Summary
نحن هنا وصف كيفية إجراء حقن مكروي وحيدة الخلية لوسيفر الأصفر لتصور الاتصالات الخلوية عبر الفجوة تقاطعات في الخلايا الحية، وتقديم بعض النصائح المفيدة. ونحن نتوقع أن هذه الورقة سوف تساعد الجميع لتقييم درجة اقتران الخلوية بسبب تقاطعات الفجوة الوظيفية. كل شيء الموصوفة هنا يمكن أن يكون، من حيث المبدأ، وتكييفها لالأصباغ الفلورية الأخرى مع الوزن الجزيئي أقل من 1000 دالتون.
Introduction
تقاطعات الفجوة هي قنوات intercellular التي تسمح للالتواصل بين الخلايا المجاورة 1. هذا التواصل يربط اثنين أو أكثر من الخلايا المجاورة، حيث يساهم كل واحد مع connexon أو hemichannel لتشكيل قناة intercellular. في خلايا الثدييات، ويتم تشكيل connexon ستة connexins، أحادية مع أربعة مجالات الغشاء وC ومحطة N داخل السيتوبلازم 2. تقاطعات الفجوة لا تسمح فقط تدفق الأيونات، رسل الثانية والأيض صغيرة، ولكن تسهم أيضا في العديد من أشكال الاتصالات الخلوية في العديد من العمليات الفسيولوجية، مثل انتقال متشابك، تقلص القلب ونمو الخلايا والتمايز 3، 4، 5، 6، 7، 8. وبالإضافة إلى ذلك ارتبطت تقاطعات الفجوة معالعديد من الأمراض بما فيها السرطان 9، 10، 11 ضمور العضلات، وبعض الأمراض الوراثية والمزيل للأمراض (12).
هذا النوع من الحديث المتبادل intercellular يمكن تقييمها من قبل العديد من الطرق 13، 14، 15، 16. في هذه الورقة، وتبين لنا كيفية إجراء حقن مكروي وحيدة الخلية لوسيفر الأصفر لتصور الاتصالات الخلوية عبر الفجوة تقاطعات في الخلايا الحية. نناقش كيفية تحضير الخلايا وmicropipette، واستخدام وmicromanipulator وحقن لوسيفر الصبغة الصفراء في خط الخلايا الظهارية الغدة الصعترية. عادة، يمكن تحليل هذا الإجراء التجريبي من المتوسط من خلايا مرتبطة إلى الخلية محملة صبغ. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن استخدام هذا الأسلوب مع الأصباغ الفلورية الأخرى مع الوزن الجزيئي أقل من الفجوةتقاطعات قطع وهو ما يقرب من 1000 دالتون.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. إعداد الخلايا
- الحفاظ على الثقافة من خط الغدة الصعترية الخلايا الظهارية (IT76M1) أو خلية لفحصها في حاضنة (37 ° C / 5٪ CO 2).
- غسل الخلايا مع برنامج تلفزيوني 1X (اكرر هذا البند 3X).
- إضافة التربسين إلى الخلايا لمدة 5 دقائق.
- إضافة المتوسطة (مرتين من حجم التربسين المضافة في البند 1.3) مع 10٪ FBS (الجنين المصل البقري) إلى الخلايا مع التربسين وأجهزة الطرد المركزي (800 x ج لمدة 5 دقائق).
- عد الخلايا في عدادة الكريات.
- ضبط كثافة الخلايا وفقا لنوع من الخلايا كما لديها خلايا لتكون على اتصال وثيق مع بعضها البعض للسماح للاقتران. ملاحظة: في حالتنا، كنا 3 × 10 5 خلايا لكل 35 مم طبق بيتري.
2. إعداد Micropipette
- سحب micropipette كما محدد من micropipette الزجاج الشعرية (1.5 مم) إلى 0.2 ميكرومتر النهائي من قطر وذلك لتحقيق مقاومة النهائية من حوالي 30 MΩو "> 17، 18.
ملاحظة: بدلا من ذلك، يمكن شراؤها ماصات الحقن. المقاومة تعتمد على حجم الخلية، على سبيل المثال مقاومة أعلى مسرى مكروي سيكون ضروريا لخلايا عنيبية البنكرياس، على سبيل المثال (100-150 MΩ) 19. وهناك مشكلة مشتركة التي يمكن أن تحدث هي هطول الأمطار لوسيفر حل الأصفر والتي يمكن بعد عرقلة micropipette وقد تتطلب ترشيح مسبق أو الطرد المركزي. قبل الحقن، وينبغي تحليل micropipette تحت المجهر للكشف عن ما إذا كان هناك انسداد أو أي نوع من التعطيل 13. وmicropipette يمكن اختبار عن طريق حقن LY مع طرف micropipette داخل محلول ملحي.
3. اختبار وMicropipette
- إعداد الحل الأصفر لوسيفر (5٪) في 150 مللي مول / لتر LiCI وتحميل micropipette باستخدام حقنة أو عن طريق الردم (وضع فيه LY الحل).
