Summary
Att mäta biomarkörer i komplexa biologiska prover alltmer vägledande kliniskt beslutsfattande. Vi beskriver en mycket känslig metod för att samtidigt mäta hjärtmyosin bindande protein-C, kreatin MB kinas, och cardiac troponin I i serumprover från patienter med hjärtinfarkt och friska kontrollpersoner.
Abstract
Biomarkörer blir allt viktigare i kliniskt beslutsfattande, samt grundläggande vetenskap. Diagnos hjärtinfarkt (MI) är till stor del driven av att upptäcka hjärt-specifika proteiner i patientens serum eller plasma som en indikator på myocardial skada. Efter att nyligen visat att hjärtmyosin bindande protein-C (cMyBP-C) kan detekteras i serum efter MI, har vi föreslagit det som en potentiell biomarkör för MI. Biomarkörer vanligtvis upptäcks av traditionella sandwich enzymkopplade immunosorbentanalyser. Emellertid kräver denna teknik en stor provvolym, har ett litet dynamiskt intervall, och kan mäta endast ett protein i taget.
Här visar vi en multiplex immunanalys där tre hjärt proteiner kan mätas samtidigt med hög känslighet. Mätning cMyBP-C i Uniplex eller tillsammans med kreatinkinasvärden MB och cardiac troponin I visade jämförbar känslighet. Denna teknik använder Meso Scale Discovery(MSD) metod för multiplexering i en 96-brunnars platta i kombination med elektrokemiluminiscens för detektion. Medan endast små prowolymer krävs, är hög känslighet och ett stort dynamiskt område uppnåtts. Med hjälp av denna teknik, mätte vi cMyBP-C, kreatin MB kinas, och cardiac troponin I-nivåer i serum prover från 16 patienter med hjärtinfarkt och jämförde resultaten med 16 kontrollpersoner. Vi skulle kunna detektera alla tre markörer i dessa prover och hittade alla tre biomarkörer för att höjas efter MI. Denna teknik är därför lämplig för känslig detektion av hjärt biomarkers i serumprover.
Introduction
Mätningen av små mängder protein i komplexa biologiska prover, såsom serum, är av allt större klinisk betydelse för behandling av patienten, samt grundläggande vetenskap. Till exempel är en ökning av serumnivåerna av hjärt biomarkörer, såsom troponin I, i en klinisk miljö överensstämmer med akut hjärtinfarkt (MI) 1. För att detektera proteiner i serumprover, är standard enzymkopplad immunabsorberande analys (ELISA) den mest använda tekniken eftersom det har hög känslighet och medger absolut kvantifiering av analyten. Emellertid traditionella ELISA kräver en relativt stor mängd av provet (normalt 100 | il), har hög bakgrundssignal i vissa biologiska vätskor, och är begränsade till mätning av endast en analyt per ELISA 2.
Nyligen har ett nytt immunoanalysteknik införs som kringgår många av dessa nackdelar. Denna modifierade analys, utvecklad av MSD, använder electrochemilumineschet (ECL) för signaldetektering, vilket möjliggör en mycket låg bakgrund och en ökad känslighet, vilket möjliggör användningen av små provvolymer. Elektrokemiluminiscens baseras på reportermolekylen rutenium (II) trisbipyridal, som är knuten till de detektionsantikroppar. Denna reportermolekyl emitterar ljus vid 620 nm på elektrisk stimulering av botten av 96-brunnars platta som har kolelektroder integrerade i dem tre. Också genom att använda fläck beläggning, kan multipla infångande antikroppar beläggas i en brunn (upp till 10 på en 96-brunnars platta), vilket möjliggör samtidig kvantifiering av olika proteiner i ett enda prov 4. Denna teknik har nyligen använts för att mäta proinflammatoriska cytokinprofiler i serum 5,6. Multiplex plattor från MSD bra i jämförelse med andra multiplex assay plattformar 7.
