Summary
Biomarcadores de medição em amostras biológicas complexas é cada vez mais guiando tomada de decisão clínica. Nós descrevemos um método altamente sensível para medir simultaneamente miosina cardíaca binding protein-C, MB da creatina quinase e troponina I em amostras de soro de pacientes com infarto do miocárdio e controle de indivíduos saudáveis.
Abstract
Biomarcadores são cada vez mais importante na tomada de decisão clínica, bem como a ciência básica. Diagnóstico de enfarte do miocárdio (MI) é amplamente determinado por detecção de proteínas cardíacas específicas no soro ou plasma do paciente, como um indicador de lesão do miocárdio. Tendo recentemente demonstrado que a proteína de miosina cardíaca-C (cMyBP-C) é detectável no soro após o IM, propusemos como um biomarcador potencial de MI. Os biomarcadores são tipicamente detectados por sandwich enzyme-linked immunosorbent tradicionais. No entanto, esta técnica requer um grande volume de amostra, tem uma pequena gama dinâmica e pode medir apenas uma proteína de cada vez.
Aqui, mostramos um imunoensaio multiplex no qual três proteínas cardíacas pode ser medida simultaneamente com elevada sensibilidade. Medindo cMyBP-C em Uniplex ou em conjunto com creatina quinase MB e troponina I apresentaram sensibilidade comparáveis. Esta técnica utiliza a Meso Scale Descoberta(MSD) método de multiplexação de uma placa de 96 poços juntamente com electroquimioluminescência para a detecção. Enquanto apenas pequenos volumes de amostra são necessários, elevada sensibilidade e uma grande gama dinâmica são alcançados. Usando esta técnica, medimos cMyBP-C, MB da creatina quinase e os níveis de troponina I em amostras de soro de 16 pacientes com IAM e compararam os resultados com 16 indivíduos de controle. Fomos capazes de detectar todos os três marcadores nestas amostras e encontrou os três biomarcadores para ser aumentado após o IM. Esta técnica é, portanto, adequado para a detecção sensível de marcadores cardíacos em amostras de soro.
Introduction
A medição de baixas quantidades de proteína em amostras biológicas complexas, tal como o soro, é de crescente importância para a gestão clínica do paciente, assim como a ciência básica. Por exemplo, um aumento dos níveis séricos de marcadores cardíacos, tais como a troponina I, num ambiente clínico é consistente com enfarte agudo do miocárdio (MI) 1. Para detectar proteínas em amostras de soro, padrão de ensaio imunoenzimático (ELISA), é a técnica utilizada na maioria das vezes, uma vez que tem uma elevada sensibilidade e permite a quantificação absoluta de analito. No entanto, os testes ELISA tradicionais exigem uma quantidade relativamente grande de amostra (normalmente 100 l), tem alto sinal de fundo em alguns fluidos biológicos, e são restritas para a medição de um único analito por ELISA 2.
Recentemente, uma nova técnica de imunoensaio foi introduzido que contorna muitos destes inconvenientes. Este ensaio modificado, desenvolvido pela MSD, utiliza electrochemiluminesccia (ECL) para a detecção de sinal, o que permite por um fundo muito baixo e uma sensibilidade aumentada, permitindo a utilização de pequenos volumes de amostra. Electroquimioluminescência é baseado na molécula repórter ruténio (II) trisbipyridal, que está ligado aos anticorpos de detecção. Esta molécula repórter emite luz a 620 nm após a estimulação eléctrica do fundo da placa de 96 poços, que tem eléctrodos de carbono integrados neles 3. Além disso, por meio de revestimento local, os anticorpos de captura múltiplas podem ser revestidos para um poço (até 10 numa placa de 96 poços), permitindo a quantificação simultânea de proteínas diferentes numa única amostra 4. Esta técnica tem sido recentemente usado para medir perfis de citoquinas pró-inflamatórias em soro 5,6. As placas de multiplex MSD comparam favoravelmente com outras plataformas de ensaio multiplex 7.
