Summary
En microchannels-on-a-chip plattform har utvecklats av en kombination av fotolitografiska omsmältbart fotoresist teknik, mjuk litografi och microfluidics. Den endothelialized mikrokanaler plattformen härmar tredimensionella (3D) geometri in vivo mikrokärl, springer under kontrollerade kontinuerlig perfusion flöde, möjliggör hög kvalitet och i realtid avbildning och kan sökas mikrovaskulära forskning.
Abstract
Ansträngningar har fokuserat på att utveckla in vitro-analyser för att studera mikrokärlen eftersom in vivo djurstudier är mer tidskrävande, dyra och observation och kvantifiering är mycket utmanande. Emellertid konventionell in vitro mikrokärlsbildning analyser har begränsningar när de representerar in vivo mikrokärl med avseende på tredimensionella (3D) geometri och tillhandahålla kontinuerlig vätskeflöde. Med en kombination av fotolitografisk omsmältbart fotoresist teknik, mjuk litografi och microfluidicsen, har vi utvecklat en multi-djup cirkulära tvärsnitt endothelialized mikrokanalerna-on-a-chip, som härmar 3D geometri in vivo mikrokärlen och körs under kontrollerad kontinuerlig perfusion flöde. En positiv flödas fotoresist användes för att tillverka ett huvudsakliga gjutformen med en halvcirkulär tvärsektion mikrokanaler. Genom anpassningen och bindning av de två polydimetylsiloxan (PDMS) mikrokanaler replicated från master mögel, en cylindrisk mikrokanaler skapas. Diametrarna hos mikrokanaler kan kontrolleras väl. Dessutom visade primära humana umbilikalven endotelceller (HUVEC) ympade inuti chipet att cellerna fodrade innerytan av mikrokanalerna under kontrollerad perfusion varar under en tidsperiod mellan 4 dagar till 2 veckor.
Introduction
Mikrokärl, som en del av cirkulationssystemet, förmedlar växelverkan mellan blod och vävnader, stödja metaboliska aktiviteter, definiera vävnaden mikromiljö, och spelar en avgörande roll i många hälso-och sjukdomstillstånd. Rekapitulation av funktionella mikrokärl in vitro kunde ge en plattform för studier av komplexa vaskulära fenomen. Men konventionell in vitro mikrokärlsbildning analyser, såsom endotelceller analyser cell migration, endotelceller rör analyser bildning och råtta och mus aorta analyser ring, kan inte återskapa in vivo mikrokärl avseende tredimensionella (3D) geometri och kontinuerlig flödeskontroll 1-8. Studier av mikrokärl med djurmodeller och in vivo, till exempel hornhinnan angiogenes analys, chick korioallantoismembranet angiogenes analys och Matrigel plug-analysen, är mer tidskrävande, hög kostnad, utmanande när det gäller observation och kvantifieringar, ochväcka etiska frågeställningar 1, 9-13.
Framsteg inom mikrotillverkning och mikrofluidiska teknik chip har möjliggjort en mängd insikter i biomedicinsk vetenskap samtidigt inskränka de höga experimentella kostnader och svårigheter i samband med djur och in vivo studier 14, som lätt och hårt kontrollerade biologiska förhållanden och dynamiska fluidiska miljöer, som inte skulle ha varit möjligt med konventionella makroskala tekniker.
Här presenterar vi en metod för att konstruera en endothelialized mikrokanalerna-on-a-chip som efterliknar 3D geometri in vivo mikrokärlen och körs under kontrollerade kontinuerlig perfusion flöde genom att använda en kombination av fotolitografiska omsmältbart fotoresist teknik, mjuk litografi och microfluidics.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Ett. Fotolitografi Tillverkning av fotoresist ledar Mögel
Följande protokoll beskriver processen att tillverka mikrokanaler med diametrar mellan 30 till 60 | im. För att få en mikrokanal med en mindre diameter (mindre än 30 ^ m), en enda spinnbeläggning av fotoresist behövs.
- Överför reflow fotoresist från kylskåp vid 4 ° C till renrummet 24 h före användning och låt den värmas till rumstemperatur.
- Rengör en kiselskiva och grädda den i en timme vid 150 ° C för att tillåta det att torka. Dehydratiseringen kommer att bistå fotoresist vidhäftning till kiselsubstratet.
- Spin-coat det första skiktet av fotoresist användning av följande recept:
| Steg | (Sekunder) | Hastighet (rpm) | Acceleration |
| 1 | 2 </ Td> | 300 | högsta |
| 2 | 10 | 0 | |
| 3 | 3 | 300 | högsta |
| 4 | 60 | 600 | högsta |
| 5 | 10 | 500 | högsta |
| 6 | 10 | 600 | högsta |
- Sedan baka skivan på en värmeplatta med en temperatur av 110 ° C under 90 sek. Efter den mjuka baka tjockleken av fotoresisten blir 20-30 um.
