Summary
Descriviamo qui come eseguire una microiniezione cella singola di Lucifero giallo di visualizzare la comunicazione cellulare attraverso gap giunzioni nelle cellule viventi, e fornire alcuni suggerimenti utili. Ci aspettiamo che questo articolo vi aiuterà a tutti di valutare il grado di accoppiamento cellulare a causa di giunzioni funzionali. Tutto qui descritto potrebbe essere, in linea di principio, atto ad altri coloranti fluorescenti con peso molecolare inferiore a 1000 Daltons.
Introduction
Giunzioni intercellulari sono canali che permettono l'intercomunicazione tra cellule vicine 1. Questa comunicazione connette due o più celle confinanti, dove ognuno contribuisce con connessone o hemichannel per formare il canale intercellulare. In cellule di mammifero, la connessone è formata da sei connessine, monomeri con quattro domini transmembrana e un C e terminale N all'interno del citoplasma 2. Giunzioni non solo permettono il flusso di ioni, secondi messaggeri e piccoli metaboliti, ma contribuiscono anche a molte forme di comunicazione cellulare in molti processi fisiologici, come la trasmissione sinaptica, contrazione cardiaca, la crescita e la differenziazione cellulare 3, 4, 5, 6, 7, 8. Inoltre giunzioni sono stati associati conmolte malattie tra cui il cancro 9, 10, 11 atrofia muscolare, alcune malattie genetiche e malattie demielinizzanti 12.
Questo tipo di crosstalk intercellulare può essere valutata mediante diversi metodi 13, 14, 15, 16. In questo lavoro, si mostra come eseguire una microiniezione cella singola di Lucifero giallo di visualizzare la comunicazione cellulare attraverso gap giunzioni nelle cellule viventi. Discutiamo come preparare le cellule e la micropipetta, l'uso del micromanipolatore e l'iniezione di Lucifero colorante giallo in una linea di cellule epiteliali del timo. Solitamente, questa procedura sperimentale potrebbe essere analizzato dalla media delle celle collegate alla cella caricato con colorante. Inoltre, questo metodo può essere usato con altri coloranti fluorescenti con peso molecolare inferiore del gapgiunzioni cut-off, che è di circa 1.000 dalton.
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Protocol
1. Preparazione di cellule
- Mantenere una cultura di una linea timica cellule epiteliali (IT76M1) o cellule da testare in un incubatore (37 ° C / 5% di CO 2).
- Lavare le cellule con PBS 1x (ripetere questo punto 3x).
- Aggiungere tripsina alle cellule per 5 min.
- Aggiungere mezzo (il doppio del volume di tripsina aggiunto al punto 1.3) con 10% FBS (siero bovino fetale) alle cellule con tripsina e centrifugare (800 xg per 5 min).
- Contare le cellule in un emocitometro.
- Regolare la densità di cellule a seconda del tipo di cellule come le cellule devono essere in stretto contatto con l'altro per consentire l'accoppiamento. Nota: Nel nostro caso, abbiamo utilizzato 3 x 10 5 cellule per 35 millimetri Petri.
2. Preparazione Micropipetta
- Tirare la micropipetta come specificato da una micropipetta capillare di vetro (1,5 mm di diametro) per una finale di 0,2 micron di diametro in modo da raggiungere una resistenza finale di circa 30 MWf "> 17, 18.
NOTA: In alternativa, pipette di iniezione possono essere acquistati. La resistenza dipende dalla dimensione della cella, per esempio sarebbe necessario per cellule acinose pancreatiche un microelettrodo resistenza maggiore, per esempio (100-150 MW) 19. Un problema comune che potrebbe verificarsi è la precipitazione della soluzione giallo Lucifero che può ostacolare la micropipetta e possono richiedere filtrazione o centrifugazione prima. Prima dell'iniezione, la micropipetta deve essere analizzato al microscopio per rilevare se vi è un'ostruzione o qualsiasi tipo di interruzione 13. La micropipetta può essere testato iniettando LY con la punta micropipetta all'interno di una soluzione salina.
3. Test del Micropipetta
- Preparare la soluzione giallo Lucifero (5%) in 150 mmol / L LiCI e caricare la micropipetta con una siringa o riempimento (messo in esso LY Solution).
- Posizionare il micropipette over da 35 mm piastra di Petri con le cellule IT76M1 sulla workstation microiniezione e immergere la punta della micropipetta di vetro nel mezzo cellulare. Focus sul micropipetta ed eseguire un test di tinteggiatura che scorre mediante l'applicazione di un impulso.
4. Single-cell Lucifer Yellow microiniezione
- Mettere a fuoco il microscopio proprio sopra lo strato di cellule con un alto fi cazione ingrandimento (40X), quindi abbassare lentamente la pipetta alle cellule utilizzando il micromanipolatore.
- Perforare la cella di destinazione quando la punta è abbastanza vicino a toccare la membrana cellulare, e applicare un piccolo impulso iperpolarizzante di introdurre il LY nella cella. La tensione applicata dipende dalla carica netta di colorante da iniettare. In alternativa, alcuni altri coloranti possono essere usati con questa tecnica come mostrato nella Tabella 1.
