Summary
Una piattaforma microcanali-on-a-chip è stato sviluppato dalla combinazione di tecnica fotolitografica reflowable photoresist, litografia soft, e microfluidica. La piattaforma microcanali endothelialized imita il tridimensionale (3D) geometria in vivo microvasi, corre sotto flusso perfusione continua controllato, permette l'imaging di alta qualità e in tempo reale e può essere applicato per la ricerca microvascolare.
Abstract
Gli sforzi si sono concentrati sullo sviluppo di test in vitro per lo studio dei microvasi, perché in vivo sugli animali sono più in termini di tempo, costosa, e l'osservazione e quantificazione sono molto impegnativo. Tuttavia, convenzionale in microvasi saggi in vitro hanno dei limiti quando rappresentano in vivo microvasi rispetto alla geometria tridimensionale (3D) e di fornire il flusso del fluido continuo. Usando una combinazione di tecnica fotolitografica reflowable photoresist, litografia soft, e microfluidica, abbiamo sviluppato un multi-profondità endothelialized trasversali circolari microcanali-on-a-chip, che imita la geometria 3D in vivo microvasi e gira sotto perfusione continua controllata flusso. Un fotoresist positivo reflowable stato usato per fabbricare uno stampo matrice con una rete di microcanali sezione trasversale semicircolare. Dall'allineamento e incollaggio dei due polidimetilsilossano (PDMS) microcanali replicated dallo stampo maestro, è stata creata una rete di microcanali cilindrica. I diametri dei microcanali possono essere ben controllate. Inoltre, le cellule endoteliali della vena ombelicale umana (HUVEC primarie) seminate all'interno del chip hanno mostrato che le cellule allineate la superficie interna dei microcanali sotto perfusione controllata duraturo per un periodo di tempo compreso tra 4 giorni a 2 settimane.
Introduction
Microvasi, come parte del sistema di circolazione, mediare le interazioni tra sangue e tessuti, sostenere attività metaboliche, definire microambiente tissutale, e gioca un ruolo critico in molte condizioni patologiche e salute. Ricapitolazione dei microvasi funzionali in vitro potrebbe fornire una piattaforma per lo studio dei fenomeni vascolari complesse. Tuttavia, convenzionale in vitro microvasi saggi, come il test di migrazione delle cellule endoteliali, saggi di formazione endoteliali tubo, e di ratto e topo saggi anello aortico, sono in grado di ricreare in vivo microvasi rispetto a tre dimensioni (3D) geometria e il controllo di flusso continuo 1-8. Studi di microvasi utilizzando modelli animali e in vivo, come il saggio di angiogenesi corneale, pulcino corioallantoidea membrana saggio angiogenesi, e il dosaggio spina Matrigel, sono di più in termini di tempo, ad alto costo, sfidando rispetto alla osservazione e quantificazioni, esollevare questioni etiche 1, 9-13.
I progressi nella micromanufacturing e tecnologie nell'ambito dei chip microfluidici hanno permesso una serie di intuizioni in scienze biomediche, mentre limitare gli alti costi sperimentali e le complessità associati con gli animali e in vivo studi 14, come le condizioni biologiche controllate facilmente e saldamente e ambienti fluidi dinamici, che non avrebbero stato possibile con tecniche convenzionali macroscala.
Qui vi presentiamo un metodo per costruire un endothelialized microcanali-on-a-chip che imita la geometria 3D in vivo microvasi e gira sotto flusso di perfusione continua controllato utilizzando la combinazione di tecnica fotolitografica reflowable photoresist, litografia soft, e microfluidica.
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Protocol
1. Fotolitografia Fabbricazione di Photoresist Maestro Mold
Il seguente protocollo mostra il processo per fabbricare i microcanali con diametri tra 30-60 micron. Per ottenere un microcanali con un diametro più piccolo (meno di 30 um), un singolo spin-coating di photoresist è necessario.
- Trasferire il photoresist reflow dal frigorifero a 4 ° C per la camera sterile 24 ore prima dell'uso e lasciarla a temperatura ambiente.
- Pulire un wafer di silicio e cuocere per un ora a 150 ° C per lasciarlo disidratare. La disidratazione assisterà il photoresist adesione al substrato di silicio.