- Spin belägga ett andra skikt av fotoresist enligt samma recept som används för det första skiktet.
- Mjuk baka rånet igen genom att placera den på en värmeplatta med en temperatur på 110 ° C i 90 sekunder. Efter denna mjuka baka tjockleken av fotoresisten blir 40-60 um.
- Generera ett positivt ledar mönster genom att exponera photoresist för UV-ljus med en exponering dos av 14.500 mJ / cm 2 genom en film mask.
- Späd utvecklaren med avjoniserat (DI) vatten (01:02 (v / v)). Skölj skivan upprepade gånger i lösningen tills mönstret är fullt utvecklad. Tvätta sedan skivan med DI-vatten och torka den med användning av kvävgas.
- Reflow: Placera brickan på en värmeplatta med en temperatur av 120 ° C under 4 min och täck med ett glas petriskål för att förhindra lösningsmedelsavdunstning. Ta ut skivan från kokplattan och låt den svalna till rumstemperatur. Fotoresisten tjocklek efter omsmältning blir 50-60 um.
2. Soft Lithography Tillverkning av PDMS mikrokanaler
- Förbered polydimetylsiloxan (PDMS) lösning vid viktförhållandet 10:01 (bas: härdare) och blanda den grundligt med användning av en planetarisk centrifugalblandare.
- Kasta PDMS lösningen på återströmmas fotoresist mästare mögel. Placera gjutna PDMS i en exsickator under 15 minuter för att avgasa. Använd kvävgas för att avlägsna eventuella kvarvarande bubblor vid behov.
- Baka PDMS i en ugn vid en temperatur av 60 ° C under 3 timmar för att låta det härda. Ta sedan bort det härdade PDMS lagret från master mögel.
- Använd en vass hålslag att skapa inlopp / utlopp hål genom att stansa hål i kanalen nätverket. Rengör ytan av PDMS med användning av kvävgas.
- Behandla två PDMS skikt med syrgasplasma under 30 sekunder inuti en plasma renare vid ett driftstryck av 4,5 x 10 -2 Torr och en syre-flödeshastighet av 3,5 ft 3 / min. Passa sedan in de ytor PDMS manuellt under ett optiskt mikroskop. Använd en droppe vatten om det behövs för en bättre kontroll av anpassningen.
- Baka enheten i en ugn vid 60 ° C under 30 min för att uppnå varaktig bindning.
Tre. HUVEC Kultur och sådd i Chip
- Kultur de HUVECs med odlingsmedium med L-glutamin kompletterat med 10% fetalt bovint serum (FBS). För the experiment passager mellan 2 och 5 användes.
- När HUVECs är konfluenta, räkna cellerna och skörda dem genom att först skölja cellerna med HEPES-buffrad koksaltlösning (HEPES-BSS), och sedan behandla cellerna med trypsin / EDTA och inkubera i 2-6 min vid 37 ° C. Efter trypsinization är klar, neutralisera trypsin / EDTA med trypsin neutraliserande lösning. Centrifugera och suspendera cellerna i odlingsmedium med 8% dextran att samla in dem. Dextran har använts för att öka medelhög viskositet för att underlätta bättre cellsådd och fastsättning.
- Behandla enheten med syreplasma under 5 min med ett driftstryck på 4,5 x 10 -2 Torr och en syre-flödeshastighet av 3,5 ft 3 / min. Sedan ladda enheten med avjoniserat vatten och behandla med UV-ljus under 8 timmar i ett laminärt biosäkerhet huva för sterilisering.
- En dag innan cellerna är redo, tvätta anordningen med 1x fosfatbuffrad saltlösning (1 x PBS) och bestryk med fibronektin (100 pg / ml, dileras med 1 x PBS) och inkubera i kylskåp vid 4 ° C över natten.
- Efter fibronektin beläggningen, tvätta enheten med 1x PBS sedan ladda med odlingsmedium. Inkubera enheten vid en temperatur av 37 ° C under 15 min.
- Fyll på HUVEC-celler i 8% dextran odlingsmedium med en cell koncentration av 3-4 x 10 6 celler / ml. Placera en 20 pl droppe av celler vid ett inlopp hos anordningen och luta den för att introducera cellerna i mikroflödessystem kanal. Efter 15-20 min att cellerna kommer att börja att fästa till sidoväggarna hos kanalerna. Rotera enheten var 15 min för att skapa en mer enhetlig fördelning av celler. Vid behov kan ytterligare belastning utföras.
4. Långsiktig Perfusion Setup
Efter 5-6 h av statisk kultur, kommer de bifogade HUVECs börjar helt utspridda. Konfigurera perfusion med ett fjärrstyrt system för sprutpump med ett konstant flöde av 10 l / tim. Perfusion kan justeras feller en högre flödeshastighet, och kan pågå under en tidsperiod mellan 4 dagar till 2 veckor.
