Summary
测量越来越复杂的生物样品中的生物标志物指导临床决策。我们描述一个高度敏感的方法同时测量心肌肌球蛋白结合蛋白C，肌酸激酶MB，心肌肌钙蛋白I与心肌梗死和健康对照组受试者的血清样本。
Abstract
生物标志物正变得越来越重要，在临床决策，以及基本的科学。诊断心肌梗死（MI）主要是由患者的血清或血浆中检测心肌特异性蛋白作为心肌损伤的指标。最近的研究表明心肌肌球蛋白结合蛋白C（cMyBP-C）MI后的血清中检测到，我们提出了它作为一种潜在的生物标志物的MI。生物标志物检测通常由传统夹心酶联免疫吸附试验。然而，该技术需要一个大的样品体积，有一个小的动态范围，并且可以测量在一个时间只有一个蛋白质。
在这里，我们示出了复用的免疫测定法，它可以同时测量三个心脏的蛋白质具有很高的灵敏度。测量cMyBP-C在uniplex或共同肌酸激酶MB和肌钙蛋白，我发现类似的敏感性。这种技术使用细观发现（MSD）的复用的方法，在96 - 孔的板，用于检测电致化学发光结合。虽然只有少量样品的要求，实现高灵敏度和大动态范围。使用这种技术，我们测量cMyBP-C，肌酸激酶MB，心肌肌钙蛋白I血清样品从16个科目与MI水平，并与16个对照组比较的结果。我们能够检测这些样品中的所有三个标记和发现所有三种生物标志物来增加心肌梗死后。因此，这种技术是适用于敏感的检测血清样品中的心脏生物标记物的。
Introduction
低量的蛋白质，在复杂生物样品，如血清，测量病人的管理，以及基础科学发展的临床重要性。比如，增加血清心脏生物标志物，如肌钙蛋白I，在临床的设置是一致的急性心肌梗死（MI）1。为了检测血清样品中的蛋白质，标准的酶联免疫吸附试验（ELISA）法是最常用的技术，因为它具有高灵敏度和允许的被分析物的绝对定量。然而，传统的ELISA试剂盒，需要一个比较大的量的样品（一般为100微升），在生物体液中的一些具有高的背景信号，并且被限制为只有一个每2酶联免疫吸附分析物的测量。
最近，一种新的免疫分析技术被引入的情况下，许多这些缺点。此修改后的实验中，由MSD的开发，使用electrochemiluminescENCE（ECL）信号的检测，允许一个非常低的背景和敏感性的增加，能够使用小样本量。电致化学发光是根据记者分子钌（II）trisbipyridal，这是附加的检测抗体。记者分子发射光在620nm时的底部的96 -孔的板，它具有集成在其中3个碳电极的电刺激。另外，通过使用点涂，多个捕获抗体可以被涂覆到一个阱（最多10个96孔板上），允许单个样品中4种不同的蛋白质的同时定量。最近这种技术已被用来衡量促炎细胞因子的血清5,6。从MSD多重板媲美其他多重检测平台7。
我们使用MSD作为主要的试验平台，进一步开发一个定制的复杂板的C同时量化心肌肌球蛋白结合蛋白C（cMyBP-C），肌酸激酶同工酶（CK-MB），心肌肌钙蛋白I（cTnI）的水平进行比较，其结果与monoplex检测的cMyBP C。 CK-MB和cTnI MI行之有效的生物标志物。然而，这些生物标志物的增加可引起心肌梗死以外的其他病症， 如心肌炎或肾功能衰竭8。认为除了增加额外的生物标志物的特异性心肌梗死的诊断。最近，我们已经表明cMyBP-C也是一个潜在的生物标志物MI 9。 cMyBP-C是一种粗丝相关蛋白表达在心脏，10-12，但不是在肌肉骨骼或光滑。因此，循环系统中的cMyBP-C的水平的提高是一个特定的心脏损伤的指标13。
在这项研究中，我们比较了使用自定义复杂的检测与测量血清的cMyBP C uniplex检测，CK-MB cMyBP-C和在MI患者血清肌钙蛋白I。在未来，这种签名技术可以用来诊断心肌梗死的患者，在急诊室出现胸痛。
美国芝加哥Loyola大学的机构审查委员会（IRB）批准了这项研究中使用的人类deidentified样本和使用的免疫法（LU＃20392）。
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Protocol
1。 Uniplex cMyBP C含量
- 前一天实验，大衣96以及MSD裸的标准板捕获抗体。对于-C cMyBP，使用的浓度为5微克/毫升稀释于磷酸盐缓冲盐水（PBS）30μl的体积的小鼠单克隆抗cMyBP-C抗体（明胶免费）。