- Spin-coat il primo strato di fotoresist usando la seguente ricetta:
| Passo | Tempo (secondi) | Velocità (rpm) | Accelerazione |
| 1 | 2 </ Td> | 300 | più alto |
| 2 | 10 | 0 | |
| 3 | 3 | 300 | più alto |
| 4 | 60 | 600 | più alto |
| 5 | 10 | 500 | più alto |
| 6 | 10 | 600 | più alto |
- Poi, cuocere il wafer su una piastra con una temperatura di 110 ° C per 90 sec. Dopo la cottura morbida lo spessore del fotoresist sarà 20-30 micron.
- Spin cappotto un secondo strato di fotoresist con la stessa formulazione utilizzata per il primo strato.
- Morbido cuocere nuovamente il wafer ponendolo su una piastra con una temperatura di 110 ° C per 90 sec. Dopo questa cuocere morbido lo spessore del fotoresist sarà 40-60 micron.
- Generare i modelli maestri positivi esponendo il PhotoRESIST a luce UV con una dose di esposizione di 14.500 mJ / cm 2 attraverso una maschera pellicola.
- Diluire la sviluppatore con deionizzata (DI) (1:2 (v / v)). Risciacquare il wafer ripetutamente nella soluzione fino a quando il modello è completamente sviluppato. Quindi lavare il wafer con acqua deionizzata e asciugare con gas azoto.
- Reflow: Posizionare il wafer su una piastra con una temperatura di 120 ° C per 4 min e coprire con un piatto di vetro Petri per evitare l'evaporazione del solvente. Togliere la cialda dalla piastra e lasciarla raffreddare a temperatura ambiente. Lo spessore fotoresist dopo la rifusione sarà 50-60 micron.
2. Morbido litografia Fabbricazione di PDMS Microchannel Network
- Preparare polydimethylsiloxane soluzione (PDMS) al rapporto di peso di 10:1 (base: catalizzatore) e mescolare accuratamente con un mescolatore planetario centrifuga.
- Gettate la soluzione PDMS sullo stampo maestro photoresist ridisposto. Posizionare il PDMS colato in un essiccatore per 15 minuti a Degas. Usare il gas azoto per eliminare eventuali bolle rimanenti se necessario.
- Cuocere la PDMS in forno ad una temperatura di 60 ° C per 3 ore per permettere a polimerizzare. Quindi rimuovere lo strato di PDMS curata dallo stampo master.
- Usare un perforatore affilato per creare fori di ingresso / uscita da buchi nella rete di canali di punzonatura. Pulire la superficie del PDMS con gas azoto.
- Trattare due strati PDMS con plasma di ossigeno per 30 secondi all'interno di un pulitore plasma ad una pressione di 4,5 x 10 -2 Torr e un flusso di ossigeno di 3,5 m 3 / min. Poi, allineare le superfici del PDMS manualmente al microscopio ottico. Utilizzare una goccia d'acqua, se necessario per un migliore controllo dell'allineamento.
- Cuocere il dispositivo in un forno a 60 ° C per 30 minuti per ottenere l'unione permanente.
3. Cultura HUVEC e semina nel chip
- Cultura delle HUVEC con terreno di coltura con la L-glutamina supplementato con 10% siero fetale bovino (FBS). Per Thsono stati utilizzati posta esperimento passaggi tra 2 e 5.
- Una volta che le HUVEC sono confluenti, contare le cellule e raccoglierle dalle prime risciacquo le cellule con soluzione salina tamponata con HEPES (HEPES-BSS), e poi trattare le cellule con tripsina / EDTA e incubare per 2-6 minuti a 37 ° C. Dopo la tripsinizzazione è completa, neutralizzare la tripsina / EDTA soluzione neutralizzante con tripsina. Centrifugare e sospendere le cellule nel terreno di coltura con l'8% di destrano per raccoglierli. Destrano è stato usato per aumentare la media viscosità per facilitare una migliore semina cellulare e attaccamento.
- Trattare il dispositivo con plasma di ossigeno per 5 minuti con una pressione di 4,5 x 10 -2 Torr e un flusso di ossigeno di 3,5 m 3 / min. Quindi caricare il dispositivo con acqua deionizzata e trattare con la luce UV per 8 ore in un biosicurezza cappa laminare per la sterilizzazione.