Usando MSD como a plataforma de ensaio primário, desenvolvemos mais uma custom made placa 3-plex que cuma quantificar simultaneamente o nível de ligação às proteínas miosina cardíaca-C (cMyBP-C), creatina-quinase MB (CK-MB) e troponina I (cTnI), e os resultados foram comparados com detecção Monoplex de cMyBP-C. CK-MB e cTnI são biomarcadores bem estabelecidos para MI. No entanto, os aumentos destes biomarcadores pode ser causada por outras patologias que MI, por exemplo miocardite ou insuficiência renal 8. Isto argumenta a favor da adição de biomarcadores adicionais para aumentar a especificidade do diagnóstico de EM. Mostrámos recentemente que cMyBP-C é também um biomarcador potencial de MI 9. cMyBP-C é uma proteína associada filamento grosso que é expresso no coração, 10-12, mas não nos músculos esqueléticos ou lisa. Assim, o aumento do nível de cMyBP-C no sistema circulatório é um indicador específico de danos cardíacos 13.
Neste estudo, comparou-se a detecção de Uniplex cMyBP-C com a utilização de um ensaio de 3-Plex personalizado para medir os níveis séricos decMyBP-C, CK-MB e cTnI no soro de pacientes com MI. No futuro, esta técnica de assinatura pode ser usado para diagnosticar MI em pacientes com dor torácica na sala de emergência.
O conselho de revisão institucional (IRB), da Loyola University Chicago aprovou o estudo para o uso de amostras humanas deidentified eo uso do imunoensaio (LU # 20392).
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Protocol
1. Uniplex cMyBP-C Assay
- Um dia antes do experimento, casaco da placa padrão nu 96 poços MSD com anticorpo de captura. Para cMyBP-C, usar um volume il de 30 de rato anticorpo anti-cMyBP-C monoclonal (gelatina livre), a uma concentração de 5 ug / ml diluído em tampão fosfato salino (PBS).
- Uma vez que o poço é hidrofóbico, pipetar a solução para o canto inferior do poço; toque os lados da placa para espalhar a solução ao longo de todo o poço.
- A placa é coberta com um selante de placa e incubadas O / N a 4 ° C sem agitação.
- Remover a solução de anticorpo de captura tocando a solução ao longo de um lavatório e, em seguida, sobre uma pilha de toalhas de papel. A ligação não específica para a placa é bloqueada por adição de 150 ul de uma de 5% (w / v) de bloqueador Uma solução (BSA alto grau) em PBS a cada poço.
- Selar a placa e incubar durante 1 hora à temperatura ambiente, agitando a 700 rpm.
- Durante o passo de bloqueio, preparar as normas e splos. Adicione a série padrão diluindo fragmento da proteína recombinante cMyBP-C (aminoácidos 1-271), para uma concentração de partida de 2,000 ng / ml em 1% (w / v) de bloqueador de A / PBS. Depois dilui-se sequencialmente por um factor de 5 em 1% (w / v) de bloqueador de A / PBS. Total de sete padrões + 1 em branco (1% (w / v) de bloqueador Um apenas PBS /) foram usadas.
- Remover a solução de bloqueio e lavar a placa 3 vezes com 150 ul de 0,05% (v / v) Tween-20/PBS. Cada vez, remover a solução de lavagem através da inversão da placa de cima de uma pia. Após a terceira etapa de lavagem, vigorosamente apertar o prato sobre uma pia e seque a placa vigorosamente sobre uma camada de papel toalha até que esteja completamente seco. Este é um passo crucial, como volumes de incubação são pequenos, e qualquer solução de lavagem restante irá diluir significativamente a próxima incubação.
- Pipetar 25 ul de padrões e das amostras nas cavidades. Selar a placa e incubar à temperatura ambiente, agitando a 700 rpm durante 1 hora.
- Preparar a solução de anticorpo de detecção de 1 ug / ml em 1% bloqueador A / PBS. A cuestômagos feito anticorpo cMyBP-C (aminoácidos epitopo 2-14) com MSD sulfo-TAG rotulagem serve como anticorpo de detecção. Kits estão disponíveis para SULFO-TAG rotulagem, tornando-se um procedimento relativamente simples para rotular qualquer anticorpo.