- 由于是疏水性的，吸液管的解决方案以及入下角，然后点击两侧的板块，传播的解决方案，在整个井。
- 板封口板覆盖着，在4°C孵育O / N无晃动。
- 卸下捕获抗体溶液，攻解掉在水槽上方，然后在一叠纸巾。板的非特异性结合是通过加入150微升的5％（重量/体积）的阻断剂（高档BSA）的PBS溶液，以每孔阻塞。
- 密封板，在室温下孵育1小时，，一阵晃动在700转。
- 在阻塞的步骤，准备的标准和amples。标准系列的起始浓度为2000纳克/毫升，以1％（W / V）阻滞剂A / PBS稀释重组cMyBP-C蛋白片段（氨基酸1 - 271）。然后连续阻滞剂在1％（W / V）的A / PBS稀释5倍。共有7标准+ 1空白（1％（W / V）阻滞剂A / PBS单独）使用。
- 取出封闭溶液，并，洗板3倍与150微升的0.05％（体积/体积）Tween-20/PBS。每一次，取出洗净液反相板水槽上方。第三次洗涤步骤后，大力滑动板在水槽上方，并大力拍打板一层纸巾，直到完全干燥。这是关键的一步，孵化量小，任何剩余洗涤液，将大大稀释下孵化。
- 吸取25微升样品和标准入井。密封板，并在RT下孵育，同时以700rpm振摇1小时。
- 在1％阻滞剂A / PBS，准备检测抗体溶液在1微克/毫升。铜STOM cMyBP-C抗体（表位氨基酸2 - 14），与MSD SULFO-TAG标签作为检测抗体。套件可SULFO-TAG标签，使其成为一个相对简单的程序来标记任何抗体。
- 重复洗涤步骤1.4中所描述的步骤。
- 的检测抗体溶液，以每孔中加入25μl，密封板，并在室温下孵育1小时，在板振动筛设置在700rpm。
- 在潜伏期，运行MSD的演示板（板带LED灯），本部门的成像和软件的（参见试剂节），以确保适当的功能。此外，稀释的读缓冲区，这是由MSD，通过添加4x读缓冲区的5毫升〜15毫升的蒸馏水。
- 重复洗涤步骤1.4中所描述的步骤。
- 通过使用多道移液器向每孔中加入150μl的读缓冲。一定要避免气泡（反向移液是一种合适的方法）。除了读缓冲区后，立即扫描板部门成像仪。
2。 3复杂-C cMyBP，CK-MB和cTnI检测
- 96孔3复杂的板和稀释剂的解决方案允许在使用前平衡至室温。该板块是预涂为cMyBP-C，CK-MB和cTnI由MSD捕获抗体。
- 1％（W / V）阻滞剂A / PBS，每孔加入25微升。点选在板的两侧，以确保通过溶液覆盖整个井。
- 用封口膜密封反应板，将板在板振动筛，并以700rpm的速度摇动30分钟。
- 在此期间，从个人校准器系列稀释的制备。因为每个孔有三个捕获抗体三个校准器需要混合串联在使用前稀释。重组cMyBP-C，CK-MB（MSD）和cTnI（MSD）的1％（W / V）阻滞剂A / PBS稀释创建一个样品，2000纳克/毫升100毫微克/毫升-C cMyBP，CK- MB和25 ng / ml的肌钙蛋白I（样品A）。
- 准备至少100微升的最终体积为每个标准。至完成标准系列，连续稀释的样品5倍。使用25微升的样品A在100微升1％（W / V）阻滞剂A / PBS创建示例B.然后用100微升1％（W / V）阻滞剂A / PBS创建样品C的25微升样品B ，等等。人力从16个科目与心肌梗死和16名对照者的血清样本被用来衡量，CK-MB cMyBP-C和cTnI水平。对这些样品进行1％（重量/体积）的阻断剂A / PBS稀释2倍。
- 加入25微升的标准和已经存在于复杂的板的孔中25微升稀释的样品。重要的是，还包括一个空白（稀释剂）。要建立技术，样品装入在技术一式三份。否则，重复的就足够了。
- 再次密封反应板（板盖可重复使用）和孵育的一盘摇床（每分钟700转），在室温下2小时。
- 就在温育结束时，检测抗体溶液的制备。使用的稀释剂是甲在PBS中的1％（重量/体积）的阻断剂。所有THRee值磺酸基标记的检测抗体稀释到终浓度为1μg/ ml的每个。通常在50倍的股票浓度检测抗体。
- 对于一个完整的96 - 孔板中，2700微升的总稀释后的溶液（包括移液误差）。各检测抗体加入54微升至2,538微升1％（W / V）阻滞剂A / PBS。
