maior |
| 6 | 10 | 600 | maior |
- Em seguida, coze a bolacha numa placa de aquecimento com uma temperatura de 110 ° C durante 90 seg. Após a cozer suave da espessura do material fotosensitivo será de 20-30 ^ m.
- Girar revestimento de uma segunda camada de material fotosensitivo seguindo a mesma receita utilizada para a primeira camada.
- Assar a bolacha Mole novamente, colocando-o numa placa de aquecimento com uma temperatura de 110 ° C durante 90 seg. Após este coza suave da espessura do material fotosensitivo será de 40-60 ^ m.
- Gerar padrões de mestre positivos expondo o photoresist à luz UV com uma dose de exposição de 14.500 mJ / cm 2, por meio de uma máscara de filme.
- Dilui-se com o desenvolvedor desionizada (DI), água (1:2 (v / v)). Lavar a bolacha repetidamente na solução até que o padrão está completamente desenvolvido. Em seguida, lave o wafer com água DI e seque-o com gás nitrogênio.
- Refluxo: Coloque a bolacha numa placa de aquecimento com uma temperatura de 120 ° C durante 4 min e com uma tampa de uma placa de Petri de vidro para evitar a evaporação do solvente. Retire o wafer do fogão e deixe esfriar à temperatura ambiente. A espessura do material fotosensitivo após o refluxo será de 50-60 ^ m.
2. Fabricação de litografia suave de PDMS Microcanal Rede
- Preparar a solução de polidimetilsiloxano (PDMS) com a proporção em peso de 10:01 (base: agente de cura) e misture bem utilizando um misturador planetário centrífuga.
- Lançai a solução PDMS para o molde mestre photoresist refluído. Colocar o PDMS fundido num exsicador durante 15 min para desgaseificar. Use azoto gasoso para remover quaisquer bolhas restantes, se necessário.
- Asse o PDMS numa estufa a uma temperatura de 60 ° C durante 3 horas para permitir a cura. Em seguida, retire a camada de PDMS curada do molde mestre.
- É um perfurador aguçado para criar os orifícios de entrada / saída por furos de perfuração na rede de canais. Limpar a superfície do PDMS usando gás azoto.
- Trate duas camadas de PDMS com plasma de oxigênio por 30 segundos dentro de um aspirador de plasma a uma pressão de operação de 4,5 x 10 -2 Torr e uma taxa de fluxo de oxigênio de 3,5 pés 3 / min. Em seguida, alinhar as superfícies do PDMS manualmente sob um microscópio óptico. Use uma gota de água se necessário, para um melhor controlo do alinhamento.
- Asse o dispositivo num forno a 60 ° C durante 30 min para conseguir a ligação permanente.
3. Cultura HUVEC e propagação no Chip
- Cultura das HUVECs com meio de cultura com L-glutamina, suplementado com 10% de soro fetal bovino (FBS). Por diaforam usadas passagens electrónicos experimentais entre 2 e 5.
- Uma vez que as HUVECs são confluentes, a contagem das células e colhem-lhes, em primeiro lugar a lavagem das células com solução salina tamponada com HEPES (HEPES-BSS) e, em seguida, tratar as células com tripsina / EDTA e incubar durante 2-6 min a 37 ° C. Após a tripsinização é completa, neutralizar a tripsina / EDTA com uma solução de neutralização de tripsina. Centrifugar e suspender as células em meio de cultura com 8% de dextrano para recolhê-las. Dextrano foi usada para aumentar a viscosidade média para ajudar na melhor semeadura de células e do acessório.
- Tratar o dispositivo com plasma de oxigénio durante 5 min com uma pressão de serviço de 4,5 x 10 -2 Torr e uma taxa de fluxo de oxigénio de 3,5 ft 3 / min. Em seguida, carregar o dispositivo com água DI e tratar com luz UV por 8 horas em um laminar capa de biossegurança para a esterilização.
- Um dia antes das células estão prontas, o dispositivo de lavagem com 1 x tampão fosfato salino (PBS 1x) e depois o revestimento com fibronectina (100 ug / ml, dilbuído com PBS 1x) e incubar no frigorífico a 4 ° C durante a noite.