Fem. Cellfärgning och mikroskop Karakterisering
- När cellerna når sammanflödet inuti enheten, dels tvätta enheten med 1x PBS för att grundligt ta bort mediet. Sedan ladda enheten med röd färg utspädd med lösningsmedel (4 xl-1 ml). Fyll på färgämnet liknar cellbelastning förfarandet. Inkubera enheten i mörker under 5 min vid rumstemperatur, och sedan tvätta anordningen med odlingsmedium för att stoppa färgning. Lång inkubering av färgämnet kan orsaka cellulär toxicitet och disadhesion.
- Ladda enheten med blå färg utspädd med 1x PBS (2 droppar per ml). Inkubera i mörker under 5 min vid rumstemperatur sedan grundligt tvätta enheten med 1 x PBS.
- Undersök cellfärgning under ett inverterat optiskt mikroskop. Om färgningen var bra, laddar mikrokanalerna med fixeringsmedium (3,5% paraformaldehyd utspädd med 1x PBS), sedan dränkaenheten i fixeringsmedium och helt täcka den med aluminiumfolie. Förvara enheten i kylskåp vid en temperatur av 4 ° C för att förhindra enheten från att torka ut och fotoblekning. Den fasta enheten är nu klar för konfokal avbildning, vilket kan göras genom en laserskanning konfokalmikroskop.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vårt tillvägagångssätt att tillverka multi-djup mikrokanaler härmar de komplexa 3D-geometrier av in vivo mikrokärl, där mikrokanalerna har rundade tvärsnitt 15. Dessutom är diametrarna hos förälder förgrenade kanaler och kanalerna dotter lyda cirka Murray lag för att upprätthålla fluidflödet på en erforderlig nivå så att den totala kanalresistansen är låg och flödeshastigheter är mer enhetlig i hela nätverket 16 till 18. De processer och resultat för tillverkning av en halvcirkelformad fotoresist mästare mögel och ett cirkulärt tvärsnitt PDMS mikrokanaler visades i Movie 1, Figur 2, och Movie 2, respektive. De geometriska egenskaperna hos PDMS mikrokanaler karakteriserades och visas i Figur 2. Våra resultat visar att det fotoresist reflow tekniken kan skapa flera djupgående förgrening kanal nätverk ina mer praktiskt tillvägagångssätt genom fotoresist återflöde tekniker, och låta utforma mikrovaskulära biomimetiska system som ungefär lyder Murrays lag.
I många in vitro-modeller, är vaskulära celler normalt odlades på plana plattor, filter eller dessa substrat belagda med hydrogeler. Under dessa förhållanden mikrokärlen genereras slumpmässigt av cellulära självorganisering. Dessutom konventionella analyser har inneboende svårigheter att uppnå ett konstant flöde över endotelceller. Avsaknaden av en långsiktig och kontinuerlig media flöde förhindrar möjligheten att upprätthålla stabiliteten i endotelceller cellslager med lämpliga barriärfunktioner. I vår modell är fördelen med tillämpning microfluidics bekvämligheten för fluidåtkomst och kontroll (varierande flöden, varaktighet och mönster) samt att bli av med avfall. Vi visar processerna för primära humana navelvenendotelceller (HUVEC) sådd i mikrokanalerna och ställa ting ett långsiktigt vätska perfusionssystem för cellodling (Figur 3). Vidare, på grund av de komplexa geometrier in vivo mikrovaskulaturen är realtidsövervakning av dessa små fartyg svårt. Den utvecklade PDMS baserade chip erbjuder goda optiska egenskaper och möjliggör hög kvalitet och i realtid avbildning av endothelialized mikrokanalerna. (Figurerna 4 och Movie 3)
Film 1. Schematisk tillverkningsprocedurer för fotoresist mästare formar. Inledningsvis en förrengöras kiselsubstrat förberedd. Den positiva reflow fotoresistskiktet spinnbelades på kiselsubstratet och var i ugn och torkades. Fotoresisten exponerades för UV-ljus genom en mönstrad mask, och sedan var de mönstrade mikrokanalerna utvecklas. En halvcirkulär tvärsektion mikrokanaler skapades efter reflow vid 120 ° C under 4 min.movie1.wmv "target =" _blank "> Klicka här för att se filmen.
Figur 1. SEM visar framkallad fotoresist a) före återflöde,. B) Efter återflöde, c) gjutet PDMS visar tvärsnittet av resisten före omsmältning, bilden visar ett rektangulärt tvärsnitt, d) gjutet PDMS visar ett halvcirkulärt tvärsnitt av motstå efter reflowing; Tvärsnittet efter omsmältning kontrollerades av den ursprungliga dimensionen utformningen av mönstret och reflow temperatur. (Omtryckt med tillåtelse från ref 15). Klicka här för att visa en större bild .
Movie 2. De schematiska tillverkningsprocedurer för cylindriska mikrokanaler i PDMS. En PDMS lösning göts på den fotoresist form och härdades i ugn vid en temperatur av 60 ° C under 3 timmar. Två identiska härdade PDMS skikt, som alla har en halvcirkelformad tvärsektion mikrokanaler, hade samordnats och sammanbundna till bildning av mikrokanaler med cirkulära tvärsnitt. Klicka här för att se filmen .