Använda MSD som den primära analysen plattform vi utvecklat ytterligare en skräddarsydd 3-plex platta som cen kvantifiera samtidigt nivån av hjärtmyosin bindande protein-C (cMyBP-C), kreatin-kinas MB (CK-MB), och hjärt-troponin I (cTnI), och resultaten jämfördes med monoplex detektion av cMyBP-C. CK-MB och cTnI är väletablerade biomarkörer för MI. Däremot kan höjningar av dessa biomarkörer kan orsakas av sjukdomar andra än MI, t.ex. myokardit eller njursvikt 8. Detta talar för tillsättning av ytterligare biomarkörer för att öka specificiteten av MI diagnos. Vi har nyligen visat att cMyBP-C är också en potentiell biomarkör för MI 9. cMyBP-C är en tjock glödtråd associerat protein som uttrycks i hjärtat, 10-12, men inte i skelettet eller musklerna. Således är ökad nivå av cMyBP-C i cirkulationssystemet en specifik indikator på hjärtskada 13.
I denna studie jämförde vi Uniplex detektion av cMyBP-C med användning av ett anpassat 3-Plex analys för att mäta serumnivåer avcMyBP-C-, CK-MB, och cTnI i serum hos patienter med hjärtinfarkt. I framtiden kan denna signatur teknik användas för att diagnostisera MI hos patienter med bröstsmärta på akuten.
Den institution Review Board (IRB) av Loyola University Chicago godkänt studien för användning av deidentified humana prover och användningen av immunanalysen (LU # 20392).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Ett. Uniplex cMyBP-C-analys
- Dagen före försöket, belägga 96-väl MSD kala standard platta med infångningsantikropp. För cMyBP-C bör ett 30 il volym av mus monoklonal anti-cMyBP-C-antikropp (gelatin kostnadsfritt) vid en koncentration av 5 pg / ml utspädd i fosfatbuffrad saltlösning (PBS).
- Eftersom brunnen är hydrofob, pipettera lösningen i nedre hörnet av brunnen, sedan på sidorna av plattan för att sprida lösningen över hela brunnen.
- Plattan täcks med en plattförseglare och inkuberades O / N vid 4 ° C utan skakning.
- Avlägsna lösningen infångningsantikroppen genom att knacka på lösningen ut över ett handfat och sedan på en bunt pappershanddukar. Icke-specifik bindning till plattan blockeras genom tillsats av 150 pl av en 5% (vikt / volym) blockerare A (högvärdig BSA)-lösning i PBS till varje brunn.
- Försegla plattan och inkubera i 1 timme vid RT under skakning vid 700 rpm.
- Under den blockerande steget, förbereda standarder och sempel. Gör standardserien genom att späda rekombinant cMyBP-C-protein-fragment (aminosyrorna 1 till 271) till en startkoncentration av 2000 ng / ml i 1% (vikt / volym) blockerare A / PBS. Sedan seriellt späda med en faktor 5 i 1% (vikt / volym) blockerare A / PBS. Totalt 7 standarder + en blank (1% (vikt / volym) blockerare A / PBS enbart) användes.
- Avlägsna den blockerande lösningen och tvätta plattan 3 x med 150 | il 0,05% (volym / volym) Tween-20/PBS. Varje gång, ta bort tvättlösning genom att vända plattan ovanför en diskbänk. Efter den tredje tvätten steget, kraftfullt knäpp plattan över ett handfat och klappa plattan kraftigt på ett lager av hushållspapper tills den är helt torr. Detta är ett viktigt steg, eftersom inkubation volymerna är små, och eventuellt återstående tvättlösning kommer avsevärt späda nästa inkubation.
- Pipettera 25 pl standarder och prover i brunnarna. Försegla plattan och inkubera vid RT, under skakning vid 700 rpm under 1 timme.
- Bered lösningen detektionsantikropp vid 1 | ig / ml i 1% blockerare A / PBS. En custom gjorde cMyBP-C-antikropp (epitop aminosyrorna 2-14) med MSD-sulfo-TAG märkningen fungerar som detektionsantikropp. Reservdelar finns för Sulfo-TAG märkning, vilket gör det till en relativt enkel procedur att märka någon antikropp.
- Upprepa tvättsteg såsom beskrivs i steg 1.4.
- Tillsätt 25 pl av detektionsantikroppen lösning till varje brunn, försegla plattan och inkubera vid rumstemperatur under 1 timme på en plattskak inställd på 700 rpm.
- Under inkubationstiden, kör MSD: s demo-plattan (platta med LED-lampor) för att säkerställa korrekt funktion hos Sector Imager och mjukvara (se reagens avsnitt). Också, späd read-buffert, som tillhandahålls av MSD, genom tillsats av 5 ml 4x läs-buffert till 15 ml destillerat vatten.
