Summary
Nous présentons une méthode pour rapide, l'immobilisation réversible de petites molécules et des ensembles de nanoparticules fonctionnalisées pour résonance plasmonique de surface (SPR) des études, utilisant séquentielle sur puce chimie de cycloaddition bioorthogonal et anticorps-antigène capture.
Abstract
Procédés d'immobilisation de surface rapide de petites molécules bioactives avec contrôle sur l'orientation et la densité d'immobilisation sont hautement souhaitable pour les applications de biocapteurs et biopuces. Dans cette étude, nous utilisons une liaison covalente bioorthogonal très efficace [4 +2] de réaction de cycloaddition entre trans-cyclooctène (TCO) et le 1,2,4,5-tétrazine (Tz) pour permettre l'immobilisation de molécules microfluidique TCO / Tz-dérivées . Nous surveillons le processus en temps réel dans des conditions d'écoulement continu à l'aide de la résonance plasmonique de surface (SPR). Pour permettre l'immobilisation réversible et d'étendre la gamme expérimentale de la surface du capteur, on combine un composant de capture d'antigène-anticorps non covalente avec la réaction de cycloaddition. En présentant alternativement TCO ou Tz fragments à la surface du capteur, plusieurs processus de capture-cyclo sont désormais possibles sur une surface de capteur pour montage et d'interaction sur puce études d'une variété de structures multi-composants. Nous illustrate cette méthode avec deux expériences différentes d'immobilisation sur une puce de biocapteur; une petite molécule qui se lie, AP1497 FK506-binding protein 12 (FKBP12), et la même petite molécule dans le cadre d'une nanoparticule fonctionnalisée situ immobilisé et dans.
Introduction
Réactions de conjugaison efficaces sont des outils précieux pour la fixation de molécules bioactives de surfaces pour une variété d'applications de la biotechnologie. Récemment, le bioorthogonal très rapide [4 +2] de réaction de cycloaddition entre trans-cyclooctène (TCO) et le 1,2,4,5-tétrazine (Tz) a été utilisé pour marquer la surface des cellules, des structures sous-cellulaires, les anticorps et les nanoparticules 1. - 7 Ici, nous utilisons la réaction [4 +2] de cyclo en combinaison avec capture antigène / anticorps (TPS / anti-GST) pour la synthèse de structures multi-composants pour résonance plasmonique de surface (SPR) analyse de l'interaction réversible sur puce et de surveiller la processus en temps réel (Figure 1). 8,9 En particulier, la stratégie de capture-cycloaddition permet la régénération de la surface en utilisant un protocole établi. 8 En conséquence, l'assemblage de surfaces de détection stables avec le contrôle de l'orientation du ligand et de la densité pour la variété de nouvelle épreuve formats est désormais possible. Utilisationcette stratégie, nous avons démontré l'immobilisation de petites molécules TCO / Tz-dérivatisés et de caractériser les taux de cycloaddition dans une variété de conditions de tampon. Nous avons choisi l'interaction connue entre FKBP12 et un AP1497 molécule qui se lie à FKBP12 10 à 12, par exemple, pour vérifier que la stratégie de capture-cycloaddition conserve la capacité de la petite molécule d'interagir avec sa cible lorsque soit lié directement à des antigènes immobilisés sur la TPS ou à des nanoparticules immobilisées (PN).
Cette méthode présente plusieurs avantages. Premièrement, l'immobilisation réversible de petites molécules sur des puces de capteur est à présent possible. Deuxièmement, TCO / Tz immobilisation de petites molécules permet également des études d'interaction sans étiquette qui renversent l'orientation des études SPR canoniques, et peut fournir une vue complémentaire d'une interaction de liaison. Troisièmement, cette méthode permet la synthèse de nanoparticules ciblées microfluidique, et l'évaluation immédiate de leur binding propriétés. Cela promet d'améliorer l'efficacité de l'évaluation ou de dépistage nanoparticules ciblées, et aussi diminuer les quantités de nanoparticules nécessaires. 13-15 Quatrièmement, cette approche permet de mesurer la cinétique de réaction des réactions de cycloaddition bioorthogonal en temps réel sous flux continu. Enfin, l'immobilisation de la chimie TCO / Tz est robuste en présence de sérum. Dans l'ensemble, nous prévoyons que cette approche polyvalente sera largement faciliter la construction de surfaces de capteurs stables pour une grande variété d'études microfluidiques avec pertinence à in vitro et dans des applications cellulaires in vivo.