- Depois do revestimento com a fibronectina, o dispositivo de lavagem com 1x PBS, em seguida, carregar com meio de cultura. Incubar o dispositivo a uma temperatura de 37 ° C durante 15 min.
- Carregar as células HUVEC em meio de cultura de 8% de dextrano com uma concentração celular de 3-4 x 10 6 células / ml. Coloque uma gota de 20 ul de células a uma entrada do dispositivo e inclinar-se a introdução das células no interior do canal microfluídico. Depois de 15-20 minutos as células começarão a anexar as paredes laterais dos canais. Girar o dispositivo a cada 15 minutos para criar uma distribuição mais uniforme das células. Se necessário, uma carga adicional pode ser executada.
4. Configuração de perfusão de longo prazo
Depois de 5-6 horas de cultura estática, os HUVECs anexados vai começar a espalhar totalmente. Configure perfusão usando um sistema de bomba de seringa controle remoto com um fluxo constante de 10 mL / h. A perfusão pode ser ajustada fou uma taxa de fluxo mais elevada, e pode durar por um período de tempo entre 4 dias a 2 semanas.
5. Coloração celular e Caracterização Microscópio
- Quando as células atingem confluência no interior do dispositivo, em primeiro lugar, o dispositivo de lavagem com 1x PBS para remover completamente o meio. Em seguida, carregar o aparelho com corante vermelho diluído com diluente (4 ul-1 ml). Carregar o corante semelhante ao procedimento de carregamento da célula. Incubar o dispositivo no escuro durante 5 min à temperatura ambiente, e, em seguida, o dispositivo de lavagem com meio de cultura para parar a coloração. Comprida incubação do corante pode causar toxicidade celular e disadhesion.
- Carregar o dispositivo com o corante azul diluída com PBS 1x (2 gotas por ml). Incubar no escuro durante 5 min à temperatura ambiente e depois lavar com o dispositivo de 1x PBS.
- Examine a coloração de células em microscópio óptico invertido. Se a coloração era bom, carregar os microcanais com meio de fixação (3,5% paraformaldeído diluído com PBS 1x), em seguida submergiro dispositivo de fixação no suporte e cobri-lo completamente com folha de alumínio. Armazenar o dispositivo no frigorífico a uma temperatura de 4 ° C para evitar que o dispositivo de secagem e fotobranqueamento. O dispositivo fixo está agora pronto para imagiologia confocal, o que pode ser feito por um microscópio de varrimento de laser confocal.
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Representative Results
A nossa abordagem para fabricar a rede de microcanais múltiplos profundidade imita as geometrias complexas 3D de microvasos in vivo, em que os microcanais têm secções transversais arredondadas 15. Além disso, os diâmetros dos canais de ramificação-mãe e os canais filha aproximadamente obedecem à lei de Murray, para manter o fluxo do fluido em um nível requerido de modo que a resistência global do canal é baixa e velocidades de fluxo são mais uniforme em toda a rede de 16-18. Os processos e os resultados para a fabricação de um molde mestre fotosensitivo semicircular e uma rede de microcanais PDMS transversal circular foram demonstrados em filme 1, Figura 2, e 2 de filme, respectivamente. As características geométricas da rede de microcanais PDMS foram caracterizados e mostrado na Figura 2. Nossos resultados mostram que a técnica de refluxo photoresist pode criar redes de multi-profundidade ramificação do canal ina abordagem mais conveniente por meio de técnicas de refluxo fotossensíveis, e permitem projetar os sistemas biomiméticos microvasculares que cerca de obedecer à lei de Murray.