- Upprepa tvättsteg såsom beskrivs i steg 1.4.
- Tillsätt 150 pl av läs-buffert i varje brunn med hjälp av en flerkanalspipett. Var noga med att undvika luftbubblor (omvänd pipettering är en lämplig metod). Efter tillsats av läs-buffert, omedelbart söka igenom plattan i områdesgruppenImager.
2. 3-plex cMyBP-C, CK-MB, och cTnI analys
- A 96-brunnars 3-Plex plattan och utspädningsmedel lösningar uppnå jämvikt till RT före användning. Denna platta är pre-belagd med infångningsantikroppar för cMyBP-C, CK-MB och cTnI av MSD.
- Tillsätt 25 pl av 1% (vikt / volym) blockerare A / PBS i varje brunn. Tryck på sidorna av plattan för att säkerställa att hela väl täcks av lösningen.
- Täta plattan med en plattförslutning, placera plattan på en tallrik shaker och skaka vid 700 rpm i 30 min.
- Under tiden är en utspädning serie individuella kalibratorer förberedd. Eftersom varje brunn har tre infångningsantikroppar tre kalibratorer måste blandas och seriespäddes före användning. Späd rekombinant cMyBP-C-, CK-MB (MSD), och cTnI (MSD) tillsammans i 1% (vikt / volym) blockerare A / PBS för att skapa ett prov med 2000 ng / ml cMyBP-C, 100 ng / ml CK- MB, och 25 ng / ml cTnI (prov A).
- En slutlig volym på minst 100 | il bereds för varje standard. Tillslutföra standardserien, seriellt späda proven är med en faktor av 5. Använd 25 pl av prov A i 100 | il 1% (vikt / volym) blockerare A / PBS för att skapa prov B. Använd sedan 25 pl av prov B i 100 | il 1% (vikt / volym) blockerare A / PBS för att skapa prov C , och så vidare. Mänskliga serumprover från 16 patienter med MI och 16 kontrollpersoner användes för att mäta cMyBP-C-, CK-MB, och cTnI nivåer. Dessa prover späddes 2x i 1% (vikt / volym) blockerare A / PBS.
- Tillsätt 25 mikroliter av standarder och spädda till 25 pl redan finns i brunnarna i 3-plex plattan. Det är viktigt att även inkludera en tom (utspädningsmedel enbart). Att etablera tekniken, prover laddas i tekniska tre exemplar. Annars dubbletter är tillräckliga.
- Försegla plattan igen (plattförseglare kan återanvändas) och inkubera på en plattskakare (700 rpm) vid RT under 2 timmar.
- Strax innan inkubationen är färdig, är detektionsantikroppen lösning framställd. Utspädningsmedlet som används är 1% (vikt / volym) blockerare A i PBS. Alla three Sulfo-taggade detektionsantikroppar späds tillsammans till en slutlig koncentration av 1 | ig / ml vardera. Detection antikroppar tillhandahålles typiskt vid en 50x förrådskoncentration.
- För en fullständig 96-brunnar, är 2700 il total utspädd lösning behövs (med pipettering fel ingår). Lägg 54 | il av varje detektionsantikropp med 2538 | il 1% (vikt / volym) blockerare A / PBS.
- Efter 2 timmar, ta bort lösningar genom kraftig snärta plåten ovanför ett handfat. Tvätta brunnarna 3x med 150 pl av 0,05% Tween-20 i PBS. Tillsätt 25 pl av detektionsantikroppen lösning till varje brunn med en multikanalpipett, och sidorna av plattan är gängade för att säkerställa att hela väl täcks av lösningen.
- Försegla plattan och inkubera i 1 h under skakning vid 700 rpm.
- Under inkubationstiden, kör MSD: s demo-plattan (platta med LED-lampor) för att säkerställa korrekt funktion hos Sector Imager och mjukvara. Också späda read-buffert, som tillhandahålls av MSD, genom tillsats av 5 ml 4x läs-buffert till 15 ml destillerat vatten.
- Upprepa tvättningen beskrivs i steg 2.8.
