Summary
אנו מתארים כאן כיצד לבצע microinjection מתחיל מתא בודד הצהוב לוציפר לדמיין תקשורת סלולרית באמצעות-צומת פער בתאים חיים, ולספק כמה עצות שימושיות. אנו מצפים כי מסמך זה יעזור לכולם להעריך את מידת צימוד הסלולר בשל צומת פער פונקציונליים. הכל המתואר כאן יכול להיות, באופן עקרוני, מותאמי צבעי ניאון אחרים עם משקל מולקולרי להלן 1,000 Daltons.
Introduction
צמתים הפער הם ערוצי אינטר המאפשרים אינטרקום בין תאים שכנים 1. תקשורת זו המחברת בין שני תאים או יותר השכנות, שבהן כל אחד תורם עם connexon או hemichannel כדי ליצור את ערוץ אינטר. בתאי יונקים, את connexon נוצר על ידי שישה connexins, מונומרים עם ארבעה תחומים הטרנסממברני ו- C ו- N מסוף בתוך הציטופלסמה 2. צמתים הפער לא רק לאפשר מעבר של יונים, שליחים משניים מטבוליטים קטנים, אלא גם לתרום הרבה צורות של תקשורת סלולרית בתהליכים פיזיולוגיים רבים, כגון העברה סינפטית, התכווצות הלב, צמיחת תאים ו -3 בידול, 4, 5, 6, 7, 8. בנוסף צומת פער נקשרומחלות רבות כולל סרטן 9, 10, ניוון שרירים 11, כמה מחלות גנטיות demyelinating 12 מחלות.
סוג זה של crosstalk בין תאית יכול להיות מוערך על ידי מספר שיטות 13, 14, 15, 16. במאמר זה, אנו מראים כיצד לבצע microinjection מתחיל מתא בודד הצהוב לוציפר לדמיין תקשורת סלולרית באמצעות-צומת פער בתאים חיים. אנו דנים כיצד להכין את התאים ואת micropipette, את השימוש של micromanipulator והזרמת לצבוע צהוב לוציפר בקו תא אפיתל הרתי. בדרך כלל, הליך ניסיוני זה יכול להיות מנותח על ידי הממוצע של תאי מחוברי התא טעון עם צבע. בנוסף, שיטה זו יכולה לשמש עם צבעי ניאון אחרים עם משקל מולקולרי מתחת הפערצומת חתוכים המהווה כ -1,000 Daltons.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. הכנת תאים
- יש לשמור על תרבות של קו תא אפיתל הרתי (IT76M1) או תא להיבדק באינקובטור (37 ° C / 5% CO 2).
- שוטפים את התאים עם PBS 1x (לחזור פריט זה 3x).
- להוסיף טריפסין על התאים למשך 5 דקות.
- הוסף בינוני (פעמים מהיקף טריפסין הוסיף בסעיף 1.3) עם 10% FBS (בסרום שור עוברי) אל התאים עם טריפסין ו צנטריפוגות (800 XG במשך 5 דקות).
- ספירת התאים ב hemocytometer.
- התאם את הצפיפות של תאים בהתאם לסוג התא כמו התאים צריכים להיות בקשר הדוק עם שני כדי לאפשר צימוד. הערה: במקרה שלנו, השתמשנו 3 x 10 5 תאים לכל 35 מ"מ צלחת פטרי.
2. הכנת Micropipette
- משוך את micropipette כמפורט מתוך micropipette נימי זכוכית (1.5 מ"מ קוטר) על סופי 0.2 מיקרומטר של קוטר כדי להשיג התנגדות סופית של כ -30 MΩf "> 17, 18.
הערה: לחלופין, טפטפות הזרקה ניתן לרכוש. ההתנגדות תלוי בגודל התא, כמו למשל microelectrode עמידות גבוהה יותר יהיה צורך עבור תאי acinar הלבלב, למשל (100-150 MΩ) 19. בעיה נפוצה שעלולה להתרחש היא ממטרים של פתרון צהוב לוציפר אז מה שיכול להכשיל את micropipette והן עשויות לחייב סינון או צנטריפוגה מוקדמת. לפני ההזרקה, micropipette יש לנתח תחת מיקרוסקופ כדי לזהות אם קיימת חסימה או כל סוג של הפרעה 13. את micropipette יכול להיבדק על ידי הזרקת LY עם קצה micropipette בתוך תמיסת מלח.