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Protocol
Une. Préparation de la TPS et de nanoparticules (NP) conjugués
- TPS-TCO préparation:
- Ajouter 8 pi de solution TCO-NHS (50 mM dans du DMSO) à 100 pi de TPS (1 mg / ml dans du PBS) et agiter le mélange à la température ambiante pendant 1 heure.
- Enlever l'excès de réactif en utilisant une colonne spin dessalage Zeba. Le filtrat récupéré contenant le conjugué GST-TCO est stocké à 4 ° C avant utilisation.
- TPS-Tz préparation:
- Ajouter 6 ul de solution Tz-NHS (25 mM dans du DMF) à 75 ul de GST (1 mg / ml dans du PBS) et agiter le mélange à température ambiante pendant 1 h.
- On dilue le mélange réactionnel avec 25 pi de PBS et on purifie en utilisant une colonne de dessalage de spin. Le filtrat contenant le conjugué GST-Tz est stocké à 4 ° C avant utilisation.
- NP-TCO préparation:
- Ajouter 100 ul de solution TCO-NHS (50 mM dans du DMSO) à150 pi de nanoparticules aminé (NP-NH 2, 8,7 mg Fe / ml dans du PBS, 3 nm noyau de fer ~ 8000 Fe / NP) et serrent mélange à la température ambiante pendant 1 heure.
- Enlever l'excès de réactif par filtration sur gel en utilisant une colonne NAP-10 éluée avec du tampon PBS. Recueillir la bande de couleur contenant le produit NP-TCO.
- On concentre le filtrat jusqu'à un volume final de ~ 150 ul en utilisant un dispositif de filtration centrifuge (100 k MWCO).
- Ajouter 50 ul d'anhydride succinique, (0,1 M dans du DMSO) à la solution NP-TCO et agiter à température ambiante pendant 1 heure (anhydride réagit avec des amines restantes pour former des acides carboxyliques terminaux. Cela empêche les interactions non spécifiques avec la surface de dextran).
- Purifier le produit NP-TCO en utilisant une colonne NAP-10 en éluant avec PBS. Conserver la solution de NP-TCO à 4 ° C avant de l'utiliser.
2. Préparation de la surface
Toutes les analyses de résonance de plasmon de surface sont effectuées sur un instrument Biacore T100 (GE Healthcare) à25 ° C à l'aide d'une puce de capteur CM5 et du PBS-P en tant que courant de tampon, sauf indication contraire. Contrôle Biacore et logiciels d'évaluation fourni avec l'appareil sont utilisés pour la mise en place des expériences et l'analyse des données. Deux modes de fonctionnement, assistants de l'application et l'exécution manuelle seront utilisés pour la préparation de la surface et de surveillance sur la puce de capture-cyclo. Le mode méthode de constructeur sera utilisé pour la mise en place des expériences de liaison d'orientation inverse et pour mesurer les taux de réaction de cycloaddition. Les données sont double référence soustrait et analyses cinétiques sont réalisées en utilisant un modèle de liaison 01:01 Langmuir.
- Utilisez le modèle de l'assistant amine d'immobilisation et sélectionnez l'immobilisation sur des cellules de flux 1 (référence) et 2 (détection). Procédé modifier amine pour activer les groupes carboxyliques en surface par injection d'une solution 1:1 de 0,4 M EDC: 0,1 M NHS pour 480 secondes à un débit de 10 ul / min. Réglez l'injection d'éthanolamine pour étancher autres esters activés à 420 secondes de temps de contact auun débit de 10 ul / min.
- Nom de l'entrée de ligand, anti-TPS (18 pg / ml dans un tampon d'acétate, pH 5,0) et mis à injecter pour un temps de 420 secondes de contact à une vitesse de 10 pi / min.
- Placez les flacons de solution requis en réactif rack 2 en faisant coïncider les positions avec la liste de contenu. Enregistrer et commencer immobilisation.