Figur 2. a) En linje och bundet cylindrisk mikrokanaler i PDMS. bd) Cirkulär tvärsnitt av PDMS formar visar kanal dimensioner vid varje förgrening nivå (1-1 ', 2-2' och 3-3). Dessutom är dessa siffror visar att en multibranching och multidepth cirkulärt tvärsnitt mikroflödessystem kanal nätverk.
page = "alltid"> 
Figur 3. Schematiskt diagram som visar den långsiktiga perfusion genom chipet med hjälp av en fjärrstyrd sprutpump.
Figur 4. Mikroskopi bilder med hjälp av fluorescerande färgämne cellmembranet (röd) och cellkärnor färgämne (blå) visar att HUVECs linjen den inre ytan av ett cylindriskt mikrokanaler vid olika förgreningar regioner. A) Top, b) Mellanöstern, och c) Botten. D) Konfokalmikroskopi bilden visar den cirkulära tvärsnitt av HUVECs kantar kanalen nätverket. Skala barer: 100 uM.
Movie 3. Confocal film visar cellfodret längs den cirkulära kanalen nätverket.iles/ftp_upload/50771/50771movie3.wmv "target =" _blank "> Klicka här för att se filmen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Ett. Mästare mögel tillverkning
En av de designa och vägledande principer för vaskulär morfometri kallas Murrays lag 16, vilket innebär att utdelningen av fartyget diametrar hela nätverket styrs av minimal energi övervägande. Det anges också att kuben av diametrar på en förälder kärl vid en bifurkation är lika med summan av kuberna av diametrarna av dottern fartyg ( 
) 19 Dessutom har Poiseuilles lag använts för att beräkna storleken av skjuvspänningen i de flesta av vaskulaturen som 
. i vilken1eq3.jpg "src =" / files/ftp_upload/50771/50771eq3.jpg "width =" 25px "/> är den hemodynamiska skjuvspänningen är μ blodet viskositet, Q är flödeshastigheten, och R är radien på kärlet 20,21. För symmetriska förgreningar, en viktig konsekvens baserad på Murrays lag och Poiseuilles lag är att väggen skjuvspänningen förblir konstant under hela det vaskulära nätverket. Således en fabricerad symmetrisk mikroflödessystem kanal nätverk med cirkulära tvärsnitt, om kanalen mått på bifurcations lyda Murrays lag, bör den skjuvspänning upplevs av endotelcellerna vara konstant vid olika förgreningar kanaler.
Många mikrotillverkningstekniker och processer har använts för tillverkning av mikrokanaler används för vaskulära celler 22-25, resulterade dock de resulterande mikrokanaler i rektangulära, kvadratiska eller trapetsformade tvärsnitt av kanaler. De rektangulära tvärsnitt av kanalerna är konerade med skarpa hörn och abrupta övergångar vid förgreningar, som kan utdöma mycket varierande vätska skjuvspänningar och icke fysiologiska geometrier på celler i olika kanalpositioner, vilket resulterar i variationer i cellfysiologi 26,27.
En fotoresist omsmältningsprocessen, vilket resulterar i en rundad kanal profil, involverar två förfaranden, en) Smältningen av det mönstrade fotoresisten och den flytande motstå ytorna dras till en form som minimerar energin i systemet 28,29 och 2) en kyl-och stelnande fas följer smältningsprocessen. Formerna på återströmmas kanaler är väl approximeras med en halvcylindrisk yta. Följt av återströmmas huvudsakliga gjutformen tillverkning, var en standard mjuk litografi tillvägagångssätt används för att tillverka PDMS mikroflödessystem kanal nätverk med ett cirkulärt tvärsnitt. Våra resultat visade att fotoresist reflow teknik kan skapa flera djup förgrening Mikrokanalplattor nät på ett mer straight framåt tillvägagångssätt, och tillåter oss att designa mikrovaskulära biomimetiska system som ungefär lyder Murrays lag och härma geometri in vivo mikrocirkulation, så att den totala kanalresistansen är låg, och skjuv variationer stress på olika förgreningar nivåer kan minimeras i den tillverkade mikroflödessystem kanal nätverk.
De fysiologiska blod mikrokärl anta ett ungefär cirkulärt tvärsnitt med radier mellan 30-300 nm 30. Måtten för visat mikrokanaler i denna uppsats har varierat runt 60 pm till 100 pm på olika förgreningar nivåer. Att fabricera mikrokanaler med olika utbud av diametrar för att härma in vivo mikrokärl, rekommenderar vi att använda enkel spunnen skikt återflöde motstå (begränsat till 30 um) eller annan lägre viskositet motstår. För en mikrokanalplatta med en större diameter (30-60 um), kan en dubbel-beläggning förfarande tillämpas för att få en tjockare fotoresistfilm15. Ytterligare spin-beläggningar över två skikt bör undvikas för att förhindra ojämn filmtjocklek, vilket kan resultera i en felaktig exponering dos. För en filmtjocklek över 60 um, är andra högre viskösa reflow fotoresister rekommenderas.