3. בדיקת Micropipette
- הכן את הפתרון צהוב לוציפר (5%) ב -150 mmol / L LiCI ולטעון את micropipette באמצעות מזרק או למלא את משבצות (מכניס אותו פתרון LY).
- מניחים את micropipeטטי על צלחת פטרי 35 מ"מ עם תאי IT76M1 בתחנת עבודת microinjection ו להטביע את קצה micropipette הזכוכית לתוך המדיום הסלולרי. דגש על micropipette ולבצע בדיקה זורם לצבוע ידי החלת דופק.
4. תא בודד לוציפר צהוב Microinjection
- פוקוס מיקרוסקופ ממש מעל שכבת התאים באמצעות קטיון fi Magni גבוהה (40X), ואז להנמיך את פיפטה לאט אל התאים באמצעות micromanipulator.
- לנקב את תא המטרה כאשר הקצה הוא קרוב עד כדי נגיעת קרום התא, ולהחיל דופק hyperpolarizing קטן להציג את LY לתוך התא. המתח להחיל יהיה תלוי מטען נטו של צבע כדי להיות מוזרק. לחילופין, ישנם צבעים אחרים יכולים לשמש עם הטכניקה הזו כפי שמוצג בטבלה 1.
הערה: באופן עקרוני כל צבע הידרופילי עם MW פחות 1KDa יוכל לשמש. עם זאת, את קצב ההעברה יכול להשתנות על פי המשקל hydrophilicity. בנוסף, uהעברת Nspecific של צבע המשמש חייבת להיות מוערכת. - צלמו תמונות תא 3 דקות לאחר הזרקת צבע או לעשות סרט קטן עם מיקרוסקופיה זמן לשגות (30 fps).
הערה: גישה דומה ניתן היה לראות היטומי ואח '(2015) 20. כדי למנוע תקשורת באמצעות גשרים בין תאית (מיטוזה שלמה) חברת dextran שיתוף הזרקת rhodamin (מ 2 עד 10 KDA), אשר אינו עוברת דרך צומת פער אבל עוברת דרך גשרים בין תאית וסוגים מסוימים של nanotubules המומלץ כפי שמוצג באיור 2 .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
תא אפיתל הרתי קו IT-76MI שמש להעריך צימוד לצבוע ידי צומת פער כמו תאים אלה תוארו להביע צומת פער פונקציונליים נוצרו על ידי connexin 43 21. איור 1 מציג את הזריקה של לוציפר צהוב כשהם מיושמים בתא אחד מתחת קצה פיפטה. לאחר כמה דקות, תאים המחוברים להיות ניאון (כוכביות) המציין את הדיפוזיה של צבע פלואורסצנטי דרך צמתים הפער. מספר התאים והזמן הפך פלורסנט מזוהה ישירות עם מידת תקשורת סלולרית בין תאים אלה. איור 2 מציג את הזריקה של LY בתאי אפיתל הרתי ואת מוסיף (ד הכנס) להראות את שיתוף הזרקת LY ו Rhodamine Dextran (10kDa). כצפוי LY עובר לתא שכן, למרות Rhodamine Dextran לא בגלל המשקל המולקולרי הגבוה שלה. בנוסף, הנוכחות של חוסם GJ (f הכנס), octanol, blocked חלוף לצבוע את התאים הסמוכים. לחלופין, אפשר להעריך את מידת הצימוד של תאים ספציפיים או את ההשפעה של תרופה על הפונקציה של GJ. איור 3 א מציג את הזריקה של LY בתאי TEC עם או בלי dexamethasone. ואז 100 תאים הוזרקו, בנוכחות dexamethasone ואחוז 1 או 2 תאי תקשורת היה דומה ביחס השליטה ללא התרופה. עם זאת מספר תאי 3 או 4 תקשורת התחזק כאשר לעומת שליטה. חמישה או 6 תאים ו -7 או 8 תאים עם תקשורת GJ בנוכחות dexamethasone לא נצפו בבקרה, ובכך המציין כי dexamethasone הגדיל את מידת הצימוד בתאי TEC.