Remarque: L'exécution de l'assistant d'immobilisation de cette manière entraîne des niveaux d'immobilisation anti-TPS de l'ordre de 14.000 à 17.000 ~ RU. - Modifier l'assistant d'immobilisation à n'introduire que ligand de TPS (20 pg / ml) solution pour 420 secondes à 5 l / min de débit sur cellule de référence 1.
3. Surveillance sur puce Capture-cycloaddition de molécules fonctionnalisés
- Suivi sur puce capture cycloaddition en temps réel (Figure 2).
- Placer GST-TCO (20 ug / ml), Tz-BnNH 2 (10 pM) et de régénération (glycine 10 mM, pH = 2,0) dans des flacons de solution de réactif rack 2. Sélectionnez l'hommeméthode run manuel, régler le débit à 5 l / min et le chemin de flux Flow cellule 2.
- Injecter la solution de TPS-TCO pour 420 sec.
- Injecter la solution de Tz-BnNH 2 pour 600 sec.
- Régénérer la surface avec deux injections de 30 sec de la solution de régénération.
- Ensemble de surveillance sur la puce de structures multi-composants en temps réel (figure 3):
- Placer GST-Tz (20 ug / ml), NP-TCO (100 pg Fe / ml), Tz-BnNH 2 (10 pM) et de régénération (glycine 10 mM, pH = 2.0) de la solution dans des flacons de réactif rack 2. Sélectionnez la méthode d'exécution manuel de l'instrument, régler le débit à 5 l / min et le trajet d'écoulement à débit cellulaire 2.
- Injecter une solution de TPS-Tz pendant 60 secondes.
- Injecter une solution de NP-TCO pour 60 sec.
- Injecter une solution de Tz-BnNH 2 pendant 60 secondes.
- Régénérer la surface avec deux injections de 30 sec de la solution de régénération.
4. MSUIVI Immobilisation densité et la détermination de Cycloaddition Tarifs
- Caractérisation des petites vitesses de réaction de cycloaddition molécules (figure 4).
- Sélectionnez nouvelle méthode d'entrée et de paramètres généraux. Dans le panneau étapes du dosage de créer une nouvelle étape et nommez-échantillon. Définir le but et Connectez paramètres de base d'échantillons.
- Dans le panneau Types de vélo Créer une nouvelle étape du cycle et insérer les commandes suivantes: capture, l'échantillon, Régénération 1 et régénération 2.
- Sélectionnez la commande de capture, le nom de ligand d'entrée (TPS-TCO, 20 pg / ml), le temps de contact de 120 secondes à 5 l / min et le chemin d'écoulement fixé à: Deuxième. Sélectionnez la commande de l'échantillon; entrée 180 temps de contact sec, 60 sec de temps de dissociation, débit 30 l / min et définit le chemin d'écoulement à: Les deux. Sélectionnez la commande de régénération 1; entrée régénération nom de la solution (10 mM de glycine-HCl pH 2,0), le temps de contact de 30 secondes à 30 pi / min et définit le chemin d'écoulement à: Deuxième. Répétez la même chose pour la régénération 2 commande. </ Li>
- Run Setup Sélectionnez et réglez voie d'écoulement à: 2-1. Sélectionnez prochaine et remplir la liste de l'échantillon avec une solution d'analyte (Tz-BnNH 2) et la série de concentration (0,3-10 uM, dilution 1:2). Sélectionnez prochaine pour accumuler panneau de position. Lieu flacons de solution dans réactif rack 2 et série de dilution en plaque de 96 puits en faisant coïncider les positions avec la liste de contenu. Enregistrer modèle de méthode et commencer essai de liaison. La liaison de données et l'analyse cinétique sont présentés dans la figure 4.
- Caractérisation des NP vitesses de réaction de cycloaddition (figure 4).
- Ouvrez le modèle de méthode enregistrée par le haut et modifier les paramètres suivants. Sélectionnez le panneau Acquisition, changement de nom ligand à la TPS-Tz, 20 pg / ml. Sélectionnez le panneau de l'échantillon; changement temps de contact à 120 secondes de temps de contact et le temps de dissociation à 120 sec.