- Tillsätt 150 ul läs-buffert till varje brunn med en flerkanalig pipett. Undvika luftbubblor är kritisk (omvänd pipettering är en lämplig metod). Efter tillsats av läs-buffert, omedelbart söka igenom plattan i Sector Imager.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De grundläggande principerna och arbetsflödet av 3-Plex analys visas i Figur 1, och den totala arbetsflödet beskrivs i tabell 1. Uniplex analyser fungerar efter samma princip, förutom att hela botten väl är belagd med en infångningsantikropp. Signal detektering görs genom ECL, i vilken en elektrisk signal appliceras på botten av brunnen. Detta i sin tur, initierar en lokal produktion av ljus genom en kemisk reaktion av läs-buffert med Sulfo-TAG etikett på detektionsantikropp. Detta leder till den låg bakgrund och hög känslighet hos analysen. I figur 2, är standardkurvan av cMyBP-C i Uniplex-analysen jämfört med den för cMyBP-C i 3-plex assay. Båda analyserna visar en mycket hög känslighet och ett stort dynamiskt omfång. Detection nivåer och nivåer kvantifiering visas i tabell 2 och är jämförbara i både Uniplex och tre komplexa analyser. Bevakningsnivåer för cTnI och CK-MB är ALSo som visas i figur 3 och tabell 2. Inter-operatör variabilitet bestämdes genom att mäta identiska prover (n = 2, replikat 3 tekniska) av två olika operatörer och variabilitet befanns vara låg (CV 8,5%). Korsreaktivitet av detektionsantikroppar med de två andra kalibratorer studerades genom att inkubera individuella standardkurvor av alla tre kalibratorer med enstaka detektionsantikroppar (Figur 4). Endast låga mängden korsreaktivitet sågs mellan CK-MB kalibrator och både cTnI och cMyBP-C-antikroppar upptäckt medan ingen korsreaktivitet observerades mellan de övriga kalibratorer och antikroppar upptäckt.
Som bevis på användbarheten av analys för detektion av hjärt-skada, var serumnivåer av 16 försökspersoner med MI jämfört med en kontrollgrupp (n = 16). Använda 3-Plex platta, var serumnivåer av cMyBP-C-, CK-MB, och cTnI bestämdes. Samtliga tre biomarkörer höjdes i MI försökspersoner (seFigur 5) från 3,7-faldigt (cMyBP-C) till 12,2-faldigt (CK-MB), även om variationer i serumnivåer var den lägsta i cMyBP-C-gruppen.
| Process | Uniplex assay | 3-plex-analys | |
| Experiment dag 0 | Coat tallrik med infangningsantikropp | Över natten | N / A |
| Experiment dag 1 | Blockera plattan | 1 hr | 30 min |
| Förbered prover och standard serier | |||
| Inkubera med prover och standarder | 1 hr | 2 tim | |
| Inkubera med detektionsantikropp | 1 hr | 1 hr | |
| Lägg detektionsreagens och läsatallrik |
Tabell 1. Workflow översikt över Uniplex och analyser multiplex.
| LLOD (ng / ml) | LLOQ (ng / ml) | ULOQ (ng / ml) | |
| cMyBP-C (Uniplex) | 0,126 ± 0,007 | 0,567 ± 0,073 | 400 ng / ml |
| cMyBP-C (3plex) | 0,057 ± 0,022 | 0,469 ± 0.171 | 400 ng / ml |
| CK-MB (3-plex) | 0,038 ± 0,014 | 0,587 ± 0.213 | 100 ng / ml |
| cTnI (3plex) | 0,033 ± 0,011 | 0,147 ± 0,053 | 25 ng / ml |
Tabell 2. Detektionsgränser Uniplex och 3-plex kalibratorer. LLOD, lägre detektionsgränsen, definieras som beräknad koncentration av signalen av ämnet + 3 gånger standardavvikelsen för blankprov. LLOQ, kvantifierbara nivån, definieras som ett värde högre än LLOD, med en variationskoefficient (reciproka värdet av signal-brus-förhållande) lägre än 20%, och en återhämtning 80 - 120%. ULOQ, övre gränsen för kvantifiering, definieras som den analyserade högsta koncentration som kan mätas med en variationskoefficient mindre än 20% och en återhämtning 80 - 120%.