איור 1: הזרקה צהובה לוציפר בתאי IT-76MI. (א) micropipette הקרוב קרום התא. (B (ג) דופק לבדוק נוצר כדי לוודא אם האלקטרודה למעשה הוא הזרקת הצבע. (ד) פיפטה נגעה קרום התא והוא הואשם לצבוע צהוב לוציפר. (ה) התא הטעון מותר לצבוע לעבור דרך צומת פער לתאים שכנים חמישה לפחות (מסומן בחצים), X20. F) זום דיגיטלי נעשה כדי לאפשר ויזואליזציה טובה יותר. כוכביות להצביע על התאים נזקפו מיקרוסקופ לעומת השלב (איור 1 א). אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 2: הזרקה צהובה לוציפר בתאי אפיתל הרתי (TEC). בניגוד שלב מיקרוסקופ פלואורסצנטי. (א B) התא האנושי הרתי אפיתל. (C ו- D) הרתי אחות הניידת, (E ו- F) שורת תאי עכבר הרתי אפיתל, בהתאמה. את התותב (D) מראה באותו תא (חץ) לאחר זריקה של dextran-rhodamine 10kDa (לא חדירה דרך צומת פער). מחדיר ב (ה) ו- (ו) להראות בהעדר העברת צבע בשורת TEC שטופל מראש עם octanol 1 מ"מ (חוסם צומת פער) במשך 10 דקות. בכל לוחות כוכביות לסמן את התאים המוזרקים. (AF) X 200. לשכפל מ ואח 'אלבס. 1995 5. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 3: Communicatio צומת גאפn גדל ב dexamethasone בקו תא עכברוש אפיתל. TEC טופלו 1 dexamethasone מיקרומטר, ותואר צימוד הוערכה על ידי assay העברת צבע צהוב לוציפר. (א) שדות מיקרוסקופים (לעומת שלב קרינה, בהתאמה, ב שמאל לוחות מימין) המתאר את התא שהוחדר ואלה היו מצמידים כאשר LY שהוזרק (320X הגדלה). בכל לוחות כוכביות לסמן את התאים המוזרקים. (ב) Histograms מראה את הדפוס של צימוד שליטה ותאים שטופל dexamethasone. הניתוח כולל של 100 microinjections לכל קבוצה. לשכפל מ אלבס et al., 2000 23. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
| צֶבַע | MW | עירור / פליטה |
| חומצה קרבוקסילית hydroxycoumarin | 206 | 386/488 |
| כחול calcein | 321 | 360/449 |
| 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride | 279 | 358/461 |
| carboxyfluorescein | 376 | 492/517 |
| יודיד ethidium (ברומיד) | 314 | 518/605 |
| לוציפר צהוב CH | 443 | 428/536 |
| פלואוריד אלקסה 488 | 570.5 | 495/519 |
| calcein | 622 | 494/517 |
| יודיד propidium | 414 | 535/617 |
טבלה 1: צבעים המשמשים כיום ניסויים microinjection. כאן,כמה בשימוש צבעים עם משקל מולקולרי ואת גל עירור / פליטה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
כדי לאמת את הנוכחות של צומת הפער בין תאית פונקציונלי, להשתמש באמצעים, אשר קרום חדיר, למרות חדיר ידי ערוצי אינטר נדרשים 16. והעמסה, צבע פלואורסצנטי הראשון להבחין תא אל תא צימוד 22, הוא חדיר בין ממברנות הלא junctional 3 ו הוחלפה ולכן על ידי צבע צהוב לוציפר 15. בשלב זה, כדי למצוא את הבחירה הטובה ביותר בין הסוגים השונים של קליעים נותבים ניאון תלוי בהיקף ותנאי הניסוי. ההליך של טעינת תא עם צבעי ניאון מתיר הערכת מורפולוגיה, פונקציה של תאים בודדים ושיעור הקינטית של העברה בין תאים. יתר על כן, microinjection לצבוע מאפשר הבנה טובה יותר של התפקיד הפיזיולוגי של צומת פער בין תאי 21, 23, מאז מידת גתקשורת ellular קשורה עם מספר התאים יחד.