- 2小时后，删除解决方案，通过大力弹板水槽上方。用150微升的0.05％Tween-20的PBS洗井3次。中加入25μl的检测抗体溶液，每孔用一个多通道的移液管，并在板的两侧，以确保通过溶液覆盖整个井被窃听。
- 密封板和孵化1小时，而震动700转。
- 在潜伏期，运行MSD的演示板（板带LED灯），以确保适当的功能，热像仪和软件部门。还能淡化读缓冲区，这是由MSD，加入5ml 4x读缓冲到15毫升蒸馏水。
- 重复洗涤步骤，在步骤2.8中所述。
- 加入150μl读缓冲区每口井使用多道移液器。避免气泡是至关重要的（反向移液是一种合适的方法）。除了读缓冲区后，立即扫描扇区成像板。
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Representative Results
3复杂的检测的基本原理和工作流程示于图1，表1中记载的总体工作流程。 uniplex检测沿相同的原理工作的整个底部与捕获抗体以及涂覆除外。信号的检测是通过ECL的电信号被施加到井的底部。这反过来SULFO-TAG标签检测抗体的读缓冲区通过化学反应，将启动一个本地生产的光。这导致了低背景和高灵敏度的检测。在图2中的cMyBP-C在uniplex检测的标准曲线比较的cMyBP中的C 3-plex的测定。这两种检测方法表现出很高的灵敏度和高动态范围。检测水平和量化水平如表2所示，在两个uniplex 3复杂的检测是可比较的。 cTnI和CK-MB的检测水平是ALSö在图3和表2所示。运营商间的变化决定通过测量相同的样品（n = 2时，3个技术复制），由两个不同的运营商和变异被发现低（CV 8.5％）。与其他两个校准器的检测抗体的交叉反应性进行了研究孵育所有这三个校准器与单一的检测抗体（ 图4）的各标准曲线。只有低量CK-MB之间的校准和cTnI和cMyBP-C的检测抗体的交叉反应，而其它校准和检测抗体之间没有交叉反应观察。
作为证明的测定法，用于检测心脏损伤的适用性，与MI的16名受试者的血清组（n = 16），与对照组相比。使用3复杂的板，cMyBP-C，CK-MB和cTnI血清进行了测定。所有这三个生物标记物增加在MI科目（见图5）从3.7倍（cMyBP-C）12.2倍（CK-MB），虽然在血清中的变化是最低在cMyBP C组。
| 过程 | Uniplex检测 | 3复杂的实验 | |
| 实验第0天 | 外套板捕获抗体 | 过夜 | N / A |
| 实验第1天 | 遮挡号牌 | 1小时 | 30分钟 |
| 准备样品和标准系列 | |||
| 孵育样品和标准 | 1小时 | 2小时 | |
| 孵育检测抗体 | 1小时 | 1小时 | |
| 加入检测试剂和阅读盘 |
表1中。工作流概述的uniplex和多重检测。
| LLOD（毫微克/毫升） | LLOQ（毫微克/毫升） | ULOQ（毫微克/毫升） | |
| cMyBP-C（uniplex） | （0.126±0.007） | （0.567±0.073） | 400毫微克/毫升 |
| cMyBP-C（3plex） | （0.057±0.022） | （0.469±0.171） | 400毫微克/毫升 |
| CK-MB（复杂） | （0.038±0.014） | （0.587±0.213） | 100毫微克/毫升 |
| 肌钙蛋白I（3plex） | （0.033±0.011） | （0.147±0.053） | 25毫微克/毫升 |
表2中。 uniplex 3复杂的校准检测限被定义为空白+标准偏差的3倍的空白样品的信号计算浓度。LLOD，检测下限。 LLOQ，定量下限，被定义为值高于LLOD，变异系数（信号噪声比的倒数）低于20％，回收率为80 - 120％。 ULOQ，定量的上限，被定义为最高浓度分析可以测量的变异系数小于20％，回收率为80 - 120％。