I en idealisk tillstånd, att tillverka en resist gjutform med en halvcirkelformig tvärsektion, kan filmtjockleken initialt förutbestämd genom att ge en önskad bredd och brännvidd av mikrokanalen som 
, Där H är den erforderliga spun-filmtjocklek, r är hälften av kanalens bredd, R är den konstant krökningsradie, h är den centrala höjden av krökning, och E är förhållandet mellan resist volymer av mikrokanalen före och efter reflowing 31. För en cylindrisk yta med en given bredd av mikrokanalen, är en viss volym av resisten revade. Dock har flera parametrar har rapporterats påverka återströmmas fotoresist och göra de resulterade kanalprofiler mer komplex, såsom kritiska vinkeln och gränsen rörelse mellan fotoresist och det fasta substratet, material avdunstning under återflödet bakning, temperatur och timing för omsmältningsprocessen, avgasning, substrat likformighet, och motstå fastigheter 32-34. Exempelvis kan reflow temperatur och tid resultera i en volymändring orsakar gränsen rörelse och därmed variera den kritiska vinkeln och sista återströmmas motstå profil 33. Som rapporterats av vårt tidigare arbete 15 minskade omsmältningsprocessen de kanalbredder med 2% i genomsnitt på grund av fotoresist volymminskningar och gräns rörelse. Dessutom måste volymen för att få en cylindrisk yta för att ta hänsyn till inverkan av materialets avdunstning under omsmältningsprocessen 35,36. Om cylindriska ytor med olika radier krävs genomen mikrokanal nätverk är det nödvändigt att variera bredden av mikrokanalerna, vilket resulterar i variationer i volymerna vid olika regioner i nätverket 15. Att lyckas tillverka en cylindrisk kanal nätverk med olika diametrar, den motstår bredder / volymer, temperaturer återflöde och timing, kritiska vinklar, gräns rörelse, motstå viskositeter och spin protokoll beläggning och egenskaper substrat måste beaktas och testas.
2. Långsiktig cellkultur
Vikten av flödet och den tillhörande väggen skjuvspänningen har väl erkänt i reglering endothelial biologi. Detta har setts i områden såsom inducera förändringar i cellernas form och orientering, sekretion och organisation, proliferation och differentiering, intracellulära signalsystem, cytoskeleton protein produktion och genuttryck, kärl mognad och struktur, och barriärfunktioner 37-47. Strömmen i vitro-metoder för att bilda ändenothelial rör generellt förlita sig på endotelceller "(ECS) självorganisering med eller utan mesenkymala celler i extracellulär matrix (ECM) (typ I kollagen, fibrin, eller Matrigel) 48-54. Även dessa kulturer har framgångsrikt modellerat flera mikrovaskulära beteenden, de konstgjorda kärl som bildas genom en slumpmässig process för morphogenesis saknar önskad rumslig reproducerbarhet och orientering. Dessutom är effekten av flödet på mikrovaskulära stabilitet till stor del okända eftersom dessa egentillverkad fartyg inte enkelt kombinera luminala flödet med en 3D rörformat organisation 55, utgör en utmaning för fartyg tekniska blod att ha barriärfunktioner och långsiktig vaskulär stabilitet.
Mikroflödessystem system har visat sig vara praktiskt och användbart för införande av flöden till en mängd olika biokemiska och biologiska analyser 56,57. Vår metod ger ett bekvämt sätt att introducera vätskeflödet över de odlade cellerna. Vi använde enavancerad fjärrstyrd sprutpump för att uppnå en bekväm ändå stadig och exakt flödeskontroll genom mikrokanalerna för långsiktig cellkultur (mellan 4 dagar och 2 veckor).
Tre. Cellodling i chippet
Plasma-assisted oxidation av PDMS mikrokanalerna introducerar silanolgrupper (SiOH) på de ytor som gör ytan hydrofil och hjälpmedel i ytterligare protein beläggningar. Olika ECM-proteiner (fibronektin, gelatin och kollagen) testades för cellbindning, och det bästa resultatet befanns vara fibronektin beläggning. De HUVECs framställdes vid en koncentration av 3 x 10 6 celler / ml i odlingsmedium kompletterat med 8% dextran (70 kDa) för sådd. Dextran ökar viskositeten av media för att möjliggöra exakt kontroll över såddtäthet av EC.
En monolayer utvecklades mellan 2-4 dagar i HUVECs utsätts för en konstant medelhög flöde. För att visualisera cellerna efter dencellodling, märkt vi celler med membran färgning och kärnor färgämnen färgning, uppvisade dessa färgämnen lägre cytotoxicitet 58. Vi färgade cellerna som anhängare monolager odlas i chipet. En komplett 1x PBS tvätt är nödvändig för att förhindra extra färgämnen fångade inuti chipet.