- Un giorno prima che le cellule sono pronte, lavare l'apparecchio con 1x tampone fosfato (PBS 1x) poi cappotto con fibronectina (100 mg / ml, dilbuite con 1x PBS) e incubare in frigorifero a 4 ° C durante la notte.
- Dopo il rivestimento fibronectina, lavare il dispositivo con PBS 1x quindi caricare con mezzo di coltura. Incubare il dispositivo a una temperatura di 37 ° C per 15 min.
- Caricare le cellule HUVEC in 8% destrano mezzo di coltura con una concentrazione cellulare di 3-4 x 10 6 cellule / ml. Posizionare una gocciolina 20 microlitri di cellule ad un ingresso del dispositivo e inclinarlo introdurre le cellule nel canale microfluidica. Dopo 15-20 minuti le cellule cominceranno ad attribuire alle pareti laterali dei canali. Ruotare il dispositivo ogni 15 min per creare una distribuzione più uniforme delle cellule. Se necessario, un carico addizionale può essere eseguita.
4. Setup perfusione a lungo termine
Dopo 5-6 ore di cultura statica, i HUVECs allegate inizieranno a diffondersi completamente fuori. Impostare perfusione utilizzando un sistema di pompa a siringa con telecomando e un flusso costante di 10 ml / h. Perfusione può essere regolato fo una portata maggiore, e può durare per un periodo di tempo compreso tra 4 giorni a 2 settimane.
5. Cella di colorazione e del microscopio Caratterizzazione
- Quando le cellule raggiungono confluenza all'interno del dispositivo, in primo luogo, lavare il dispositivo con 1x PBS per rimuovere completamente il mezzo. Quindi caricare il dispositivo con colorante rosso diluito con diluente (4 microlitri-1 ml). Caricare il colorante simile alla procedura di caricamento delle cellule. Incubare il dispositivo al buio per 5 minuti a temperatura ambiente, e poi lavare il dispositivo con terreno di coltura per fermare la colorazione. Lunga incubazione del colorante può causare tossicità cellulare e disadhesion.
- Caricare il dispositivo con il colorante blu diluito con PBS 1x (2 gocce per ml). Incubare al buio per 5 minuti a temperatura ambiente, poi lavare accuratamente il dispositivo con PBS 1x.
- Esaminare la colorazione delle cellule al microscopio ottico invertito. Se la colorazione è stata buona, caricare i microcanali con il mezzo di fissaggio (3,5% paraformaldeide diluito con PBS 1x), quindi immergereil dispositivo di fissaggio a medio e coprire completamente con foglio di alluminio. Conservare il dispositivo in frigorifero a una temperatura di 4 ° C per evitare che il dispositivo si secchi e photobleaching. Il dispositivo fisso è ora pronto per l'imaging confocale, che può essere fatto da un microscopio confocale a scansione laser.
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Representative Results
Il nostro approccio per fabbricare la rete di microcanali multi-profondità imita le complesse geometrie 3D di microvasi in vivo, in cui i microcanali sono arrotondate sezioni trasversali 15. Inoltre, i diametri dei canali di ramificazione madri ei canali figlia circa obbediscono legge di Murray per mantenere il flusso di fluido ad un livello desiderato in modo che la resistenza complessiva del canale è bassa e velocità di flusso sono più uniforme in tutta la rete 16-18. I processi e risultati per la fabbricazione di uno stampo maestro fotoresist semicircolare e una rete di microcanali PDMS sezione trasversale circolare sono stati dimostrati in film 1, figura 2, e film 2, rispettivamente. Le caratteristiche geometriche della rete microcanali PDMS sono stati caratterizzati e mostrati in Figura 2. I nostri risultati mostrano che la tecnica reflow fotosensibile in grado di creare reti multi-profondità ramificazione canale ina più conveniente approccio con tecniche reflow photoresist, e consentire la progettazione di sistemi biomimetici microvascolari cui circa obbedire alla legge di Murray.