- Sélectionnez la liste de l'échantillon; changer analyte à NP-TCO et série de concentration (7-224 nM, dilution 1:2). Flacons place de solutions dans l'armoire réactif2 et de la série de dilution en plaque de 96 puits en faisant coïncider les positions avec la liste de contenu. Enregistrer modèle de méthode et commencer essai de liaison. La liaison de données et l'analyse cinétique sont présentés dans la figure 4.
5. Mesure de la liaison de FKBP12 à AP1497 immobilisée
Des études de liaison inverse emploient orientation-FKBP12 comme l'analyte et le composé AP1497 comme ligand immobilisé (Figure 5). La méthode générale de ce test est mis en place comme suit en utilisant l'outil de méthode constructeur:
- Sélectionnez nouvelle méthode d'entrée et de paramètres généraux. Dans le panneau étapes de l'analyse et de créer le nom de capture, d'exemples et de régénération étapes. Sélectionnez Objet correspondant et Connectez paramètres de base.
- Sélectionnez les types de cycle panneau et créer 3 étapes du cycle: Capture, exemples et de régénération.
- Insérez la commande de capture à deux reprises à l'étape du cycle de capture. Sélectionnez Capture 1 panneau et sélectionnez solution de capture comme variable, définir le temps de contact de 300 secondes à un débit de 5 l / min et le chemin d'écoulement fixé à: Deuxième. Sélectionnez le panneau Capture 2 et sélectionnez solution de capture comme variable régler le temps de contact de 250 s à une vitesse de 5 pi / min et le chemin d'écoulement régler le débit à: Deuxième.
- Insérez la commande de l'échantillon sous l'étape du cycle échantillon. Sélectionnez le panneau de l'échantillon; ensemble un temps de contact de 60 secondes, le temps de dissociation à 200 secondes à un débit de 30 l / min et définit le chemin d'écoulement à: Les deux.
- Insérer la commande de régénération en vertu de deux fois l'étape de cycle de régénération. Sélectionnez le panneau de régénération 1; entrée régénération nom de la solution (10 mM de glycine-HCl pH 2,0), le temps de contact de 30 secondes à 30 pi / min et définit le chemin d'écoulement à: Deuxième. Répétez la même chose pour le panneau de régénération 2.
- Run Setup Sélectionnez et réglez voie d'écoulement à: 2-1. Sélectionnez prochaines entrée et noms de solution de capture (TPS-TCO et AP1497-Tz), le nom de l'échantillon (FKBP12), série de concentrations (0,020 à 5 ug / ml, dilution 1:2) et MW (13 000). Lieu flacons de solution dans reagent rack 2 et série de dilution en plaque de 96 puits en faisant coïncider les positions avec la liste de contenu. Enregistrer modèle de méthode et commencer essai de liaison. Les données d'analyse cinétique sont présentés dans la figure 5.
6. Mesure de la liaison de FKBP12 à AP1497 Attaché à immobilisée IP
La méthode générale de nanoparticules immobilisation, petite dérivation de molécule et essai de liaison FKBP12 est mis en place comme suit en utilisant l'outil de méthode constructeur:
- Ouvrez le modèle de méthode enregistrée par le haut et modifier. Insérez une commande de capture supplémentaires à l'étape du cycle de capture. Sélectionnez le 1 panneau de capture; désélectionner solution de capture comme variable et nom solution de capture 1 (TPS-Tz). Set temps de contact de 60 secondes à un débit de 5 l / min et définit le chemin d'écoulement à la deuxième. Sélectionnez le panneau Capture 2; désélectionner solution de capture comme variable et nom solution de capture 2 (NP-TCO). Régler le temps de contact de 90 secondes à une vitesse de 5 pi / min et débitchemin d'écoulement fixé à la seconde. Sélectionnez le 3 panneau Acquisition; désélectionner solution de capture comme variable et nom solution de capture 3 (AP1497-Tz). Régler le temps de contact de 180 secondes à un débit de 5 l / min et définit le chemin d'écoulement à la deuxième.