Sammanfattningsvis, genom kombinationen av reflow fotoresist Teknik och PDMS replikation, var den utvecklade flera djup mikrokanaler approximeras med en cirkulär yta och kanal diameter i bägge bifurkation ungefär lyda Murray lag. Skjuvspänningen variationer vid olika förgreningar nivåer kan minimeras i fabricerade mikroflödessystem kanal nätverk. Dessutom visade resultaten från cellkultur den friskt tillstånd av endotelcellerna. Således, de utvecklade endothelialized mikrokanalerna-on-a-chip ger en snabb och reproducerbar metod för att skapa cirkulära tvärsnitt multi-förgrening och multidepth Mikrokanalplattor nätverk, som härmargeometri av in vivo-mikrokärl. Förfarandet illustrerar användningen av unika möjligheter i avancerad mikrotillverkning och mikrofluidiska teknik för att skapa en microvasculaturen modell med en långsiktig, kontinuerlig perfusion kontroll samt hög kvalitet och i realtid avbildande förmåga. Med den ökande nyttan av mikroflödessystem kanaler för cellbiologi, vävnadsteknik, och applikationer bioteknik, de endothelialized mikrokanalerna-on-a-chip är en potentiell analys för mikrovaskulära forskning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar att de inte har några konkurrerande ekonomiska intressen.
Acknowledgments
Denna forskning har delvis stöd av National Science Foundation (NSF 1.227.359), WVU EPSCoR program som finansieras av National Science Foundation (EPS-1.003.907), WVU ADVANCE kontor sponsras av National Science Foundation (1.007.978), och WVU PSCoR, respektive. Den mikrofabrikation arbetet gjordes i WVU delade forskningsresurser (Renrumsutrymmen) och Microfluidic integrativ Cellular Forskning om Chip Laboratory (mikrochip Lab) vid West Virginia University. Den konfokala avbildning gjordes vid WVU mikroskopavbildningssystemet Facility.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent/Material | |||
| Reflow Photoresist | AZ Electronic Materials | AZP4620 | |
| Developer | AZ Electronic Materials | AZ 400K | |
| PDMS | Dow Corning Corporation | Sylgard 184 | |
| MCDB 131 Culture Medium | Invitrogen | 10372-019 | |
| NacBlue Nuclei Staining | Invitrogen | H1399 | |
| PKH Red Stain | Sigma | MINI26 and PKH26GL | |
| Fibronectin | Gibco | PHE0023 | |
| L-Glutamine | Sigma | G7513 | |
| Phosphate Buffered Saline | Invitrogen | 14040-133 | |
| HEPES Buffered Saline Solution | Lonza | CC-5024 | |
| Trypsin/EDTA | Invitrogen | 25300-062 | |
| Trypsin Neutralizing Solution | Lonza | CC-5002 | |
| PDMS Curing Agent | Dow Corning Corporation | Sylgard 184 | |
| Primary Human Umbilical Vein Endothelial Cells | Lonza | CC-2517 | |
| Fetal Bovine Serum | Lonza | 14-501F | |
| Diluent C | Sigma | CGLDIL | |
| Hoechst33342 | Invitrogen, Molecular Probes | R37605 | |
| Dextran | Sigma | 95771 | |
| 3.5% Paraformaldehyde | Electron Microscopy Science | 15710-S | |
| Equipment | |||
| Spinner | Laurell Technologies Corporation | WS-400BZ-6NPP/LITE | |
| Desiccator | BelArt Products | 999320237 | |
| Inverted Microscope | Nikon | Eclipse Ti | |
| Syringe Pump System | Harvard Apparatus | PHD Ultra | |
| Laminar Biosafety Hood | Thermo Scientific | 1300 Series A2 | |
| Planetary Centrifugal Mixer | Thinky | ARE-310 | |
| Isotemp Oven | Fisher Scientific | 13-246-516GAQ | |
| Optical Microscope | Zeiss | Invertoskop 40C | |
| Plasma Cleaner | Harrick Plasma | PDC-32G | |
| Hotplate | Barnstead/Thermolyne Cimarec | SP131635 | |
| Laser Scanning Confocal Microscope | Zeiss | LSM 510 |
References
- Adair, T. H. Angiogenesis: Integrated systems physiology: from molecule to function to disease. , 1st edition, Biota Publishing. (2011).
- Goodwin, A. M. In vitro assays of angiogenesis for assessment of angiogenic and anti-angiogenic agents. Microvasc. Res. 74, 172-183 (2007).
- Smith, E. J., Staton, C. A. Tubule formation assays. Angiogenesis assays: A critical appraisal of current techniques. , John Wiley & Sons Ltd. West Sussex, UK. 65-87 (2006).