Em vários modelos in vitro, as células vasculares são normalmente cultivadas em placas planas, filtros, ou estes substratos revestidos com hidrogéis. Sob estas condições, os microvasos são gerados aleatoriamente por celular de auto-montagem. Além disso, os ensaios convencionais têm dificuldades inerentes em conseguir um fluxo constante ao longo de células endoteliais. A falta de um longo prazo e contínua evita que o fluxo de media a capacidade de manter a estabilidade da monocamada de células endoteliais com funções de barreira adequadas. Em nosso modelo, o benefício da aplicação de microfluídica é a conveniência para o acesso e controle de fluidos (variando as taxas de fluxo, duração e padrões), bem como se livrar de resíduos. Nós demonstramos os processos de células da veia umbilical humana primários endoteliais (HUVECs) semeadura nos microcanais e definir ção de um sistema de longa duração do fluido de perfusão para a cultura celular (Figura 3). Além disso, devido às geometrias complexas de microvasos in vivo, a monitorização em tempo real dos vasos pequenos, é difícil. O chip baseado PDMS desenvolvido oferece boas propriedades ópticas e permite a imagiologia dos microcanais reendotelizados de alta qualidade e em tempo real. (Figuras 4 e Filme 3)
Filme 1. Procedimentos de fabricação esquemáticos para moldes mestre fotossensíveis. Inicialmente, um substrato de silício pré-limpeza foi preparado. A camada fotossensível positivo de refluxo era de spin-revestido sobre o substrato de silício e foi cozido e seco. A fotorresistência foi exposta à luz UV por meio de uma máscara de modelado, e, em seguida, os microcanais modeladas foram desenvolvidos. Uma rede de microcanais transversal semicircular foi criado após o refluxo, a 120 ° C durante 4 min.movie1.wmv "target =" _blank "> Clique aqui para ver o filme.
Figura 1. SEM mostra a fotossensível desenvolvido um) antes de refluxo,. B), após o refluxo, c) moldado PDMS mostra a secção transversal da resistir antes reflui, a figura mostra uma secção transversal rectangular, d) moldado PDMS mostrando uma secção transversal semi-circular com o resistir depois reflui, a secção transversal após o refluxo foi controlado pelo desenho dimensão inicial do padrão e da temperatura de refluxo. (Reproduzido com permissão da referência 15). Clique aqui para ver a figura maior .
2 filme. Os procedimentos de fabricação esquemáticos para a rede de microcanais cilíndrico em PDMS. Se uma solução de PDMS foi moldada sobre o molde e fotossensível curada em estufa a uma temperatura de 60 ° C durante 3 horas. Dois idênticos camadas curado PDMS, cada um dos quais tem uma rede de microcanais transversal semicircular, foram alinhados e unidos para formar microcanais com seções transversais circulares. Clique aqui para ver filme .
Figura 2. a) Uma rede de microcanais cilíndrico alinhadas e coladas em PDMS. bd) Circular seções transversais de moldes PDMS mostram as dimensões do canal em cada nível de ramificação (1-1 ', 2-2' e 3-3). Além disso, estas figuras mostram a criação de uma rede de canais de microfluidos multidepth transversal circular e multibranching.
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Figura 3. Diagrama esquemático mostrando a perfusão a longo prazo através do chip usando uma bomba de seringa controlada remotamente.
Figura 4. As imagens microscópicas da membrana celular usando corante fluorescente (vermelho) e (azul) mostram corante nuclear de células HUVEC que a linha da superfície interior de uma rede de microcanais cilíndrica em diferentes regiões de ramificação. Uma) superior, b) meio, e c) inferior. D) imagem de microscopia confocal mostra a vista em corte transversal circular de HUVECs revestem a rede de canais. Barras de escala: 100 uM.
Filme 3. Filme confocal mostrando o forro de células ao longo da rede de canais de circular.iles/ftp_upload/50771/50771movie3.wmv "target =" _blank "> Clique aqui para ver o filme.