- Repetir o passo de lavagem, tal como descrito na etapa 1.4.
- Adicionar 25 ul de solução de anticorpo de detecção para cada poço, selar a placa e incubar a temperatura ambiente durante 1 hora num agitador de placas definida a 700 rpm.
- Durante o período de incubação, executar MSD da demo placa (placa com luzes LED) para garantir o funcionamento adequado do Imager Sector e software (consulte a seção de reagentes). Além disso, diluir o-tampão de leitura, que é fornecido pela MSD, por adição de 5 ml de 4x ler-tampão de 15 ml de água destilada.
- Repetir o passo de lavagem, tal como descrito na etapa 1.4.
- Adicionar 150 ul de leitura tampão em cada poço utilizando uma pipeta multicanal. Certifique-se de evitar bolhas de ar (pipetagem reversa é um método adequado). Após a adição da leitura tampão, verificar imediatamente a placa no sectorImager.
2. 3-plex cMyBP-C, CK-MB e cTnI Assay
- A placa de 96 poços 3-Plex e diluente soluções são deixadas a equilibrar à temperatura ambiente antes do uso. Esta placa é pré-revestido com anticorpos de captura para cMyBP-C, CK-MB e cTnI pela MSD.
- Adicionar 25 ul de 1% (w / v) de bloqueador A / PBS a cada poço. Os lados da placa para assegurar que todo o poço é coberto pela solução.
- Selar a placa com o selador de placa, coloque a placa em um shaker prato, e agitar a 700 rpm por 30 min.
- No entanto, uma série de diluições de calibradores individuais é preparado. Porque cada poço tem três anticorpos de captura três calibradores necessidade de ser misturado e diluído em série antes da utilização. Diluir recombinante cMyBP-C, CK-MB (MSD), e TIc (MSD) em conjunto em 1% (w / v) de bloqueador de A / PBS, para criar uma amostra de 2,000 ng / ml cMyBP-C, com 100 ng / mL de CK- MB, e 25 ng / mL TIc (amostra A).
- Um volume final de pelo menos 100 ul é preparado para cada padrão. Acompletar a série padrão, diluir em série das amostras são, por um factor de 5. Usar 25 ul da amostra A em 100 uL de 1% (w / v) de bloqueador A / PBS para criar amostra B. Em seguida, utilizar 25 ul de amostra B, em 100 ul de 1% (w / v) de bloqueador de A / PBS para criar Amostra C , e assim por diante. Amostras de soro humano de 16 pacientes com IAM e 16 indivíduos controle foram usados para medir cMyBP-C, CK-MB, e os níveis de cTnI. Estas amostras foram diluídas 2x em 1% (w / v) de bloqueador de A / PBS.
- Adicionam-se 25 ul dos padrões e das amostras diluídas aos 25 ul já presente nos poços da placa 3-Plex. É importante também incluir um espaço em branco (apenas solvente). Para estabelecer a técnica, as amostras são carregadas em triplicado técnicos. Caso contrário, as duplicatas são suficientes.
- Selar a placa novamente (vedante de placa pode ser reutilizada) e incubar num agitador de placas (700 rpm) a temperatura ambiente durante 2 horas.
- Imediatamente antes da incubação é terminada, a solução de anticorpo de detecção é preparado. O diluente utilizado é de 1% (w / v) de bloqueador A em PBS. Todos thrOs anticorpos de detecção de ee SULFO-marcadas são diluídos em conjunto a uma concentração final de 1 ug / ml cada. Anticorpos de detecção são normalmente fornecidos com uma concentração estoque de 50x.
- Para uma placa de 96 poços completo, é necessário 2,700 ml de solução total diluído (com erro de pipetagem incluídas). Adicionar 54 ul de cada um dos anticorpos de detecção de 2538 ul de 1% (w / v) de bloqueador de A / PBS.