- وضع micropipeتتي على مدى 35 مم طبق بيتري مع الخلايا IT76M1 على محطة العمل حقن مكروي وغمر غيض من micropipette الزجاج في المتوسط الخلية. التركيز على micropipette وإجراء اختبار الصبغة التي تتدفق من خلال تطبيق النبض.
4. وحيد الخلية لوسيفر الأصفر حقن مكروي
- التركيز المجهر الحق فوق طبقة الخلايا باستخدام عالية الموجبة فاي ماغني (40X)، ثم خفض ببطء ماصة للخلايا باستخدام micromanipulator.
- ثقب الخلية المستهدفة عندما غيض قريبة بما فيه الكفاية للمس الغشاء الخلوي، وتطبيق نبض hyperpolarizing صغير لإدخال LY في الخلية. الجهد المطبق سيعتمد على صافي شحنة من صبغ ليتم حقنه. بدلا من ذلك، بعض الأصباغ الأخرى يمكن استخدامها مع هذه التقنية كما هو موضح في الجدول 1.
ملاحظة: من حيث المبدأ أي صبغة ماء مع ميغاواط أقل مما يمكن أن تستخدم 1KDa. ومع ذلك، يمكن أن يكون سعر التحويل تختلف وفقا لوزن وhydrophilicity. بالإضافة إلى ذلك، شيجب تقييم نقل nspecific من الصبغة المستخدمة. - التقاط الصور خلية 3 دقيقة بعد حقن الصبغة أو صنع فيلم صغير مع مرور الوقت المجهري (30 إطارا في الثانية).
ملاحظة: يمكن أن ينظر إلى نهج مماثل في هيتومي وآخرون (2015) 20. لتجنب الاتصال عن طريق الجسور والتواصل (الانقسام غير مكتمل)، وشارك في حقن ديكستران rhodamin (2-10 كيلو دالتون)، الذي لا يمر من خلال تقاطعات الفجوة لكن يمر من خلال الجسور والتواصل وأنواع معينة من nanotubules ينصح كما هو مبين في الشكل 2 .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
استخدمت الغدة الصعترية خط الخلايا الظهارية IT-76MI لتقييم اقتران صبغ من قبل تقاطعات الفجوة كما وصفت هذه الخلايا للتعبير عن تقاطعات الفجوة الوظيفية التي شكلتها connexin 43 21. ويبين الشكل (1) وحقن لوسيفر الأصفر عند تطبيقها في خلية واحدة تحت غيض من ماصة. بعد بضع دقائق، تصبح الخلايا على اتصال الفلورسنت (النجمة) مما يدل على انتشار صبغة الفلورسنت من خلال تقاطعات الفجوة. ويرتبط عدد من الخلايا والوقت لأصبح الفلورسنت مباشرة مع درجة الخلوية بين هذه الخلايا. ويبين الشكل 2 حقن LY في الخلايا الظهارية الغدة الصعترية وإدراج (إدراج د) تظهر شارك في حقن LY ورودامين ديكستران (10KDa). كما هو متوقع LY يمر إلى خلية المجاورة، على الرغم من أن رودامين ديكستران لا بسبب الوزن الجزيئي المرتفع. وبالإضافة إلى ذلك، فإن وجود مانع GJ (إدراج و)، الأوكتانول، المفكرهcked مرور الصبغة في الخلايا المحيطة بها. بدلا من ذلك، يمكن للمرء أن تقييم درجة اقتران خلية معينة أو تأثير أحد الأدوية على وظيفة GJ. ويبين الشكل 3A حقن LY في خلايا TEC مع أو بدون ديكساميثازون. ثم تم حقن 100 خلية، بحضور ديكساميثازون ونسبة 1 أو 2 الخلايا التواصل كانت مشابهة فيما يتعلق السيطرة من دون دواء. ومع ذلك فإن عدد 3 أو 4 خلايا التواصل أعلى بالمقارنة مع السيطرة. لم يكن لوحظ خمس أو 6 خلايا و 7 أو 8 خلايا مع الاتصالات GJ بحضور ديكساميثازون في السيطرة، مما يدل على أن ديكساميثازون زادت درجة اقتران في خلايا TEC.