- Run Setup Sélectionnez et réglez voie d'écoulement à: 2-1. Sélectionnez deux fois la prochaine. Lieu flacons de solution dans réactif rack 2 et série de dilution en plaque de 96 puits en faisant coïncider les positions avec la liste de contenu. Enregistrer modèle de méthode et commencer essai de liaison. Les données d'analyse cinétique sont présentés dans la figure 5.
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Representative Results
Les données et les chiffres ont été adaptés de la référence 8.
Immobilisation réversible efficace de petites molécules bioactives avec un contrôle sur l'orientation et la densité joue un rôle clé dans le développement de nouvelles applications de biocapteurs. En utilisant la réaction bioorthogonal rapide entre TCO et Tz, nous décrivons une méthode pour l'ensemble de paliers et la régénération des surfaces de ligands avec maintien de l'activité biologique. Figure 2 montre le suivi en temps réel de Tz-BnNH 2 immobilisation. Une solution de TPS-TCO est injecté sur une surface anti-GST pré-immobilisé résultant en ~ 400 RU hausse en réponse. Une deuxième injection avec Tz-BnNH 2 montre un rapide ~ 15 RU hausse en réponse. Pas de dissociation de l'antigène dérivé est observée après la mise à exécution tampon fournir la preuve de la stabilité de la structure. La surface est régénérée dans la dernière étape du cycle pour permettre à de multiples cycles de capture-cycloaddition. Nousment de cette procédure et en remplaçant le fragment Tz-BnNH 2 avec la molécule AP1497-Tz génère une surface bioactive utilisée pour les études d'interaction avec sa cible FKBP12 (figure 5). La perturbation de l'interaction anticorps / antigène (voir la figure 2) régénère la surface anti-GST, ce qui permet un nouvel assemblage moléculaire à construire. Dans ce cas, une injection GST-Tz (capture de ~ 800 RU) est suivie par une injection de NP-TCO (cycloaddition ~ 600 RU), immobiliser efficacement la nanoparticule à la surface du capteur (figure 3). Groupes n'ayant pas réagi TCO sur la NP sont disponibles pour cycloaddition avec injecté Tz-BnNH 2 (~ 22 RU). Sinon, AP1497-Tz est utilisé pour surveiller fonctionnalisés interactions nanoparticules FKBP12 (figure 5). Pas de dissociation des structures multi-composants (GST-Tz/NP-TCO/Tz-BnNH 2) sont observés fournir la preuve de la stabilité de la structure et l'activité biologique (AP1497-Tz/FKBP12 brouver).
Avec des capacités pour l'immobilisation en temps réel (cyclo) le suivi de la réaction et la régénération de la surface, la caractérisation directe de la vitesse d'association k a (taux de cycloaddition) est réalisé comme représenté sur la figure 4. Connaissance de la cinétique de réaction fournit des lignes directrices pour le contrôle de la densité d'immobilisation (temps de contact et la concentration), un paramètre important pour les essais de biocapteurs. L'injection de l'augmentation des concentrations de Tz-BnNH 2 ou NP-TCO en double sur des surfaces TPS-TCO ou TPS-TZ, respectivement, génère les données de liaison (lignes rouges). Les données de liaison pour deux échantillons d'analyte séquentielles de la même concentration sur la même surface sont presque superposables reflètent une perte minimale d'anticorps capacité de liaison en raison de multiples cycles de capture-cycloaddition et de régénération. Le logiciel d'évaluation fournit les analyses cinétiques meilleur ajustement (lignes noires ) de la cles vitesses de réaction de ycloaddition k une montre la figure 4.
Figure 1. Stratégie de conjugaison bioorthogonal pour l'immobilisation réversible de molécules dérivées. A. [4 +2] de réaction de cycloaddition entre trans-cyclooctène (TCO) et le 1,2,4,5-tétrazine (TZ) pour donner des fractions du produit d'addition 1,4-dihydropyridazine . B. schéma expérimental pour l'immobilisation réversible de Tz / TCO marqué molécules. C. schéma expérimental pour réversibles immobilisation de nanoparticules et fonctionnalisation. Cliquez ici pour agrandir la figure .