- Após 2 horas, retire soluções sacudindo vigorosamente a placa acima de uma pia. Lavar os poços 3x com 150 mL de 0,05% de Tween-20 em PBS. Adicionar 25 ul de solução de anticorpo de detecção para cada poço utilizando uma pipeta multicanal, e os lados da placa são virados para garantir que todo o poço é coberto pela solução.
- Selar a placa e incubar durante 1 hora, agitando a 700 rpm.
- Durante o período de incubação, executar MSD da demo placa (placa com luzes LED) para garantir o funcionamento adequado do Imager Sector e software. Também diluir o-tampão de leitura, que é fornecido pela MSD, por adição de 5 ml de 4x leituraamortecer a 15 ml de água destilada.
- Repetir o passo de lavagem descrito no passo 2.8.
- Adicionar 150 ul de leitura tampão em cada poço utilizando uma pipeta multicanal. Evitando bolhas de ar é crítica (pipetagem reversa é um método adequado). Após a adição da leitura tampão, verificar imediatamente a placa na Imager sector.
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Representative Results
Os princípios básicos e fluxo de trabalho do ensaio 3-Plex são mostrados na Figura 1, e o fluxo de trabalho geral está descrito na Tabela 1. Ensaios UNIPLEX trabalhar ao longo do mesmo princípio, excepto que toda a parte inferior também é revestida com um anticorpo de captura. A detecção do sinal é feito por ECL em que um sinal eléctrico é aplicado à parte inferior do poço. Isto, por sua vez, inicia uma produção local de luz através de uma reacção química da leitura de tampão, com o rótulo sulfo-TAG no anticorpo de detecção. Isto leva ao fundo baixo e elevada sensibilidade do ensaio. Na Figura 2, a curva padrão de cMyBP-C no ensaio Uniplex é comparada com a de cMyBP-C no ensaio de 3-Plex. Ambos os ensaios mostram uma sensibilidade muito elevada e uma gama dinâmica elevada. Níveis de detecção, e os níveis de quantificação estão apresentados na Tabela 2 e são comparáveis em ambos Uniplex e ensaios 3-Plex. Níveis de detecção de cTnI e CK-MB são also mostrado na Figura 3 e Tabela 2. Variabilidade inter-operador foi determinada medindo amostras idênticas (n = 2, 3 técnico réplicas) por dois operadores diferentes e variabilidade foi considerado baixo (CV 8,5%). Reactividade cruzada de anticorpos de detecção, com os outros dois calibradores foram estudados por incubação de curvas padrão individuais de todos os três calibradores com anticorpos de detecção individuais (Figura 4). Apenas baixa quantidade de reatividade cruzada foi observada entre CK-MB calibrador e tanto cTnI e anticorpos de detecção cMyBP-C, enquanto nenhuma reação cruzada foi observada entre os outros calibradores e anticorpos de detecção.
Como prova da aplicabilidade do ensaio para a detecção de lesão cardíaca, os níveis de soro de 16 indivíduos com IAM foram comparados com um grupo de controlo (n = 16). Usando a placa 3-plex, os níveis séricos de cMyBP-C, CK-MB e cTnI foram determinados. Todos os três biomarcadores foram aumentados nos indivíduos MI (verFigura 5) a partir de 3,7 vezes (cMyBP-C) a 12,2 vezes (CK-MB), embora variações nos níveis séricos foi a mais baixa no grupo cMyBP-C.
| Processo | Uniplex ensaio | Ensaio 3-plex | |
| Experimento dia 0 | Placa casaco com anticorpo de captura | Durante a noite | N / D |
| Experiência dia 1 | Bloquear a placa | 1 hr | 30 min |
| Preparar amostras e séries padrão | |||
| Incubar com as amostras e padrões | 1 hr | 2 hr | |
| Incubar com anticorpo de detecção | 1 hr | 1 hr | |
| Adiciona-se reagente de detecção e lerprato |
Tabela 1. Visão geral do fluxo de trabalho de Uniplex e ensaios multiplex.