Figur 1. Schematisk översikt av plåt och arbetsflöde. A) 96 brunnar visas. Varje brunn är belagd med tre olika infångande antikroppar, dvs mot cMyBP-C-, CK-MB och cTnI. Den fjärde nyttakunna plats används inte och är belagd med BSA. B) arbetsflöde av 3-plex ELISA. Den pre-belagda plattan (steg 1) är blockerad och sedan serumprover eller kalibratorer tillsätts till varje brunn och fick binda (steg 2). cMyBP-C (röda diamanter), CK-MB (grön rektangel), och cTnI (orange oval) binder till sina respektive infångningsantikroppar. Efter borttvättning av obundna proteiner, är Sulfo-TAG-märkta detektionsantikroppar tillsattes (steg 3). De kommer att binda till cMyBP-C-, CK-MB, eller cTnI proteiner som är bundna till sina infångningsantikropp. Efter tvättning bort antikroppar obundet upptäckt, läses buffert tillsattes och plattan analyseras. En elektrisk signal till botten av plattan initierar en lokal kemisk reaktion av Sulfo-TAG med läsbufferten, vilket leder till produktion av ljus (steg 4). Mängden ljus är direkt proportionell mot mängden av Sulfo-TAG märkt bunden detektionsantikropp. Den CCD imager resladdar ljuset och kan urskilja de olika platser inom varje brunn och därför signalen som kommer från varje analyt (steg 5).
Figur 2. Standardkurva av cMyBP-C kalibrator mätt i Uniplex eller i 3-plex. Samma standard serie mättes i en Uniplex analys, och om 3-Plex plattan. Standarden serien började vid 2000 ng / ml och serieutspäddes 5x med den lägsta koncentrationen är 0,128 ng / ml. Dessutom utspädningsmedel användes som ett blindprov. Detekteringen område av analysen visas i grått. Den undre raden anger den nedre gränsen för detektion (LLOD), som definieras som den beräknade koncentrationen av den tomma signalen + 3 gånger standardavvikelsen av de tomma värden. Den övre gränsen för detektion definieras som than högsta koncentrationen av standardserien som kan mätas tillförlitligt. Både Uniplex och 3-plex cMyBP-C standardkurvor är jämförbara. Detektionsgränserna visas i tabell 2. au: godtyckliga enheter.
Figur 3. Standardkurvor av CK-MB och cTnI. Standardkurvor av CK-MB och cTnI, som mättes samtidigt med cMyBP-C på 3-Plex tallrik. Båda kalibratorer visar hög känslighet och ett stort dynamiskt omfång. I grå detekteringsområdet för analysen visas. Den undre raden anger den nedre gränsen för detektion (LLOD), som definieras som den beräknade koncentrationen av den tomma signalen + 3 gånger standardavvikelsen av de tomma värden. Den övre gränsen för detektion definieras som den högsta koncentrationen av standarden SE rier som kan mätas tillförlitligt. Detektionsgränserna visas i tabell 2. au: godtyckliga enheter.
Figur 4. Korsreaktivitet av 3-plex detektionsantikroppar. Separata standardkurvor av cMyBP-C-, CK-MB, och cTnI framställdes och inkuberades på den 3-Plex platta. Varje standardkurva var än sonderade med enskilda detektionsantikroppar, för att bedöma storleken på korsreaktivitet mellan enskilda detektionsantikroppar (t.ex. cMyBP-C) och de övriga kalibratorer (t.ex. CK-MB och cTnI). Korsreaktivitet var låg i 3-plex analysen. Klicka här för att visa en större bild .
Figur 5 "fo: innehåll-width =" 3in "fo: src =" / files/ftp_upload/50786/50786fig5highres.jpg "src =" / files/ftp_upload/50786/50786fig5.jpg "/>
Figur 5. Biomarkör nivåer i serum av MI och kontrollpersoner mätt med 3-plex analysen. Nivåer av cMyBP-C, CK-MB, och cTnI mättes samtidigt med 3-plex test på serumprov från 16 kontrollpersoner och 16 patienter med MI. Data visas av box-och morrhår tomter (whiskers representerar 10: e och 90: e percentilen). Ökade nivåer av samtliga tre biomarkörer sågs i serum hos patienter med MI jämfört med kontrollgruppen. Eftersom uppgifterna inte visar en normalfördelning (testad av D'Agostino Pearson Omnibus), var det icke-parametriska Mann-Whitney statistiskt test som används för att testa för skillnader mellan kontroll-och MI. # P <0,001
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I denna studie visar vi att tillämpa en multiplex immunologisk test för detektion av multipla hjärt biomarkörer i serum från patienter. Denna teknik har många fördelar jämfört med traditionell ELISA. Först ECL i analyskitet används i stället för kolorimetrisk detektion. I ECL, stimulerar en elektrisk signal den lokala produktionen av den uppmätta egenskapen (ljus), vilket frånkoppling av stimuleringen händelsen från signalen, vilket reducerar bakgrundsljud 14. Detta medger höga känslighet, såsom framgår av tabell 2.