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Discussion
1. Fabricação de moldes Mestre
Um dos princípios orientadores para a concepção e morfometria vascular é conhecida como lei de Murray, 16, que afirma que a distribuição dos diâmetros dos vasos em toda a rede é regida por contrapartida mínima de energia. Afirma também que o cubo dos diâmetros de um navio-mãe a uma bifurcação é igual à soma dos cubos dos diâmetros dos vasos filha ( 
) 19 Além disso, a lei de Poiseuille foi utilizado para estimar a magnitude da tensão de cisalhamento na maioria da vasculatura como 
. em que1eq3.jpg "src =" / files/ftp_upload/50771/50771eq3.jpg "width =" 25px "/> é a tensão de cisalhamento hemodinâmica, μ é a viscosidade do sangue, Q é a taxa de fluxo, e R é o raio do navio 20,21. Para bifurcações simétricas, uma conseqüência importante com base na lei de Murray ea lei de Poiseuille é que a tensão de cisalhamento permanece constante em toda a rede vascular. Assim, por uma rede de canais microfluídicos simétrica fabricada com secção circular, se o canal dimensões na lei de bifurcações obedecer Murray, a tensão de cisalhamento experimentado pelas células endoteliais deve ser constante em diferentes canais de ramificação.
Muitas técnicas e processos de microfabricação ter sido aplicado ao fabrico de microcanais usados para as células vasculares 22-25, no entanto, os microcanais resultantes resultou na rectangular, trapezoidal, quadrada ou secções transversais do canal. As seções transversais retangulares de canais são contruídos com cantos afiados e transições abruptas em bifurcações, que pode variar amplamente impõem tensões de cisalhamento de fluidos e geometrias não fisiológicas em células em diferentes posições de canal, resultando em variações na fisiologia celular 26,27.
Um processo de refusão fotossensível, resultando num perfil de canal arredondado, envolve dois processos: 1) o ponto de fusão do material fotosensitivo modelado e resistem ao líquido superfícies são puxadas para uma forma que minimize a energia do sistema e 28,29 2) um arrefecimento e fase de solidificação se segue o processo de fusão. As formas dos canais refluído são bem aproximada por uma superfície semicilíndrica. Seguido por refluído fabricação de moldes mestre, foi utilizada uma abordagem padrão de litografia suave para fabricar a rede PDMS microfluídicos canal com uma secção transversal circular. Nossos resultados mostraram que a técnica de refluxo photoresist pode criar multi-profundas ramificações redes de microcanais em mais straight abordagem para a frente, e permite desenhar sistemas biomiméticos microvasculares que aproximadamente obedecem à lei de Murray e mimetizar a geometria da in vivo microvasculatura, de modo que a resistência global do canal é baixa, e as variações de tensão de cisalhamento em diferentes níveis de ramificação pode ser minimizado na sua fabricada rede de canais microfluídicos.
Os microvasos sanguíneos fisiológicos adoptar uma secção transversal aproximadamente circular, com raios de entre 30-300 mM 30. As dimensões para a rede de microcanais demonstrado no presente documento foram variou de cerca de 60 um a 100 um, em diferentes níveis de ramificação. Para fabricar microcanais com gama de diferentes diâmetros para imitar in vivo microvasos, recomendamos o uso de camada única refluxo fiado resistir (limitado a 30 mm) ou outro de menor viscosidade resiste. Para um microcanal com um diâmetro maior (30-60 um), por um processo de revestimento duplo pode ser aplicada para se obter uma película mais espessa fotosensitivo15. Adicional spin-revestimentos de cima de duas camadas deve ser evitada para evitar a espessura da película não uniforme, o que pode resultar numa dose de exposição impreciso. Para obter uma espessura de película acima de 60 uM, outros fotorresistentes refluxo viscosos superiores são recomendados.