Figure 2. . Surveillance réel de temps de petit immobilisation de molécule 1) Base de référence:. Pré-immobilisé anti-GST 2) Prise de injecté TPS-TCO par l'anticorps anti-GST (t = 0 à 420 sec), suivie d'une injection de tampon de migration (t . = 420-540 s) montrant la persistance de l'interaction 3) Cycloaddition entre capturé TPS-TCO et tétrazine (Tz-BnNH 2; ~ 15 RU hausse en réponse t = 540-1,140 sec). Aucun signal désintégration se produit en dépit de la commutation de la phase mobile de tampon (t = 1,140-1,820 sec) en cours d'exécution. 4) La régénération de la surface anti-GST avec deux injections à découvert de la glycine 10 mM, pH 2,1 (t = 1,820-2,000 sec).
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Figure 3. Surveillance en temps réel des nanoparticules immobilisation et la fonctionnalisation. 1) de base. 2) Prise de injecté TPS-Tz (t = 0-60 secondes). 3) Cycloaddition entre capturé TPS-Tz et injecté NP-TCO (t = 135-195 sec), suivie d'une injection de tampon de migration sans l'affaiblissement de signal (t = 195 à 300 sec). 4) cycloaddition entre immobilisé NP-TCO et injecté Tz-2 BnNH (~ 22 RU lieu en réponse, t = 300-360 sec). Il n'ya pas de décroissance du signal de commutation malgré la phase mobile à tampon (t = 360-480 sec) en cours d'exécution fournissant des preuves de stabilité multi-composant.
Figure 4. Sensorgrammes représentatives montrant brouver données (lignes rouges) et des analyses cinétiques (lignes noires) pour la réaction de cycloaddition entre Tz et TCO marqués molécules en présence ou en l'absence de 100% de FBS. tableau résume constantes association (cyclo) de taux, k un.
Figure 5. Études SPR de petites interactions molécule / protéine dans diverses configurations (Top) Les dérivés synthétiques de FK506: AP1497. Et AP1497-Tz. Le tableau montre cinétique et les constantes de vitesse d'équilibre provenant de la liaison de données. Données issues des expériences de liaison où la protéine est immobilisée (ie expériences SPR traditionnels) sont inclus pour comparaison.
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Discussion
La méthode de capture-cyclo décrit ici permet rapide, immobilisation réversible de nanoparticules modifiées et de petites molécules pour à puce interaction sans étiquette et des études cinétiques. Le protocole d'immobilisation peut être réalisée en quelques minutes nécessitant <10 uM concentrations de ligands de petites molécules. En modulant la concentration de ligand et les densités d'immobilisation de temps de contact peut être étroitement contrôlée. Nos données montrent que les réactions bioorthogonal sur puce conservent la capacité in situ de nanoparticules fonctionnalisées ou de petites molécules immobilisées d'interagir avec leurs cibles. Nous avons également caractérisé par des taux de cycloaddition bimoléculaire entre deux petites molécules, et Tz (TCO) de bas poids moléculaires. Nous prévoyons que des tests similaires peuvent être effectuées pour mesurer et comparer les taux d'autres réactions bioorthogonal rapides.