| LLOD (ng / ml) | LLOQ (ng / ml) | ULOQ (ng / ml) | |
| cMyBP-C (Uniplex) | 0,126 ± 0,007 | 0,567 ± 0,073 | 400 ng / mL |
| cMyBP-C (3plex) | 0,057 ± 0,022 | 0,469 ± 0,171 | 400 ng / mL |
| CK-MB (3-plex) | 0,038 ± 0,014 | 0,587 ± 0,213 | 100 ng / mL |
| cTnI (3plex) | 0,033 ± 0,011 | 0,147 ± 0,053 | 25 ng / mL |
Tabela 2. Os limites de detecção de Uniplex e calibradores 3-Plex. LLOD, o limite inferior de detecção é definido como a concentração calculada do sinal do branco + 3 vezes o desvio padrão de amostras em branco. LLOQ, o limite inferior de quantificação, é definida como um valor superior ao LLOD, com um coeficiente de variância (recíproco da relação sinal-ruído) inferior a 20%, e uma recuperação entre 80 - 120%. ULOQ, limite superior de quantificação, é definido como a concentração mais elevada analisada que pode ser medido com um coeficiente de variação inferior a 20% e uma recuperação de entre 80 - 120%.
Figura 1. Visão esquemática da placa e workflow. A) placa de 96 poços é mostrada. Cada cavidade é revestida com três anticorpos de captura diferentes, isto é, contra o cMyBP-C, CK-MB e TIc. O quarto disponívelcapaz local não é usado e é revestida com BSA. B) Fluxo do ELISA 3-Plex. A placa pré-revestida (passo 1) é bloqueado e, em seguida, as amostras de soro ou calibradores são adicionados a cada poço e deixou-se ligar (passo 2). cMyBP-C (diamantes vermelhos), CK-MB (retângulo verde), e cTnI (oval) se ligam aos seus respectivos anticorpos de captura. Após a lavagem para retirar as proteínas não ligadas, os anticorpos de detecção sulfo-TAG-marcadas são adicionadas (passo 3). Eles vão ligar para o cMyBP-C, CK-MB, ou proteínas cTnI que estão ligados ao seu anticorpo de captura. Após a lavagem para retirar o anticorpo de detecção não ligado, buffer de leitura é adicionado e a placa é analisada. Um sinal eléctrico para o fundo da placa inicia uma reacção química local do sulfo-TAG com o tampão de leitura, levando à produção de luz (passo 4). A quantidade de luz é diretamente proporcional à quantidade de SULFO-TAG anticorpo de detecção marcado ligado. O CCD recabos de luz e pode distinguir os diferentes pontos dentro de cada poço e, por conseguinte, o sinal proveniente de cada analito (passo 5).
Figura 2. Curva padrão de cMyBP-C calibrador medido em Uniplex ou em 3-Plex. A mesma série padrão foi medido num ensaio de Uniplex, e sobre a placa 3-Plex. A série padrão começou a 2,000 ng / ml e diluiu-se serialmente 5x com a concentração mais baixa sendo de 0,128 ng / ml. Além disso, o diluente foi utilizado como uma amostra em branco. A área de detecção do ensaio é mostrado em cinza. A linha mais baixa indica o limite inferior de detecção (LLOD), que é definido como a concentração calculada do sinal do branco + 3 vezes o desvio padrão dos valores em branco. O limite superior de detecção é definido como tele concentração mais elevada da série padrão que pode com segurança ser medido. Ambas as curvas padrão cMyBP-C UNIPLEX e 3-Plex são comparáveis. Os limites de detecção estão apresentados na Tabela 2. au: unidades arbitrárias.
Figura 3. Curvas padrão de CK-MB e cTnI. Curvas padrão de CK-MB e cTnI, que foram medidos em simultâneo com cMyBP-C na placa 3-plex. Ambos os calibradores mostram alta sensibilidade e uma grande gama dinâmica. Em cinzento da área de detecção do ensaio é visualizado. A linha mais baixa indica o limite inferior de detecção (LLOD), que é definido como a concentração calculada do sinal do branco + 3 vezes o desvio padrão dos valores em branco. O limite superior de detecção é definido como a concentração mais elevada do padrão si rias que fiável pode ser medido. Os limites de detecção estão apresentados na Tabela 2. au: unidades arbitrárias.