In molti modelli in vitro, cellule vascolari sono normalmente coltivati su piastre piane, filtri o questi substrati rivestiti con idrogel. In queste condizioni i microvasi sono generate casualmente cellulare autoassemblaggio. Inoltre, saggi convenzionali hanno difficoltà intrinseche a produrre un flusso costante su cellule endoteliali. La mancanza di un lungo periodo e continuo flusso multimediale impedisce la capacità di mantenere la stabilità del monostrato cellulare endoteliale tramite opportune funzioni di barriera. Nel nostro modello, il beneficio che applicano microfluidica è la convenienza per l'accesso fluido e controllo (variando le portate, durata e modelli) così come sbarazzarsi di rifiuti. Dimostriamo i processi di vena ombelicale cellule endoteliali umane primarie (HUVEC) semina nei microcanali e impostiamo ting un sistema di perfusione fluido lungo termine per coltura cellulare (Figura 3). Inoltre, a causa delle complesse geometrie del microcircolo in vivo, monitoraggio in tempo reale di quei piccoli vasi è difficile. Il chip sviluppato basato PDMS offre buone proprietà ottiche e permette l'imaging di alta qualità e in tempo reale dei microcanali endothelialized. (Figure 4 e Movie 3)
Movie 1. Schematici procedure di fabbricazione per stampi maestri photoresist. Inizialmente, un substrato di silicio pre-pulito è stato preparato. Lo strato fotosensibile riflusso positivo è stato spin-rivestito sul substrato di silicio ed è stata cotta ed essiccata. Il fotoresist è stato esposto a luce UV attraverso una maschera modellata, e poi, sono stati sviluppati i microcanali fantasia. Una rete di microcanali sezione trasversale semicircolare stato creato dopo il riflusso a 120 ° C per 4 min."target =" _blank movie1.wmv "> Clicca qui per vedere film.
Figura 1. SEM mostra il fotoresist sviluppato a) prima reflow;. B) dopo la rifusione; c) modellato PDMS mostra la sezione trasversale del resist prima reflow; l'immagine mostra una sezione trasversale rettangolare; d) modellato PDMS che mostra una sezione trasversale semicircolare della resistere dopo reflow; La sezione trasversale dopo la rifusione era controllata dalla dimensione disegno iniziale del modello e la temperatura di riflusso. (Ristampato con il permesso di Riferimento 15). Clicca qui per ingrandire la figura .
Movie 2. Le procedure di fabbricazione schematiche per cilindrica rete di microcanali in PDMS. Una soluzione PDMS è stata colata su stampo photoresist e curata in forno ad una temperatura di 60 ° C per 3 ore. Due strati identici PDMS crudi, ognuno dei quali ha una rete di microcanali sezione trasversale semicircolare, sono stati allineati e legati insieme per formare microcanali con sezione circolare. Clicca qui per visualizzare filmati .
Figura 2. a) Una rete di microcanali cilindrica allineati e legati in PDMS. bd) Circolare sezioni di stampi PDMS mostrano dimensioni di canale a ciascun livello di ramificazione (1-1 ', 2-2' e 3-3 '). Inoltre, questi dati dimostrano la creazione di una rete di canali multidepth circolare in sezione trasversale e multibranching microfluidica.
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Figura 3. Diagramma schematico che mostra la perfusione lungo termine attraverso il chip utilizzando una pompa a siringa telecomandato.
Figura 4. Immagini microscopia con colorante fluorescente membrana cellulare (rosso) e cellule di colorante (blu) mostrano nucleare che la linea HUVECs la superficie interna di una rete di microcanali cilindrico in diverse regioni di ramificazione. A) alto, b) Medio, ec) Bottom. D) immagine microscopia confocale mostra la vista in sezione trasversale circolare del HUVECs costeggiano il canale di rete. Barre di scala: 100 micron.
Movie 3. Filmato confocale che mostra il rivestimento delle cellule lungo la rete dei canali circolari."target =" _blank iles/ftp_upload/50771/50771movie3.wmv "> Clicca qui per vedere film.