Multiplexering analysen inte leder till en förlust av känslighet för detektion av cMyBP-C, såsom kan ses i figur 2 och tabell 2. cMyBP-C uppmätt i Uniplex visade en känslighet och detektion område jämförbart med cMyBP-C mätas samtidigt med CK-MB och cTnI 13. Samtidiga mätningar avsevärt minska den mängd prov som krävs för measurements, vilket kan vara en avgörande faktor när man arbetar med sällsynta biologiska prover, samt minska tiden kör flera Uniplex analyser.
Som med alla immunoanalys, är analysen starkt beroende av kvaliteten på de använda antikropparna. Den affinitet, specificitet och affinitet för avskiljning och upptäckt antikroppar är den viktigaste faktorn för sensitivitet 15. Olika antikroppspar bör prövas för att se vilken kombination av avskiljning och upptäckt antikroppar ger den högsta känslighet och dynamiskt omfång. Vid användning multiplexeringstekniker, de infångningsantikroppar måste vara spot-belagd på brunnen. Detta innebär att en låg volym, är mycket koncentrerad lösning fläckvis på en del av brunnen (se figur 1) i motsats till lösningsbeläggning används i Uniplex analysen eller vid konventionell ELISA. Det bör bedömas om infångningsantikroppen fungerar lika bra med plats beläggning som det gör med lösningsbeläggning. Korsreaktivitet avantikroppar eller kalibratorer med en annan antikropp par kan också ge upphov till falskt positiva resultat 2,15.
För denna studie har en skräddarsydd multiplex platta utformad i samarbete med MSD. Även om en rad förbelagda multiplexa plattor är kommersiellt tillgängliga, denna innovation krävs optimering av analysen eftersom en roman (cMyBP-C) Målet multiplexeras med tidigare optimerade Katalog analyser (CK-MB och cTnI). Som sådan, är en uppenbar nackdel med denna metod den ytterligare kravet på en specialiserad plattläsare och plattor innehållande elektroder för att detektera ECL signalen. Trots att köra en multiplex analys kontra flera Uniplex analyser kommer att minska de totala kostnaderna, måste en plattläsare initialt köpt 2.
Använda 3-Plex immunanalys nivåerna av biomarker frisättning av cMyBP-C-, CK-MB, och cTnI mättes hos försökspersoner med MI och jämfördes med en kontrollgrupp. Den faldig förändring av ökningen över the kontrollgruppen skilde mellan de tre biomarkörer (se figur 4), liksom variationen i MI-gruppen. Variation i biomarkör nivåer väntas i en samling av hjärtinfarktspatienter, som tidpunkten för blodprovstagning, infarktstorleken, liksom en mängd andra faktorer som sannolikt bidrar till utsläpp av hjärt-proteiner och dess efterföljande nedbrytning i cirkulationen. Om nivån på de enskilda biomarkörer korrelerar med kliniska parametrar såsom infarktstorlek, motiverar ytterligare studier.
Översätta dessa fynd direkt använda på akuten för att upptäcka MI kräver ett antal utmaningar som måste övervinnas. Prime bland dem är den tid protokollet tar att producera resultat, som även med pre-belagda plattor tar 3 ½ tim. Som med troponin analyser används idag, bör analysen vara optimerad för snabb detektion, vilket möjliggör snabb diagnos.
Sammanfattningsvis har vi utvecklat en signatur analys i vilken två vetn hjärt biomarkers och en potentiell hjärt biomarkörer, cMyBP-C, visades att samtidigt detektera närvaron av myokardiell skada hos patienter med MI genom kvantifiering av hjärt protein serumtitrar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
En fullständig patentansökan väntar (patentansökan nr 13/464 466, publikation nr US 2012 / 0.282.618 A1 och datum:. 05/04/12) att bestämma riskfaktorer cMyBP-C nedbrytning och utsläpp i människokroppen vätska och kvantifiera nivån av cMyBP-C i human kroppsvätska.