Em uma condição ideal, para o fabrico de um molde de resistir com uma secção transversal semicircular, a espessura da película pode ser pré-determinado, inicialmente, dando uma largura necessária e distância focal da microcanais quanto 
, Em que H é a espessura de película requerida fiado, r é a metade da largura do canal, R é o raio de curvatura constante, h é a altura do centro de curvatura, e E é a razão de volumes de resistir a microcanais antes e depois reflowing 31. Para obter uma superfície cilíndrica de uma dada largura de microcanais, um volume específico de resistir a é rerias. No entanto, vários parâmetros têm sido relatados para afectar a fotorresistência refluído e tornar os perfis de canal resultaram mais complexa, tal como o ângulo crítico e movimento limite entre a foto-resistente e o substrato sólido, evaporação de material durante o refluxo de cozimento, a temperatura e tempo para o processo de refluxo, outgassing, a uniformidade do substrato, e resistir propriedades 32-34. Por exemplo, a temperatura de refluxo e de temporização pode resultar numa alteração de volume causando o movimento limite e, portanto, a variação do ângulo crítico e final refluído resistir perfil 33. Conforme relatado por nosso trabalho anterior 15, o processo de refluxo diminuiu a largura do canal de 2%, em média, por causa da redução do volume fotossensíveis e movimento de fronteira. Além disso, o volume para obter uma superfície cilíndrica precisa de ter em conta o efeito de evaporação do material durante o processo de refluxo 35,36. Se superfícies cilíndricas com raios diferentes são necessários atravésuma rede de microcanais é necessário fazer variar a largura dos microcanais, resultando em variações nos volumes em diferentes regiões da rede 15. Para fabricar com sucesso uma rede de canal cilíndrico com diferentes diâmetros, o resiste larguras / volumes, temperaturas e tempo de refluxo, os ângulos críticos, movimento limite, resistem viscosidades e protocolos de revestimento por centrifugação, e as propriedades do substrato devem ser consideradas e testadas.
2. Cultura de células de longo prazo
A importância de fluxo e a parede cisalhamento associado tenha sido bem reconhecido na regulação da biologia endotelial. Isso tem sido visto em áreas como a indução de mudanças na forma da célula e orientação, secreção e organização, proliferação e diferenciação, sinalização intracelular, produção de proteínas do citoesqueleto e expressão gênica, maturação e estrutura do vaso, e as funções de barreira 37-47. A corrente em métodos in vitro para a formação finaltubos othelial geralmente dependem de células endoteliais '(ECs) auto-organização, com ou sem as células mesenquimais da matriz extracelular (ECM) (colagénio do tipo I, fibrina ou Matrigel) 48-54. Embora estas culturas foram modelados com sucesso vários comportamentos microvasculares, os vasos artificiais formadas por um processo aleatório da morfogênese falta a reprodutibilidade espacial desejada e orientação. Além disso, o impacto sobre a estabilidade do fluxo microvascular permanece largamente desconhecido, porque estes vasos automontadas não facilmente combinar o fluxo de luz, com uma organização em 3D tubular 55, o que representa um desafio para os vasos sanguíneos de engenharia para ter as funções de barreira e de estabilidade a longo prazo vascular.
Microfluidic sistemas têm provado ser prático e útil para a introdução de uma variedade de fluxos de análise bioquímica e biológica 56,57. A nossa abordagem proporciona um modo conveniente de introduzir o fluxo de fluido sobre as células em cultura. Nós usamos umadvanced bomba de seringa controlada remotamente para alcançar um controlo de fluxo conveniente, mas estável e precisa através dos microcanais para cultura de células de longo prazo (entre 4 dias e duas semanas).
3. A cultura celular no chip
Oxidação assistida por plasma dos microcanais PDMS introduz grupos silanol (SiOH) nas superfícies, que torne a superfície hidrofílica e auxilia na mais revestimentos proteicos. Diferentes proteínas ECM (fibronectina, gelatina e colagénio) foram testadas para a ligação de células, e o melhor resultado foi encontrado para ser revestimento fibronectina. As HUVECs foram preparadas a uma concentração de 3 x 10 6 células / ml em meio de cultura suplementado com 8% de dextrano (70 kDa) para a semeadura. Dextrano aumenta a viscosidade dos meios de comunicação para permitir um bom controle sobre a densidade de semeadura de ECs.
Uma monocamada confluente foi desenvolvido entre 2-4 dias dos HUVECs serem expostos a um fluxo médio constante. Para visualizar as células após acultura celular, foi rotulado com coloração de células de membrana e de coloração de núcleos corantes, estes corantes exibiu citotoxicidade inferior 58. Nós coraram as células como uma monocamada aderente cultivadas no chip. Um total de PBS 1x lavagem é necessária para evitar corantes adicionais retidas dentro do chip.