Nota: In linea di principio qualsiasi colorante idrofilo con MW meno di 1KDa potrebbe essere utilizzato. Tuttavia, la velocità di trasferimento può variare a seconda del peso e idrofilia. Inoltre, utrasferimento nspecific del colorante utilizzato deve essere valutata. - Catturare le immagini delle cellule 3 minuti dopo l'iniezione di tintura o di fare un piccolo film con lasso di tempo la microscopia (30 fps).
NOTA: Un approccio simile potrebbe essere visto in Hitomi et al (2015) 20. Per evitare comunicazione da ponti intercellulari (mitosi incompleta), un co-iniezione di rhodamin destrano (da 2 a 10 KDa), che non passa attraverso giunzioni gap ma passa attraverso ponti intercellulari e certi tipi di nanotubuli è raccomandato come mostrato in figura 2 .
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Representative Results
Timica linea di cellule epiteliali IT-76MI sono stati utilizzati per valutare l'accoppiamento colorante da giunzioni in quanto queste cellule sono state descritte per esprimere giunzioni funzionali formati da connessina 43 21. La Figura 1 mostra l'iniezione di Lucifer Yellow quando applicato in una cella sotto la punta della pipetta. Dopo alcuni minuti, celle collegate diventano fluorescenti (asterischi) indica la diffusione del colorante fluorescente attraverso le giunzioni. Il numero di celle e il tempo di diventare fluorescente è direttamente associato con il grado di comunicazione cellulare tra queste cellule. La Figura 2 mostra l'iniezione di LY in cellule epiteliali timici e gli inserti (inserto d) mostrano la co-iniezione di LY e rodamina destrano (10KDa). Come previsto il LY passa a una cella confinante, sebbene la rodamina destrano non a causa del suo elevato peso molecolare. Inoltre, la presenza di un bloccante GJ (inserto f), ottanolo, blocked il passaggio del colorante alle cellule circostanti. In alternativa, si può valutare il grado di accoppiamento di una cella specifica o l'effetto di un farmaco sulla funzione di GJ. Figura 3A mostra l'iniezione di LY in cellule TEC con o senza desametasone. Poi sono state iniettate 100 cellule, in presenza di desametasone e la percentuale di 1 o 2 celle comunicanti era simile in relazione al controllo senza la droga. Tuttavia il numero di 3 o 4 celle comunicanti era superiore rispetto ai controlli. Cinque o 6 celle e 7 o 8 celle con comunicazione GJ in presenza di desametasone non è stata osservata nel controllo, indicando così che il desametasone aumentato il grado di accoppiamento in cellule TEC.
Figura 1: Lucifer iniezione giallo in cellule IT-76MI. (A) La micropipetta vicino alla membrana cellulare. (B (C) Un impulso di prova è stato generato per verificare se l'elettrodo è in realtà iniettando il colorante. (D) La pipetta toccò la membrana cellulare ed è stato accusato di Lucifero colorante giallo. (E) La cella carica permesso il colorante di passare attraverso giunzioni almeno cinque celle vicine (indicato dalle frecce), X20. F) uno zoom digitale è stato fatto per consentire una migliore visualizzazione. Gli asterischi indicano le cellule che sono state addebitate in fase di contrasto microscopia (Figura 1A). Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Lucifer iniezione giallo in cellule epiteliali del timo (TEC). contrasto di fase e microscopia a fluorescenza. (A B) delle cellule umane timica epiteliale. (C e D) Nurse Thymic cellulare, (E ed F) linea cellulare Un Mouse Thymic epiteliale, rispettivamente. L'inserto in (D) mostra la stessa cella (freccia), dopo un'iniezione di rodamina-destrano 10KDa (non permeabile attraverso giunzioni gap). Gli inserti in (E) e (F) indicano l'assenza di trasferimento del colore nella linea TEC pretrattato con ottanolo 1 mM (un gap junction bloccante) per 10 min. In tutti i pannelli asterischi indicano le cellule iniettate. (AF) X 200. Tratto da Alves et al. 1995 5. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Gap giunzione communication aumentata di desametasone in una linea cellulare epiteliale di ratto. TEC sono stati trattati con 1 pM desametasone e grado di accoppiamento è stata valutata mediante il test di trasferimento di colorante giallo Lucifero. Campi (A) Microscopy (contrasto di fase e fluorescenza, rispettivamente, nel pannello destro e sinistro), raffigurante la cellula iniettata e quelli che sono stati accoppiati quando LY è stato iniettato (ingrandimento 320X). In tutti i pannelli asterischi indicano le cellule iniettate. (B) istogrammi mostra il modello di accoppiamento di controllo e cellule desametasone. L'analisi comprende 100 microiniezioni per gruppo. Tratto da Alves et al., 2000 23. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
| COLORANTE | MW | Eccitazione / Emissione |
| carbossilico idrossicumarina | 206 | 386/488 |
| blu calceina | 321 | 360/449 |
| 4 ', 6-diamidino-2-fenilindolo dicloridrato | 279 | 358/461 |
| carboxyfluorescein | 376 | 492/517 |
| etidio ioduro (bromuro) | 314 | 518/605 |
| Lucifer Yellow CH | 443 | 428/536 |
| Alexa Fluor 488 | 570,5 | 495/519 |
| calceina | 622 | 494/517 |
| ioduro di propidio | 414 | 535/617 |
Tabella 1: Coloranti attualmente utilizzato per esperimenti di microiniezione. Qui in,alcune usate coloranti con peso molecolare e la lunghezza d'onda di eccitazione / emissione.