图1。显示板和工作流程总体示意图A）96孔板。每孔中涂有三种不同的捕获抗体， 即抗cMyBP-C，CK-MB和肌钙蛋白Ⅰ。第四无济于事能够当场不使用，涂有牛血清白蛋白，B）3配合物的酶联免疫吸附的工作流程。预包被的板（ 第1步 ）将被锁定，然后血清样品或校准器被加入到各孔，并允许绑定（ 步骤2）。 cMyBP-C（红钻），CK-MB（绿色矩形），和cTnI（橙色椭圆形）绑定到各自的捕获抗体。洗去未结合的蛋白质后，磺酸基-TAG-标记的检测抗体（ 步骤3）。他们将绑定cMyBP-C，CK-MB或肌钙蛋白I蛋白绑定到他们的捕获抗体。在洗去未结合的检测抗体，读取缓冲器加入分析板。的盘底的电信号启动本地SULFO-TAG用所读取的缓冲液的化学反应，导致生产的光（ 步骤4）。的光的量是磺酸基-TAG标记的检测抗体结合的量成正比。 CCD成像器重新线的光，并可以区分不同的斑点于各孔中，因此，从每个分析物的信号（ 步骤5）。
图2。在uniplex或3-plex的标准曲线cMyBP-C校准器的测量。测量在uniplex检测相同的标准系列，3复杂的板。开始于2000纳克/毫升，连续稀释5倍的最低浓度为0.128 ng / ml的标准系列。此外，稀释液作为空白样品。检测的检测区域显示为灰色。下面的线表示的下限值的检测（LLOD），被定义为空白信号+ 3倍空白值的标准偏差的计算浓度。检测的上限定义为吨他最高浓度的标准系列，能够可靠地测量。双方uniplex和3复杂cMyBP-C标准曲线相媲美的。检测限在将显示在表2中 。 AU：任意单位。
图3。CK-MB和cTnI的标准曲线。 CK-MB和肌钙蛋白Ⅰ的标准曲线，同时测定与cMyBP C 3复杂的板。两个校准显示高灵敏度和大动态范围。检测的检测区域，以灰色显示。下面的线表示的下限值的检测（LLOD），被定义为空白信号+ 3倍空白值的标准偏差的计算浓度。检测的上限值被定义为最高浓度的标准本身一系列能够可靠地进行测量。检测限在将显示在表2中 。 AU：任意单位。
图4。复杂的检测抗体的交叉反应 。的cMyBP-C，CK-MB和cTnI单独的标准曲线制备孵育3复杂的板。每个标准曲线比用单个抗体检测，以评估个别检测抗体（ 如 cMyBP-C）和其它校准器（ 如 CK-MB和cTnI）之间的交叉反应。交叉反应是低在复杂的检测。 点击这里查看大图 。
图5“FO：内容宽度=”3英寸“FO：SRC =”/ files/ftp_upload/50786/50786fig5highres.jpg“SRC =”/ files/ftp_upload/50786/50786fig5.jpg“/>
图5。 3复杂的检测。cMyBP-C，CK-MB和cTnI水平同时测量3复杂的检测血清样本中的16个对照组和16个科目与MI MI和对照组血清生物标记物的水平测量 。数据显示盒须图（晶须占了10 个和90 个百分点）。与MI的受试者的血清中观察到，与对照组相比，所有三个生物标志物的水平的提高。因为数据并没有显示出正态分布（测试由达戈斯蒂诺皮尔逊集锦），采用Mann-Whitney非参数统计测试被用来测试对照组和MI组之间的差异，＃P <0.001
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Discussion
在这项研究中，我们表明多个心脏生物标记物的检测患者血清中的多重免疫测定法的适用性。这种技术有许多优点，比传统的ELISA。首先，使用ECL检测试剂盒中的，而不是比色检测。在ECL，电信号刺激当地生产的测量属性（光），从而解偶联信号的刺激事件，从而降低背景14。这允许高灵敏度，可以看出在表2中。
复用不会导致检测的敏感度的降低，用于检测的cMyBP C，在图2和表2中可以看出。 cMyBP-C测量uniplex，表现出的敏感性和检测范围比较到cMyBP-C同时测定CK-MB和cTnI 13。的同时测量大幅减少所需的样品量测量 -日ts罕见的生物样品中，工作时，以及减少的时间，它可以是一个关键因素，使用了运行多个uniplex检测。
正如任何免疫测定法，该法是高度依赖于所用的抗体的质量。的捕获和检测抗体的亲和性，特异性和亲和力测定15的灵敏度的主要决定因素。应该尝试不同的抗体对捕获和检测抗体组合给出了最高的灵敏度和动态范围。当使用多路传输技术，需要捕获抗体点涂在井。这意味着，低流量的，高度浓缩的溶液点在部分的井的（参见图1）中使用的溶液涂布在在uniplex检测，或在常规ELISA。应该捕获抗体进行评估以及与现货涂层，因为它与溶液涂布。的交叉反应性另一种抗体对抗体或校准，也可以引起假阳性结果2,15。