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Discussion
1. Muffa fabbricazione Maestro
Uno dei principi di progettazione e di guida per morfometria vascolare è nota come legge di Murray 16, in cui si afferma che la distribuzione dei diametri dei vasi in tutta la rete è governata da corrispettivo minimo di energia. Si precisa inoltre che il cubo dei diametri di un vaso parente ad una biforcazione uguale alla somma dei cubi dei diametri dei vasi figlia ( 
) 19 Inoltre, la legge di Poiseuille è stato utilizzato per stimare l'ampiezza della tensione tangenziale nella maggior parte della vascolarizzazione 
. in cui1eq3.jpg "src =" / files/ftp_upload/50771/50771eq3.jpg "width =" 25px "/> è lo sforzo di taglio emodinamico, μ è la viscosità del sangue, Q è la portata, e R è il raggio della vaso 20,21. Per biforcazioni simmetriche, una conseguenza importante basato sulla legge di Murray e legge di Poiseuille è che la tensione tangenziale muro rimane costante per tutta la rete vascolare. Così, per una rete simmetrica canale microfluidico fabbricato con sezioni circolari, se il canale dimensioni di legge di biforcazioni obbedire Murray, lo sforzo di taglio vissuta dalle cellule endoteliali dovrebbero essere costante a diversi canali di ramificazione.
Molte tecniche e processi di microfabbricazione sono state applicate alla fabbricazione di microcanali utilizzati per cellule vascolari 22-25, tuttavia, i microcanali risultanti provocato rettangolare, quadrata o trapezoidale sezioni trasversali dei canali. Le sezioni rettangolari di canali sono constructed con spigoli vivi e le transizioni brusche di biforcazioni, in grado di imporre le più diverse sollecitazioni di taglio fluido e geometrie non fisiologici sulle cellule in posizioni di canali differenti, con conseguente variazioni nella fisiologia delle cellule 26,27.
Un processo di riflusso photoresist, risultante in un profilo arrotondato canale, prevede due fasi, 1) la fusione del fotoresist fantasia e il liquido resistono superfici vengono tirati in una forma che minimizza l'energia del sistema 28,29 e 2) un raffreddamento e fase di solidificazione segue il processo di fusione. Le forme dei canali reflowed sono ben approssimata da una superficie semicilindrica. Seguito da ridisposto maestro stampo fabbricazione, un approccio standard litografia soft è stato usato per fabbricare la rete microfluidica PDMS canale con una sezione circolare. I nostri risultati hanno dimostrato che la tecnica reflow fotosensibile in grado di creare più profondità ramificate reti di microcanali in un più straight approccio in avanti, e ci permette di progettare sistemi biomimetici microvascolari che circa obbedire alla legge di Murray e imitano la geometria in vivo microcircolo, in modo che la resistenza complessiva del canale è bassa, e le variazioni di stress shear a diversi livelli di ramificazione possono essere minimizzati nel fabbricato rete di canali microfluidica.
I microvasi sanguigni fisiologiche adottare una sezione approssimativamente circolare con raggi tra 30-300 micron 30. Le dimensioni per la rete di microcanali dimostrato in questo documento sono state variate a circa 60 micron a 100 micron a diversi livelli di ramificazione. Per fabbricare microcanali con diversa gamma di diametri per imitare in vivo microvasi, si consiglia di utilizzare un solo strato reflow spun resistere (limitato a 30 micron) o di altro minore viscosità resiste. Per un microcanali con un diametro più grande (30-60 micron), una procedura doppio rivestimento può essere applicato per ottenere una pellicola di fotoresist più spessa15. Ulteriori spin-rivestimenti sopra due strati deve essere evitato per prevenire spessore non uniforme, che può risultare in una dose di esposizione imprecisa. Per uno spessore superiore a 60 micron, sono raccomandati altri fotoresist reflow viscosi elevati.