גורמים מרכזיים הם קריטיים עבור נתוני microinjection קבלה בהצלחה. הומאוסטזיס ויושרת תא רגיל חייבים להישמר, ולכן זמן הזרקה קצר (<1 ים) של צבע ומומחיות טכנית עם microinjection נדרש. גורמי מפתח מקבל החלטה טובה יותר של התמונות שנתפסו הוא בעל מצלמת CCD מקורר, מסנני הקרינה במקום ושימוש מטרת NA גבוהה 14. כמו כן, כמה טיפים יכולים להיות שימושיים כמו: 1) תא כלי תרבות עם רשתות המומלצים לדמיין תא מסוים מוזרק, גם מנות זכוכית תחתונה צריכות לשמש ליישומים מיקרוסקופיה ברזולוציה גבוהה; 2) מומלץ לעשות 10-20 מחטים משך לפני תחילת microinjections; 3) תלוי ההתנגדות של קצה האלקטרודה יכול להיות מועיל מאוד, טעינת micropipette עם הצבע באמצעות קפילריות ידי נגיעת קצה פיפטה לתוך הפתרון לצבוע; 4) אין צורך לטעון את כל הגוף של פיפטה, כמה מיקרוליטר למלא את הקצה ו -2 עד 3 מ"מ מעל הקצה מספיק; 5) להתחיל בניסוי עם עדשה פחות מוגדל ולנסות לראות את הצל של קירות פיפטה. לאחר מכן, להעביר את פיפטה הקרובה ככל האפשר לפני שנוגע התא, לעבור המטרה הגדלה הגבוהה, כגון 40x או יותר; 6) קבוצות מסוימות משתמשות microinjector פנאומטי. הזרקת פניאומטיים היא לא הבחירה הטובה ביותר שכן הוא לא מדויק יכול להזריק כמויות לא ידועות; עם דופק הפרוטוקול יכול להיות אחיד להזריק נפח לצבוע ידוע. בנוסף, מומלץ להזריק לתוך הקרום מעל cytosol בגלל העומק; הזרקה בקרום מעל הגרעין יכול לפגוע בו להשפיע על פיזיולוגית תא. לבסוף, תאים שאינם שטוחים מדי עדיפים על אלה שטוחים.
לסיכום, שיטה זו יעילה ללמוד תקשורת בין תאית על ידי צומת פער אבל צורךמומחיות / ניסיון חומר טוב וציוד לקבל נתונים באיכות גבוהות. אנו מקווים כי למתחילים מאמר ווידאו עזרה זה להבין ולבצע טכניקה זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Lucifer yellow | Sigma | L0259 | |
| Lithium Chloride | Sigma | L4408 | |
| PBS tablets | Sigma | P4417 | |
| RPMI | Sigma | R4130 | |
| Bovine fetal serum | Cultilab | ||
| Trypsin | Sigma | T4799 | |
| vibration-insulated table | Newport | VH3036W-OPT | A vibration-insulated table is needed to protect the experiments from vibration and avoid cell damage |
| Micromanipulator | Narishige | MMO-203 | This equipment allows precision adjustments of the micropipette, which is needed for cell micro injection. |
| Current Generator | Digitimer | DS2 | To produce the dye flow through the micropipette, a current below one nano ampere was given using a current generator with an electrode inside the micropipette or an amplifier which has a capacitance compensation circuit (old electrometer) or current injection functions of new patch clamp amplifiers, and the ground wire submersed in the plate dish. Alternatively, the dye can be injected by a pneumatic microinjector, following the factory recommendations. |
References
- Bennett, M. V., et al. Gap junctions: new tools, new answers, new questions. Neuron. 6 (3), 305-320 (1991).