Acknowledgments
Denna studie har finansierats av National Institutes of Health bidrag R01HL105826 och K02HL114749 (Dr Sadayappan) och American Heart Association Midwest stipendier, 11PRE7240022 (Mr Barefield) och 13POST14720024 (Dr Govindan). Författarna erkänner tacksamt stöd av Dr Jimmy Page, Jill Clampit och Dr John Hudson, MSD, för deras utmärkta tekniska och litteratur stöd i att utveckla analysen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| MSD Read-Buffer T (4X) with surfactant | Meso Scale Discovery | R92TC-2 | |
| Tween-20 | Acros | 9005-64-5 | |
| MSD Blocker A | Meso Scale Discovery | R93BA-1 | |
| Phosphate buffered saline, 10X | Fisher BioReagents | BP399-4 | Filter before use |
| Myosin binding protein C antibody, mouse monoclonal (E7), gelatin free | Santa Cruz | SC-137180L | For coating, antibody has to be gelatin free |
| Plates and Equipment | |||
| Multi-Array 96-well standard plate | Meso Scale Discovery | L15XA-3 | |
| A prototype 3-plex, four-spot, 96-well plate with cMyBP-C, cTnI and CK-MB | Meso Scale Discovery | N452A-1 | |
| ThermaSeal Sealing Film | Life Science Products Inc. | ST-3098 | |
| MSD SECTOR Imager 2400A | Meso Scale Discovery | ||
| MTS 2/4 digital microtiter shaker | IKA | 3208001 | |
References
- Thygesen, K., et al. Third universal definition of myocardial infarction. Eur. Heart J. 33, 2551-2567 (2012).
- Leng, S. X., et al. ELISA and multiplex technologies for cytokine measurement in inflammation and aging research. J. Gerontol. A. Biol. Sci. Med. Sci. 63, 879-884 (2008).
- Thompson, I., et al. Competitive electrochemiluminescence wash and no-wash immunoassays for detection of serum antibodies to smooth Brucella strains. Clin. Vaccine Immunol. 16, 765-771 (2009).
- Kingsmore, S. F. Multiplexed protein measurement: technologies and applications of protein and antibody arrays. Nat. Rev. Drug. Discov. 5, 310-320 (2006).
- Altan, Z. M., et al. A long-acting tumor necrosis factor alpha-binding protein demonstrates activity in both in vitro and in vivo models of endometriosis. J. Pharmacol. Exp. Ther. 334, 460-466 (2010).
- Patel, K. D., et al. High sensitivity cytokine detection in acute coronary syndrome reveals up-regulation of interferon gamma and interleukin-10 post myocardial infarction. Clin. Immunol. 133, 251-256 (2009).
- Fu, Q., Zhu, J., Van Eyk, J. E. Comparison of multiplex immunoassay platforms. Clin. Chem. 56, 314-318 (2010).
- Mahajan, V. S., Jarolim, P. How to interpret elevated cardiac troponin levels. Circulation. 124, 2350-2354 (2011).
- Govindan, S., et al. Cardiac myosin binding protein-C is a potential diagnostic biomarker for myocardial infarction. J. Mol. Cell Cardiol. 52, 154-164 (2012).
- Barefield, D., Sadayappan, S. Phosphorylation and function of cardiac myosin binding protein-C in health and disease. J. Mol. Cell Cardiol. 48, 866-875 (2010).
- Kuster, D. W., et al. Cardiac myosin binding protein C phosphorylation in cardiac disease. J. Muscle Res. Cell Motil. 33, 43-52 (2012).
- Sadayappan, S., de Tombe, P. P. Cardiac myosin binding protein-C: redefining its structure and function. Biophys. Rev. 4, 93-106 (2012).
- Sadayappan, S. Cardiac myosin binding protein-C: a potential early-stage, cardiac-specific biomarker of ischemia-reperfusion injury. Biomark Med. 6, 69-72 (2012).
- Fichorova, R. N., et al. Biological and technical variables affecting immunoassay recovery of cytokines from human serum and simulated vaginal fluid: a multicenter study. Anal. Chem. 80, 4741-4751 (2008).
- Malekzadeh, A., et al. Challenges in multi-plex and mono-plex platforms for the discovery of inflammatory profiles in neurodegenerative diseases. Methods. 56, 508-513 (2012).