Figura 4. Reatividade cruzada de anticorpos de detecção 3-Plex. Curvas padrão separadas de cMyBP-C, CK-MB e cTnI foram preparadas e incubadas na placa 3-plex. Cada curva padrão foi que sondada com anticorpos de detecção individuais, para avaliar a quantidade de reatividade cruzada entre os anticorpos de detecção individuais (por exemplo cMyBP-C) e os outros calibradores (por exemplo, CK-MB e cTnI). Reatividade cruzada foi baixa no ensaio 3-plex. Clique aqui para ver a figura maior .
Figura 5 "fo: content-width =" 3 pol "fo: src =" / files/ftp_upload/50786/50786fig5highres.jpg "src =" / files/ftp_upload/50786/50786fig5.jpg "/>
Figura 5. Níveis de biomarcadores no soro de MI e controles medido com ensaio 3-plex. Níveis de cMyBP-C, CK-MB e cTnI foram medidos simultaneamente por ensaio 3-plex em amostras de soro de 16 indivíduos controles e 16 indivíduos com MI. Os dados são exibidos pela caixa e bigode parcelas (bigodes representam 10 º e 90 º percentil). Aumento dos níveis de todos os três marcadores foram observados no soro de pacientes com MI em comparação com o grupo de controlo. Porque os dados não mostraram uma distribuição normal (testado por D'Agostino Pearson Omnibus), o teste estatístico de Mann-Whitney não-paramétrico foi usada para testar as diferenças entre os grupos MI controlo e # P <0,001.
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Discussion
Neste estudo, mostra a aplicabilidade de um imunoensaio multiplex para a detecção de múltiplos marcadores cardíacos no soro de pacientes. Esta técnica tem inúmeras vantagens sobre ELISA tradicional. Primeiro, ECL no kit de ensaio é utilizado em vez de detecção colorimétrica. Em ECL, um sinal eléctrico estimula a produção local de propriedade medida (de luz), desacoplando assim o evento estimulação do sinal, o que reduz o fundo 14. Isto permite uma elevada sensibilidade, como pode ser visto na Tabela 2.
Multiplexing o ensaio não resultará numa perda de sensibilidade para a detecção de cMyBP-C, tal como pode ser visto na Figura 2 e Tabela 2. cMyBP-C medidos em Uniplex mostrou uma variedade comparável à cMyBP-C sensibilidade e detecção medidos em simultâneo com CK-MB e cTnI 13. Medições simultâneas reduzir substancialmente o volume da amostra necessário para MEDIÇÃOts, que pode ser um factor crítico quando se trabalha com amostras biológicas raras, bem como a redução do tempo gasto em execução múltiplos ensaios UNIPLEX.
Tal como acontece com qualquer imunoensaio, o ensaio é altamente dependente da qualidade dos anticorpos utilizados. A afinidade, especificidade e avidez dos anticorpos de captura e de detecção é o principal determinante da sensibilidade do ensaio 15. Pares de anticorpos diferentes devem ser julgados para ver qual combinação de anticorpos de captura e detecção dá a maior sensibilidade e gama dinâmica. Ao utilizar técnicas de multiplexagem, os anticorpos de captura precisa de estar no local revestido no bem. Isto significa que um volume menor, a solução altamente concentrada é visto em parte do poço (ver Figura 1), em contraste com a solução de revestimento utilizada no ensaio Uniplex ou em ELISA convencional. Deve ser avaliado se o anticorpo de captura funciona tão bem com o revestimento do ponto em que faz com solução de revestimento. Reatividade cruzadaanticorpos ou calibradores com um outro par de anticorpos também podem dar origem a resultados falso-positivos 2,15.