Em resumo, a combinação de refluxo técnica fotossensível e replicação de PDMS, a rede de microcanais múltiplos profundidade aproximada foi desenvolvida por uma superfície circular e os diâmetros dos canais em cada bifurcação aproximadamente obedecem à lei de Murray. As variações de tensão de cisalhamento em diferentes níveis de ramificação pode ser minimizado na sua rede de canais de microfluidos fabricado. Além disso, os resultados de cultura de células indicaram a condição saudável das células endoteliais. Assim, os microcanais-on-a-chip reendotelizados desenvolvido proporciona uma abordagem rápida e reprodutível para criar circular em corte transversal de várias de ramificação e multidepth redes de microcanais, que imita ageometria de microvasos in vivo. O procedimento ilustra a utilização das capacidades únicas em micromanufactura e tecnologias avançadas de microfluidicos para criar um modelo de microvasos com um longo prazo, o controlo de perfusão contínua, bem como de elevada qualidade e em tempo real, a capacidade de criação de imagens. Com o aumento da utilidade de canais microfluidicos de biologia celular, engenharia de tecidos, e aplicações de bioengenharia, os microcanais-on-a-chip reendotelizados é um ensaio de pesquisa para potenciais microvascular.
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Disclosures
Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.
Acknowledgments
Esta pesquisa foi parcialmente financiado pela National Science Foundation (NSF 1227359), WVU programa EPSCoR financiado pela National Science Foundation (EPS-1003907), WVU escritório ADVANCE patrocinado pela National Science Foundation (1.007.978), e WVU PSCoR, respectivamente. O trabalho foi feito em microfabricação WVU compartilhados Instalações de pesquisa (instalações de salas limpas) e Microfluidic Integrative Research celular no Laboratório Chip (microchip Lab) na West Virginia University. A imagem confocal foi feito em WVU Microscópio Facility Imaging.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent/Material | |||
| Reflow Photoresist | AZ Electronic Materials | AZP4620 | |
| Developer | AZ Electronic Materials | AZ 400K | |
| PDMS | Dow Corning Corporation | Sylgard 184 | |
| MCDB 131 Culture Medium | Invitrogen | 10372-019 | |
| NacBlue Nuclei Staining | Invitrogen | H1399 | |
| PKH Red Stain | Sigma | MINI26 and PKH26GL | |
| Fibronectin | Gibco | PHE0023 | |
| L-Glutamine | Sigma | G7513 | |
| Phosphate Buffered Saline | Invitrogen | 14040-133 | |
| HEPES Buffered Saline Solution | Lonza | CC-5024 | |
| Trypsin/EDTA | Invitrogen | 25300-062 | |
| Trypsin Neutralizing Solution | Lonza | CC-5002 | |
| PDMS Curing Agent | Dow Corning Corporation | Sylgard 184 | |
| Primary Human Umbilical Vein Endothelial Cells | Lonza | CC-2517 | |
| Fetal Bovine Serum | Lonza | 14-501F | |
| Diluent C | Sigma | CGLDIL | |
| Hoechst33342 | Invitrogen, Molecular Probes | R37605 | |
| Dextran | Sigma | 95771 | |
| 3.5% Paraformaldehyde | Electron Microscopy Science | 15710-S | |
| Equipment | |||
| Spinner | Laurell Technologies Corporation | WS-400BZ-6NPP/LITE | |
| Desiccator | BelArt Products | 999320237 | |
| Inverted Microscope | Nikon | Eclipse Ti | |
| Syringe Pump System | Harvard Apparatus | PHD Ultra | |
| Laminar Biosafety Hood | Thermo Scientific | 1300 Series A2 | |
| Planetary Centrifugal Mixer | Thinky | ARE-310 | |
| Isotemp Oven | Fisher Scientific | 13-246-516GAQ | |
| Optical Microscope | Zeiss | Invertoskop 40C | |
| Plasma Cleaner | Harrick Plasma | PDC-32G | |
| Hotplate | Barnstead/Thermolyne Cimarec | SP131635 | |
| Laser Scanning Confocal Microscope | Zeiss | LSM 510 |
References
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