In una condizione ideale, per fabbricare un resist stampo con una sezione trasversale semicircolare, lo spessore del film può essere inizialmente predeterminato dando una larghezza e la lunghezza focale del microcanale come 
, Dove H è lo spessore del film richiesto spun-, r è la metà della larghezza del canale, R è il raggio di curvatura costante, h è l'altezza centrale della curvatura, ed E è il rapporto di resistere volumi del microcanale prima e dopo reflow 31. Per una superficie cilindrica di una data larghezza di microcanali, un particolare volume del resist è ridesiderata. Tuttavia, sono stati segnalati diversi parametri di incidere il photoresist ridisposto e rendere i profilati a canale risultava più complessi quali angolo critico e movimento confine tra il fotoresist e il substrato solido, evaporazione materiale durante il riflusso di cottura, temperatura e tempo per il processo di riflusso, degassamento, substrato di uniformità, e resistere proprietà di 32-34. Per esempio, la temperatura di riflusso e temporizzazione può comportare una variazione di volume che causa il movimento di confine e quindi variando l'angolo critico e finale ridisposti resistere profilo 33. Come riportato dal nostro precedente lavoro 15, il processo di rifusione diminuito la larghezza del canale del 2%, in media, a causa della riduzione dei volumi di photoresist e movimento confine. Inoltre, il volume per ottenere una superficie cilindrica deve tenere conto dell'effetto di evaporazione del materiale durante il processo di riflusso 35,36. Se sono richieste superfici cilindriche con raggi differenti tramiteuna rete di microcanali è necessario variare la larghezza dei microcanali, causando variazioni di volume in regioni diverse della rete 15. Per realizzare con successo una rete di canale cilindrico con diametri diversi, la resiste larghezze / volumi, temperature di reflow e tempi, angoli critici, movimento confine, resistere viscosità e protocolli spin coating e le proprietà del substrato deve essere considerato e collaudato.
2. Coltura cellulare a lungo termine
L'importanza del flusso e il relativo muro tensione tangenziale è stato ben riconosciuto nella regolazione biologia endoteliale. Questo è stato visto in aree come indurre cambiamenti nella forma delle cellule e l'orientamento, la secrezione e l'organizzazione, la proliferazione e la differenziazione, di segnalazione intracellulare, la produzione di proteine del citoscheletro e di espressione genica, la maturazione dei vasi e la struttura e le funzioni di barriera 37-47. La corrente di metodi in vitro per formare finetubi othelial genere si basano su cellule endoteliali '(EC) auto-organizzazione con o senza cellule mesenchimali in matrice extracellulare (ECM) (collagene di tipo I, fibrina o Matrigel) 48-54. Anche se queste culture hanno modellato con successo diversi comportamenti microvascolari, i vasi artificiali forma attraverso un processo casuale di morfogenesi manca la riproducibilità spaziale desiderata e orientamento. Inoltre, l'impatto del flusso sulla stabilità microvascolare rimane in gran parte sconosciuto, perché queste navi auto-assemblati non facilmente combinare il flusso luminale con un'organizzazione tubolare 3D 55, che presentano una sfida ai vasi sanguigni di ingegneria ad avere funzioni di barriera e di stabilità vascolare a lungo termine.
Sistemi microfluidici hanno dimostrato di essere pratico e utile per introdurre flussi a una varietà di analisi biochimiche e biologiche 56,57. Il nostro approccio fornisce un modo conveniente per introdurre il flusso di fluido sulle cellule coltivate. Abbiamo utilizzato unadvanced pompa a siringa telecomandato per realizzare un controllo di flusso conveniente ma costante e preciso attraverso i microcanali per colture cellulari a lungo termine (tra 4 giorni e 2 settimane).
3. Coltura cellulare nel chip
Ossidazione del plasma-assistita dei microcanali PDMS introduce gruppi silanolici (SiOH) sulle superfici che rende la superficie idrofila e favorisce ulteriori rivestimenti proteici. Diverse proteine ECM (fibronectina, gelatina e collagene) sono stati testati per l'adesione cellulare, e il miglior risultato è stato trovato per essere rivestimento fibronectina. Le HUVEC sono state preparate ad una concentrazione di 3 x 10 6 cellule / ml nel terreno di coltura addizionato con 8% destrano (70 kDa) per la semina. Destrano aumenta la viscosità dei mezzi di comunicazione per consentire un controllo preciso semina densità di EC.
Un monostrato confluente, sviluppata fra 2-4 giorni dei HUVECs essendo esposti ad un flusso medio costante. Per visualizzare le cellule dopo l'coltura cellulare, abbiamo etichettato cellule con colorazione di membrana e nuclei coloranti colorazione, questi coloranti esposti citotossicità inferiore 58. Abbiamo macchiato il cellule come un monostrato aderente coltivate nel chip. Un completo PBS 1x lavaggio è necessario per evitare coloranti supplementari intrappolate all'interno del chip.