- Nakatsu, M. N., Davis, J. J., Hughes, C. C. W. Optimized fibrin gel bead assay for the study of angiogenesis. J. Vis. Exp. (3), e186 (2007).
- Nicosia, R. F., Ottinetti, A. Growth of microvessels in serum-free matrix culture of rat aorta. A quantitative assay of angiogenesis in vitro. Lab. Invest. 63, 115-122 (1990).
- Aplin, A. C., Fogel, E., Zorzi, P., Nicosia, R. F. The aortic ring model of angiogenesis. Methods Enzymol. 443, 119-136 (2008).
- Nicosia, R. F. The aortic ring model of angiogenesis: A quarter century of search and discovery. J. Cell. Mol. Med. 13, 4113-4136 (2009).
- Griffith, L. G., Swart, M. A. Capturing complex 3D tissue physiology in vitro. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 7, 211-224 (2006).
- Folkman, J. History of angiogenesis. Angiogenesis: An integrative approach from science to medicine. , Springer. (2008).
- Auerbach, R., Lewis, R., Shinners, B., Kubai, L., Akhtar, N. Angiogenesis assays: A critical overview. Clin. Chem. 49, 32-40 (2003).
- Auerbach, R., Akhtar, N., Lewis, R. L., Shinners, B. L. Angiogenesis assays: Problems and pitfalls. Cancer Metastasis Rev. 19, 167-172 (2000).
- Staton, C. A., Reed, M. W., Brown, N. J. A critical analysis of current in vitro and in vivo angiogenesis assays. Int. J. Exp. Pathol. 90, 195-221 (2009).
- Staton, C. A., Stribbling, S. M., et al. Current methods for assaying angiogenesis in vitro and in vivo. Int. J. Exp. Pathol. 85, 233-248 (2004).
- Moraes, C., Mehta, G., Lesher-Perez, S. C., Takayama, S. Organs-on-a-Chip: A focus on compartmentalized microdevices. Ann. Biomed. Eng. 40 (6), 1211-1227 (2012).
- Huang, Z., Li, X., Martins-Green, M., Liu, Y. Microfabrication cylindrical microfluidic channel networks for microvascular research. Biomedical Microdevices. 14 (5), 873-883 (2012).
- Murray, C. D. The physiological principle of minimum work applied to the angle of branching of arteries. J. Gen. Physiol. 9 (6), 835-841 (1926).
- Zamir, M., Medeiros, J. A. Arterial branching in man and monkey. J. Gen. Physiol. 79, 353-360 (1982).
- Gafiychuk, V. V., Lubashevsky, I. A. On the principles of the vascular network branching. J. Theor. Biol. 212, 1-9 (2001).
- Sherman, T. F. On connecting large vessels to small. The meaning of Murray's law. J. Gen. Physiol. 78 (4), 431-453 (1981).
- Kamiya, A., Bukhari, R., Togawa, T. Adaptive regulation of wall shear stress optimizing vascular tree function. Bull Math Biol. 46 (1), 127-137 (1984).
- LaBarbera, M. Principles of design of fluid transport systems in zoology. Science. 249, 992-1000 (1990).
- Emerson, D. R., Cieslicki, K., Gu, X., Barber, R. W. Biomimetic design of microfluidic manifolds based on a generalized Murray's law. Lab Chip. 6, 447-454 (2006).
- Lu, H., Koo, L. Y., et al. Microfluidic shear devices for quantitative analysis of cell adhesion. Anal. Chem. 76, 5257-5264 (2004).
- Shevkoplyas, S. S., Gifford, S. C., Yoshida, T., Bitensky, M. W. Prototype of an in vitro model of the microcirculation. Microvasc. Res. 65, 132-136 (2003).
- Kaihara, S., Borenstein, J., et al. Silicon micromachining to tissue engineer branched vascular channels for liver fabrication. Tissue Eng. 6, 105-117 (2000).
- Fisher, A. B., Chien, S., Barakat, A. I., Nerem, R. M. Endothelial cellular response to altered shear stress. Am. J. Physiol. Lung Cell. Mol. Physiol. 281 (3), L529-L533 (2001).
- Nerem, R. M., Alexander, R. W., et al. The study of the influence of flow on vascular endothelial biology. Am. J. Med. Sci. 316 (3), 169-175 (1998).
- Daly, D., Stevens, R. F., Hutley, M. C., Davies, N. The manufacture of microlenses by melting photoresist. Meas. Sci. Technol. 1 (8), 759-766 (1990).
- Schilling, A., Merz, R., Ossmann, C., Herzig, H. P. Surface profiles of reflow microlenses under the influence of surface tension and gravity. Opt. Eng. 39 (8), 2171-2176 (2000).
- Young, B., Heath, J. W. Wheater's functional histology: A text and colour atlas. , 4th edition, Churchill Livingstone. (2000).
- O'Neill, F. T., Sheridan, J. T. Photoresist reflow method of microlens production. Part 1: Background and experiments. Optik Int. J. Light Electron Opt. 113, 391-404 (2002).