在这项研究中，一个定制的多重板与MSD合作设计的。虽然预包被的多路板的范围内是市售的，需要这个特定的创新优化检测，因为复用先前优化的目录分析（CK-MB和肌钙蛋白Ⅰ）的一种新的（cMyBP-C）的目标。因此，这种方法的一个明显的缺点是一个专门的板读数器和平板电极检测的ECL信号的附加要求。虽然运行的多重检测与多个uniplex实验将降低整体成本，必须在最初购买酶标仪2。
使用3复杂的免疫测定法测定的生物标志物的释放cMyBP-C，CK-MB和cTnI水平与MI受试者相比，对照组。倍的变化，增加了THE控制组三者之间的生物标志物不同（ 见图4），MI组的变化。预期变化的生物标志物的水平在心肌梗死患者的集合，定时采血，梗塞面积，以及许多其他因素可能有助于释放心脏蛋白和随后的降解过程中的循环。无论是个体的生物标志物水平与临床参数，如心肌梗死面积，需要进一步研究。
翻译这些调查结果直接使用在急诊室检测MI需要一些必须克服的挑战。其中总理的协议产生的结果，甚至用预涂板需要3个半小时的时间。检测与肌钙蛋白今天，应该优化进行快速检测，进行快速诊断。
总之，我们已经开发出一种签名分析，其中两个知道Ñ心脏生物标志物进行了论证和一个潜在的心脏生物标志物，cMyBP-C，同时检测定量心脏蛋白血清滴度MI患者心肌损伤的存在。
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Disclosures
正在等待一个完整的专利申请（申请序列号13/464，466，出版号：美国2012/0282618 A1和日期：05/04/12），以确定相关的风险因素与cMyBP-C的降解和释放到人体体液并定量在人体体液中的水平的cMyBP C。
Acknowledgments
资助这项研究是由美国国立卫生赠款R01HL105826 K02HL114749（博士Sadayappan），美国心脏协会中西部奖学金; 11PRE7240022（先生Barefield）和13POST14720024（Govindan博士）。作者非常感谢其出色的技术和文献支持在开发检测的协助下，吉尔Clampit的吉米·佩奇博士和约翰·哈德森博士，MSD。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| MSD Read-Buffer T (4X) with surfactant | Meso Scale Discovery | R92TC-2 | |
| Tween-20 | Acros | 9005-64-5 | |
| MSD Blocker A | Meso Scale Discovery | R93BA-1 | |
| Phosphate buffered saline, 10X | Fisher BioReagents | BP399-4 | Filter before use |
| Myosin binding protein C antibody, mouse monoclonal (E7), gelatin free | Santa Cruz | SC-137180L | For coating, antibody has to be gelatin free |
| Plates and Equipment | |||
| Multi-Array 96-well standard plate | Meso Scale Discovery | L15XA-3 | |
| A prototype 3-plex, four-spot, 96-well plate with cMyBP-C, cTnI and CK-MB | Meso Scale Discovery | N452A-1 | |
| ThermaSeal Sealing Film | Life Science Products Inc. | ST-3098 | |
| MSD SECTOR Imager 2400A | Meso Scale Discovery | ||
| MTS 2/4 digital microtiter shaker | IKA | 3208001 | |
References
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