- Orellana, J. A., Martinez, A. D., Retamal, M. A. Gap junction channels and hemichannels in the CNS: Regulation by signaling molecules. Neuropharmacology. , (2013).
- Peracchia, C. Structural correlates of gap junction permeation. Int Rev Cytol. 66, 81-146 (1980).
- Loewenstein, W. R. Junctional intercellular communication and the control of growth. Biochim Biophys Acta. 560 (1), 1-65 (1979).
- Alves, L. A., et al. Functional gap junctions in thymic epithelial cells are formed by connexin 43. Eur.J Immunol. 25 (2), 431-437 (1995).
- Alves, L. A., et al. Are there functional gap junctions or junctional hemichannels in macrophages? Blood. 88 (1), 328-334 (1996).
- Fonseca, P. C., et al. Characterization of connexin 30.3 and 43 in thymocytes. Immunology letters. 94 (1-2), 65-75 (2004).
- Nihei, O. K., et al. Modulatory effects of cAMP and PKC activation on gap junctional intercellular communication among thymic epithelial cells. BMC Cell Biol. 11, 3 (2010).
- Czyz, J., Szpak, K., Madeja, Z. The role of connexins in prostate cancer promotion and progression. Nat Rev Urol. 9 (5), 274-282 (2012).
- El-Saghir, J. A., El-Habre, E. T., El-Sabban, M. E., Talhouk, R. S. Connexins: a junctional crossroad to breast cancer. Int J Dev Biol. 55 (7-9), 773-780 (2011).
- Cea, L. A., et al. Connexin- and pannexin-based channels in normal skeletal muscles and their possible role in muscle atrophy. J Membr Biol. 245 (8), 423-436 (2012).
- Cotrina, M. L., Nedergaard, M. Brain connexins in demyelinating diseases: therapeutic potential of glial targets. Brain Res. 1487, 61-68 (2012).
- Park, H. an-A., R, S., Khanna, S. avita, Sen, C. handan K. Current Technologies in Single-Cell Microinjection and Application to Study Signal Transduction. Methods in Redox Signaling. , Chapter 10 (2010).
- Abbaci, M., Barberi-Heyob, M., Blondel, W., Guillemin, F., Didelon, J. Advantages and limitations of commonly used methods to assay the molecular permeability of gap junctional intercellular communication. Biotechniques. 45 (1), 33-52 (2008).
- Stewart, W. W. Functional connections between cells as revealed by dye-coupling with a highly fluorescent naphthalimide tracer. Cell. 14 (3), 741-759 (1978).
- Meda, P. Probing the function of connexin channels in primary tissues. Methods. 20 (2), 232-244 (2000).
- Klaunig, J. E., Shi, Y. Assessment of gap junctional intercellular communication. Curr Protoc Toxicol. , Chapter 2 Unit2 17 (2009).
- Hanani, M. Lucifer yellow - an angel rather than the devil. J Cell Mol Med. 16 (1), 22-31 (2012).
- Orci, L., Biochemistry, C. Blockage of Cell-to-Cell Communication within Pancreatic Acini Is Associated with Increased Basal Release of Amylase Materials and Methods Preparation of Acini. Cell. 103 (August), 475-483 (1986).
- Hitomi, M., et al. Differential connexin function enhances self-renewal in glioblastoma. Cell Rep. 11 (7), 1031-1042 (2015).
- Nihei, O. K., Campos de Carvalho,, C, A., Spray, D. C., Savino, W., Alves, L. A. A novel form of cellular communication among thymic epithelial cells: intercellular calcium wave propagation. Am J Physiol Cell Physiol. 285 (5), C1304-C1313 (2003).
- Kanno, Y., Loewenstein, W. R.
- Alves, L. A., Nihei, O. K., Fonseca, P. C., Carvalho, A. C., Savino, W. Gap junction modulation by extracellular signaling molecules: the thymus model. Braz J Med Biol Res. 33 (4), 457-465 (2000).