- de Gennes, P. G. Wetting: statics and dynamics. Rev. Mod. Phys. 57, 827-863 (1985).
- Elias, H. G. An Introduction to Polymer Science. , VCH Publishers. New York. (1997).
- Voinov, O. V. Dynamic edge angles of wetting upon spreading of a drop over a solid surface. J. Appl. Mech. Tech. Phys. 40, 86-92 (1999).
- Daly, D., Stevens, R. F., Hutley, M. C., Davies, N. The manufacture of microlenses by melting photoresist. Meas. Sci. Technol. 1, 759 (1990).
- Jay, T. R., Stern, M. B. Preshaping photoresist for refractive microlens fabrication. Opt. Eng. 33, 3552-3555 (1994).
- Nerem, R. M., Alexander, R. W., et al. The Study of the influence of flow on vascular endothelial biology. Am. J. Med. Sci. 316 (3), 169-175 (1998).
- Chien, S., Li, S., Shyy, Y. J. Effects of mechanical forces on signal transduction and gene expression in endothelial cells. Hypertension. 31, 162-169 (1998).
- Li, Y. S., Haga, J. H., Chien, S. Molecular basis of the effects of shear stress on vascular endothelial cells. J. Biomech. 38, 1949-1971 (2005).
- Lee, E. J., Vunjak-Novakovic, G., Wang, Y., Niklason, L. E. A biocompatible endothelial cell delivery system for in vitro tissue engineering. Cell Transplant. 18, 731-743 (2009).
- Lee, E. J., Niklason, L. E. A novel flow bioreactor for in vitro microvascularization. Tissue Eng. Part C Methods. 16, 1191-1200 (2010).
- Chau, L., Doran, M., Cooper-White, J. A novel multishear microdevice for studying cell mechanics. Lab Chip. 9, 1897-1902 (2009).
- Meeson, A., Palmer, M., Calfon, M., Lang, R. A relationship between apoptosis and flow during programmed capillary regression is revealed by vital analysis. Development. 122, 3929-3938 (1996).
- Van Royen, N. J., Piek, J., Schaper, W., Bode, C., Buschmann, I. Arteriogenesis: mechanisms and modulation of collateral artery development. J. Nucl. Cardiol. 8, 687-693 (2001).
- Schaper, W. Therapeutic arteriogenesis has arrived. Circulation. 104 (17), 1994-1995 (2001).
- Tarbell, J. M. Shear stress and the endothelial transport barrier. Cardiovas. Res. 87 (2), 320-330 (2010).
- Potter, C. M., Lundberg, M. H., et al. Role of shear stress in endothelial cell morphology and expression of cyclooxygenase isoforms. Arterioscler. Thromb. Vasc Biol. 31, 384-391 (2011).
- Montesano, R. In vitro rapid organization of endothelial cells into capillary-like networks is promoted by collagen matrices. J. Cell Biol. 97, 1648-1652 (1983).
- Darland, D. C., D'Amore, P. A. TGF beta is required for the formation of capillary-like structures in three-dimensional cocultures of 10T1/2 and endothelial cells. Angiogenesis. 4 (1), 11-20 (2001).
- Lawley, T. J., Kubota, Y. Induction to morphologic differentiation of endothelial cells in culture. J. Invest. Dermatol. 93, 59S-61S (1989).
- Kanzawa, S., Endo, H., Shioya, N. Improved in vitro angiogenesis model by collagen density reduction and the use of type III collagen. Ann. Plast. Surg. 30, 244-251 (1993).
- Davis, G. E., Bayless, K. J., Mavila, A. Molecular basis of endothelial cell morphogenesis in three-dimensional extracellular matrices. Anat. Rec. 268, 252-275 (2002).
- Velazquez, O. C., Snyder, R., Liu, Z., Fairman, R. M., Herlyn, M. Fibroblast-dependent differentiation of human microvascular endothelial cells into capillary-like 3-dimensional networks. FASEB J. 16, 1316-1318 (2002).
- Donovan, D., Brown, N. J., Bishop, E. T. Comparison of three in vitro human "angiogenesis" assays with capillaries formed in vivo. Angiogenesis. 4, 113-121 (2001).
- Tang, D. G., Conti, C. J. Endothelial cell development, vasculogenesis, angiogenesis, and tumor neovascularization: an update. Semin. Thromb. Hemost. 30, 109-117 (2004).
- Takayama, S., McDonald, J. C., et al. Patterning cells and their environments using multiple laminar fluid flows in capillary networks. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96, 5545-5548 (1999).
- Cho, B. S., Schuster, T. G., et al. Passively driven integrated microfluidic system for separation of motile sperm. Anal. Chem. 75, 1671-1675 (2003).
- Parsa, H., Upadhyay, R., Sia, S. K. Uncovering the behaviors of individual cells within a multicellular microvascular community. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108 (12), 5133-5138 (2011).