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Discussion
Al fine di verificare la presenza di funzionali gap junction intercellulare, l'uso di rivelatori, che sono membrana impermeabile, anche se permeabile da canali intercellulari sono necessari 16. Fluoresceina, il primo colorante fluorescente per osservare cellula-cellula di accoppiamento 22, è permeabile tra membrane non giunzionali 3 ed è stato quindi sostituito da Lucifer colorante giallo 15. Attualmente, per trovare la migliore scelta tra i diversi tipi di traccianti fluorescenti dipende dalla portata e le condizioni dell'esperimento. La procedura di carico delle cellule con coloranti fluorescenti permette di valutare la morfologia, funzione di singole cellule e il tasso cinetica di trasferimento tra cellule. Inoltre, tintura microiniezione consente una migliore comprensione del ruolo fisiologico di giunzioni tra le cellule 21, 23, poiché il grado di ccomunicazione ellular è in relazione con il numero di celle accoppiate.
Diversi fattori chiave sono cruciali per ottenere con successo i dati microiniezione. omeostasi cellulare normale e l'integrità devono essere mantenute, così un tempo di iniezione breve (<1 s) di colorante e la competenza tecnica con microiniezione è necessario. Fattori chiave per ottenere una migliore risoluzione delle immagini catturate sta avendo una camera CCD raffreddata, i filtri di fluorescenza in atto e l'uso di un obiettivo ad alta NA 14. Inoltre, alcuni suggerimenti potrebbero essere utili come: 1) sono consigliati i piatti di coltura cellulare con griglie di visualizzare una particolare cella iniettato, anche piatti con fondo di vetro devono essere utilizzati per le applicazioni di microscopia ad alta risoluzione; 2) si consiglia di fare 10-20 aghi tirato prima di iniziare microiniezioni; 3) in base alla resistenza della punta dell'elettrodo può essere molto utile, caricando la micropipetta con il colorante usando capillarità toccando la punta della pipetta nella soluzione colorante; 4) non è necessario caricare l'intero corpo della pipetta, pochi microlitri per riempire la punta e da 2 a 3 mm sopra la punta è sufficiente; 5) iniziare l'esperimento con un obiettivo meno ingrandita e provare a vedere l'ombra delle mura pipetta. Successivamente, spostare la pipetta più vicino possibile e prima di toccare la cella, spostare l'obiettivo di ingrandimento superiore, come 40x o superiore; 6) Alcuni gruppi usano un microinjector pneumatico. iniezione pneumatico non è la scelta migliore poiché non è precisa e potrebbe iniettare volumi noti; con un impulso del protocollo potrebbe essere standardizzata per iniettare un volume noto di colorante. Inoltre, si raccomanda di iniettare nella membrana sopra citosol causa della profondità; iniezione nella membrana sopra il nucleo potrebbe danneggiare e incidere fisiologia cellulare. Infine, le cellule che non sono troppo piatte sono preferibili rispetto a quelle piane.
In sintesi, questo metodo è efficace per studiare la comunicazione intercellulare da giunzioni, ma necessitàs competenza / esperienza e buon materiale e le attrezzature per ottenere dati di alta qualità. Speriamo che questo articolo e il video di aiuto ai principianti di comprendere ed eseguire questa tecnica.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Lucifer yellow | Sigma | L0259 | |
| Lithium Chloride | Sigma | L4408 | |
| PBS tablets | Sigma | P4417 | |
| RPMI | Sigma | R4130 | |
| Bovine fetal serum | Cultilab | ||
| Trypsin | Sigma | T4799 | |
| vibration-insulated table | Newport | VH3036W-OPT | A vibration-insulated table is needed to protect the experiments from vibration and avoid cell damage |
| Micromanipulator | Narishige | MMO-203 | This equipment allows precision adjustments of the micropipette, which is needed for cell micro injection. |
| Current Generator | Digitimer | DS2 | To produce the dye flow through the micropipette, a current below one nano ampere was given using a current generator with an electrode inside the micropipette or an amplifier which has a capacitance compensation circuit (old electrometer) or current injection functions of new patch clamp amplifiers, and the ground wire submersed in the plate dish. Alternatively, the dye can be injected by a pneumatic microinjector, following the factory recommendations. |
References
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