Réversible, flux continu immobilisation sur puce nanoparticules et in situ fonctionnalisation provides un accès rapide à une variété de nanoparticules modifiées pour le criblage et l'analyse des interactions possibles, tous dans la même expérience. 13-15 Par rapport à la synthèse de nanoparticules classique, qui nécessite différentes étapes de purification, l'immobilisation et le dépistage, notre procédé permet de réduire considérablement la quantité d'entrée de biomatériaux, les solvants et les réactifs, tout en diminuant simultanément les préoccupations environnementales relatives à l'utilisation de nanoparticules et d'élimination. 16 Fait important, les réactions de fonctionnalisation sont des nanoparticules solides à la présence de concentrations sériques typiquement utilisés pour des expériences de culture de cellules, et même à des concentrations extrêmement élevées de sérum. Cette fonctionnalité peut faciliter relations structure-activité pour la conception de nanoparticules en présence de sérum (qui peut affecter les propriétés de la couronne de la protéine et de la surface de la nanoparticule). 17,18
Dans la plupart des analyses SPR, où les interactions de molécules protéiques à petites sont étudiés, la protéine (ligand) estimmobilisé au moyen d'un marqueur d'affinité (GST, la biotine, etc) ou par l'intermédiaire des liaisons amide covalentes. L'analyte est ensuite passé sur le ligand, où liaison entraîne des variations de masse de surface, qui sont détectés en tant que des changements d'indice de réfraction. L'inversion de l'orientation SPR canonique et immobiliser la petite molécule d'une manière commode et réversible permet un accès facile à la liaison directe d'étudier les cibles macromoléculaires solubles et clarifie spécifique de phase (solubles) immobilisée par rapport à des artefacts. 19,20 formats analytiques de ce type sont en particulier utile pour les études d'inhibition et de la concurrence. 21 Reprise de l'orientation peut aussi être avantageux dans plusieurs circonstances, à savoir a) avec des analytes de faible poids moléculaire, considérant que le signal de liaison est proportionnelle à la surface variation de la masse b) l'agrégation et la non-spécificité des analytes hydrophobes 22 est éliminé faire l'analyse des données c simple) caractérisation des liants de haute affinité peutêtre difficile en raison de longs temps de séjour (ralentir hors-prix, surtout lorsqu'il s'agit d'inhibiteurs covalents) 23 et la nécessité de conditions de régénération de surface en cours de préparation pour le cycle d'analyse prochaine d) des agents de régénération peuvent avoir des effets dégradants sur la structure ou la fonction du protéine immobilisée.
En intégrant la méthode de capture-cyclo bioorthogonal dans le cadre de notre stratégie d'immobilisation, nous contournons certaines des difficultés associées aux techniques d'immobilisation de petite molécule classiques. Ceux-ci exigent des concentrations de ligands beaucoup plus élevés depuis attractions électrostatiques menant à la surface pré-concentrations typiques des protocoles protéine d'immobilisation sont inefficaces avec de petites molécules. Par conséquent, l'augmentation des concentrations de ligands conduit à augmenter les rapports de co-solvant organique de ligand dissolution. Ces deux conditions ne sont pas compatibles avec les systèmes de flux de micro-fluidiques et, en conséquence, i conventionnelmmobilizations doivent être effectuées en dehors de l'instrument où la surveillance en temps réel n'est pas possible. 24 Enfin, dans le cas d'une immobilisation conventionnelle succès, modification de surface covalente empêche la régénération de la surface et limite le domaine expérimental de surfaces de biocapteurs résultant en une augmentation des investissements dans le temps, l'effort et les coûts.
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Disclosures
Les auteurs déclarent qu'ils n'ont aucun intérêt financier concurrents.
Acknowledgments
Nous reconnaissons le financement du NIH (NHLBI contrat n ° HHSN268201000044C à RW, SH et SYS).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent | |||
| Sensor Chip CM5 | GE Healthcare | BR-1005-30 | |
| Amine coupling kit | GE Healthcare | BR-1000-50 | |
| GST capture kit | GE Healthcare | BR-1002-23 | |
| NAP-10 Columns | GE Healthcare | 17-0854-01 | |
| GST, lyophilized in 1X PBS | Genscript | Z02039 | 1 mg/ml |
| rhFKBP12 | R&D Systems | 3777-FK | |
| Surfactant P-20 | GE Healthcare | BR-1000-54 | |
| Glycine 2.0 | GE Healthcare | BR-1003-55 | |
| Zeba spin desalting column | Thermo | 89882 | 7 K MWCO |
| Amicon Ultra 4 | Fisher | UFC810096 | 100 K centrifugal filter |
| TCO-OH | Ref. 8 | Synthesized in-house | |
| TCO-NHS | Ref. 8 | Synthesized in-house, *Commercially available from Click Chemistry Tools # 1016-25 | |
| Tz-BnNH2 | Ref. 8 | Synthesized in-house | |
| Tz-NHS | Ref. 8 | 764701 | Synthesized in-house, *Commercially available from Sigma Aldrich # 764701 |
| NP-NH2 = CLIO-NH2 | Ref. 8 | Synthesized in-house | |
| AP1497, AP1497-Tz | Ref. 8 | Synthesized in-house | |
| Equipment | |||
| SPR Biosensor | GE Healthcare | Biacore T100 | |
References
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