Para este estudo, uma placa multiplex feito sob medida foi projetado em cooperação com a MSD. Apesar de uma gama de placas pré-revestidas de multiplex estão disponíveis comercialmente, esta inovação em particular necessária optimização do ensaio, porque um novo alvo (cMyBP-C) foi multiplexado com os ensaios de catálogo previamente optimizados (CK-MB e TIc). Como tal, uma desvantagem óbvia deste método é o requisito acrescentado para um leitor de placas especializadas e placas contendo eléctrodos para detectar o sinal de ECL. Embora a execução de um ensaio multiplex contra vários ensaios UNIPLEX vai reduzir os custos gerais, um leitor de placas devem ser comprados inicialmente 2.
Usando o imunoensaio 3-plex os níveis de liberação de biomarcadores de cMyBP-C, CK-MB e cTnI foi medida em pacientes com MI e comparados com um grupo controle. A mudança dobra de aumento em relação ªgrupo de controlo e diferiu entre os três marcadores (ver Figura 4), assim como a variação do grupo MI. Variação nos níveis de biomarcadores é esperado em uma coleção de pacientes que sofreram infarto, como a época de coleta de sangue, o tamanho do infarto, bem como uma série de outros fatores contribuem para a liberação de proteínas cardíacas e sua degradação posterior na circulação. Quer ao nível dos biomarcadores individuais se correlacionam com os parâmetros clínicos, tais como o tamanho do enfarte, merece mais estudo.
Diretamente traduzir esses achados para usar em sala de emergência para detectar MI exige uma série de desafios a serem superados. Primeiro entre eles é o tempo que o protocolo necessário para produzir resultados, que mesmo com placas pré-revestidas leva 3 ½ horas. Tal como acontece com os ensaios de troponina usados hoje, o ensaio deve ser otimizado para a detecção rápida, permitindo um diagnóstico rápido.
Em conclusão, nós desenvolvemos um ensaio de assinatura no qual dois conhecemn biomarcadores cardíacos e um potencial biomarcador cardíaco, cMyBP-C, foram demonstrados para detectar simultaneamente a presença de lesão miocárdica em pacientes com MI por quantificação de títulos séricos de proteínas cardíacas.
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Disclosures
A plena aplicação da patente está pendente (Petição N º de série 13/464, 466, Pub. No. EUA 2012/0282618 A1 e Data:. 05/04/12) para determinar os fatores de risco associados com a degradação cMyBP-C e liberação no fluido corporal humano e quantificar o nível de cMyBP-C no fluido do corpo humano.
Acknowledgments
Este estudo foi financiado pelos Institutos Nacionais de Saúde concede R01HL105826 e K02HL114749 (Dr. Sadayappan) e American Heart Association Midwest Fellowships; 11PRE7240022 (Mr. Barefield) e 13POST14720024 (Dr. Govindan). Os autores agradecem o apoio de Dr. Jimmy Page, Jill Clampit e Dr. John Hudson, MSD, pelo excelente suporte técnico e literatura no desenvolvimento do ensaio.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| MSD Read-Buffer T (4X) with surfactant | Meso Scale Discovery | R92TC-2 | |
| Tween-20 | Acros | 9005-64-5 | |
| MSD Blocker A | Meso Scale Discovery | R93BA-1 | |
| Phosphate buffered saline, 10X | Fisher BioReagents | BP399-4 | Filter before use |
| Myosin binding protein C antibody, mouse monoclonal (E7), gelatin free | Santa Cruz | SC-137180L | For coating, antibody has to be gelatin free |
| Plates and Equipment | |||
| Multi-Array 96-well standard plate | Meso Scale Discovery | L15XA-3 | |
| A prototype 3-plex, four-spot, 96-well plate with cMyBP-C, cTnI and CK-MB | Meso Scale Discovery | N452A-1 | |
| ThermaSeal Sealing Film | Life Science Products Inc. | ST-3098 | |
| MSD SECTOR Imager 2400A | Meso Scale Discovery | ||
| MTS 2/4 digital microtiter shaker | IKA | 3208001 | |
References
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