In sintesi, dalla combinazione di reflow tecnica photoresist e replica PDMS, la rete di microcanali di multi-profondità sviluppata è stata approssimata da una superficie circolare ed i diametri del canale in ogni biforcazione circa obbediscono legge di Murray. Le variazioni di sollecitazione di taglio a diversi livelli di ramificazione può essere minimizzato nella rete canale microfluidico fabbricato. Inoltre, i risultati di coltura cellulare indica la condizione sana delle cellule endoteliali. Così, i microcanali-on-a-chip endothelialized sviluppati fornisce un metodo rapido e riproducibile per creare circolare in sezione trasversale multi-ramificazione e reti di microcanali multidepth, che imita l'geometria di microvasi in vivo. La procedura illustra l'uso di capacità uniche in micromanufacturing avanzate e tecnologie microfluidici per creare un modello microcircolo con un controllo di perfusione continua a lungo termine così come di alta qualità e in tempo reale capacità di imaging. Con la crescente utilità dei canali microfluidica per la biologia cellulare, ingegneria dei tessuti, e le applicazioni di bioingegneria, i microcanali-on-a-chip endothelialized è un potenziale test per la ricerca microvascolare.
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Disclosures
Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione.
Acknowledgments
Questa ricerca è stata in parte sostenuta dalla National Science Foundation (NSF 1.227.359), WVU programma EPSCoR finanziato dalla National Science Foundation (EPS-1.003.907), ufficio ADVANCE WVU sponsorizzato dalla National Science Foundation (1.007.978), e WVU PSCoR, rispettivamente. Il lavoro è stato fatto in microfabrication WVU condivise Istituti di ricerca (attrezzature per camere bianche) e microfluidica Integrative di ricerca cellulare sul Laboratorio Chip (microchip Lab) della West Virginia University. Il confocale è stato fatto a WVU Microscopio Imaging strumento.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent/Material | |||
| Reflow Photoresist | AZ Electronic Materials | AZP4620 | |
| Developer | AZ Electronic Materials | AZ 400K | |
| PDMS | Dow Corning Corporation | Sylgard 184 | |
| MCDB 131 Culture Medium | Invitrogen | 10372-019 | |
| NacBlue Nuclei Staining | Invitrogen | H1399 | |
| PKH Red Stain | Sigma | MINI26 and PKH26GL | |
| Fibronectin | Gibco | PHE0023 | |
| L-Glutamine | Sigma | G7513 | |
| Phosphate Buffered Saline | Invitrogen | 14040-133 | |
| HEPES Buffered Saline Solution | Lonza | CC-5024 | |
| Trypsin/EDTA | Invitrogen | 25300-062 | |
| Trypsin Neutralizing Solution | Lonza | CC-5002 | |
| PDMS Curing Agent | Dow Corning Corporation | Sylgard 184 | |
| Primary Human Umbilical Vein Endothelial Cells | Lonza | CC-2517 | |
| Fetal Bovine Serum | Lonza | 14-501F | |
| Diluent C | Sigma | CGLDIL | |
| Hoechst33342 | Invitrogen, Molecular Probes | R37605 | |
| Dextran | Sigma | 95771 | |
| 3.5% Paraformaldehyde | Electron Microscopy Science | 15710-S | |
| Equipment | |||
| Spinner | Laurell Technologies Corporation | WS-400BZ-6NPP/LITE | |
| Desiccator | BelArt Products | 999320237 | |
| Inverted Microscope | Nikon | Eclipse Ti | |
| Syringe Pump System | Harvard Apparatus | PHD Ultra | |
| Laminar Biosafety Hood | Thermo Scientific | 1300 Series A2 | |
| Planetary Centrifugal Mixer | Thinky | ARE-310 | |
| Isotemp Oven | Fisher Scientific | 13-246-516GAQ | |
| Optical Microscope | Zeiss | Invertoskop 40C | |
| Plasma Cleaner | Harrick Plasma | PDC-32G | |
| Hotplate | Barnstead/Thermolyne Cimarec | SP131635 | |
| Laser Scanning Confocal Microscope | Zeiss | LSM 510 |
References
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