الشكل 1: لوسيفر حقن الصفراء في خلايا IT-76MI. (أ) micropipette على مقربة من غشاء الخلية. (ب (ج) والنبض اختبار للتحقق ما إذا كان القطب هو حقن الواقع الصبغة. (D) ماصة لمست غشاء الخلية واتهمت مع لوسيفر صبغة صفراء. (E) الخلية تهمة سمحت صبغ لتمرير من خلال تقاطعات الفجوة إلى خمسة على الأقل الخلايا المجاورة (المشار إليها السهام)، X20. F) وأجري تقريب رقمي للسماح التصور أفضل. تشير العلامات النجمية من الخلايا التي وجهت في المرحلة النقيض المجهر (الشكل 1A). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: إبليس حقن الصفراء في الخلايا الظهارية الغدة الصعترية (TEC). على النقيض من مرحلة والفحص المجهري مضان. (A وباء) خلية الإنسان التوتة طلائي. (C و D) الغدة الصعترية ممرضة الخليوي، (E و F) خط خلية فأر التوتة طلائي، على التوالي. إدراج في (D) ويظهر نفس الخلية (السهم) بعد حقن-رودامين ديكستران 10KDa (لا منفذة من خلال تقاطعات الفجوة). يدرج في (E) و (F) وتبين عدم وجود نقل الصبغة في خط TEC قبل المعاملة مع الأوكتانول 1 ملم (فجوة تقاطع مانع) لمدة 10 دقيقة. في كل اللوحات النجمة بمناسبة حقن الخلايا. (AF) X 200. مستنسخة من ألفيس وآخرون. 1995 5. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل (3): الفجوة تقاطع الاتصالات ...ن بنسبة ديكساميثازون في خط الخلايا الظهارية الفئران. وعولج TEC مع 1 ميكرومتر ديكساميثازون، وجرى تقييم درجة اقتران من قبل لوسيفر الأصفر نقل صبغ الفحص. (A) تعني إن الحقل المجهري (المرحلة التباين ومضان، على التوالي، في اليسار ولوحات اليمين) يصور حقن الخلايا وتلك التي يقترن عندما تم حقن LY (320X التكبير). في كل اللوحات النجمة بمناسبة حقن الخلايا. (ب) المدرج الإحصائي تبين نمط من اقتران السيطرة والخلايا المعالجة ديكساميثازون. ويتألف تحليل 100 إبر دقيقة جدا لكل مجموعة. مستنسخة من ألفيس وآخرون، 2000 23. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
| صبغ | ميغاواط | الإثارة / الانبعاث |
| حمض الكربوكسيلية hydroxycoumarin | 206 | 386/488 |
| calcein الأزرق | 321 | 360/449 |
| 4 "، 6 diamidino-2-phenylindole هيدروكلوريد | 279 | 358/461 |
| carboxyfluorescein | 376 | 492/517 |
| إيثيديوم يوديد (بروميد) | 314 | 518/605 |
| لوسيفر الأصفر CH | 443 | 428/536 |
| فلور اليكسا 488 | 570.5 | 495/519 |
| calcein | 622 | 494/517 |
| يوديد propidium | 414 | 535/617 |
الجدول 1: الأصباغ المستخدمة حاليا للتجارب حقن مكروي. هنا في،تستخدم بعض الأصباغ مع الوزن الجزيئي والطول الموجي الإثارة / الانبعاثات.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
من أجل التحقق من وجود وظيفية تقاطع الفجوة بين الخلايا، واستخدام استشفاف، وهي غشاء كتيمة، وإن قابلة للاختراق من قبل قنوات بين الخلايا المطلوبة 16. فلوريسئين، أول صبغة الفلورسنت لمراقبة الخلية الى خلية اقتران 22، غير قابلة للاختراق بين الأغشية غير صلي 3 و لذا فقد تم استبداله من قبل إبليس صبغة صفراء 15. في الوقت الراهن، لنجد أن الخيار الأفضل من بين العديد من أنواع مختلفة من استشفاف الفلورسنت يعتمد على نطاق وظروف التجربة. إجراءات تحميل خلية مع الأصباغ الفلورية يسمح تقييم التشكل، وظيفة الخلايا واحدة ومعدل الحركي نقل بين الخلايا. وعلاوة على ذلك، صبغ حقن مكروي يسمح فهم أفضل لدور الفسيولوجي للتقاطعات الفجوة بين الخلايا 21، 23، حيث أن درجة جيرتبط الاتصالات ellular مع عدد الخلايا إلى جانب.
عدة عوامل رئيسية هي حاسمة للحصول على البيانات بنجاح حقن مكروي. يجب الحفاظ على التوازن الطبيعي الخلية والنزاهة، فقد آن الأوان حقن قصيرة (<1 ثانية) من صبغ والخبرة الفنية مع حقن مكروي هو مطلوب. العوامل الرئيسية في الحصول على أفضل قرار من الصور الملتقطة هو وجود كاميرا CCD المبردة، مرشحات مضان في مكان واستخدام هدفا NA عالية (14). أيضا، يمكن أن تكون بعض النصائح المفيدة على النحو التالي: 1) ينصح أطباق زراعة الخلايا مع شبكات لتصور حقن الخلايا معينة، يجب استخدام أطباق الزجاج السفلي أيضا لتطبيقات المجهر عالية الدقة. 2) فمن المستحسن أن تجعل 10-20 الإبر سحبت قبل البدء إبر دقيقة جدا. 3) اعتمادا على المقاومة من طرف القطب يمكن أن تكون مفيدة جدا، تحميل micropipette مع الصبغة باستخدام الشعرية عن طريق لمس طرف ماصة في محلول الصبغة. 4) أنه ليس من الضروري لتحميل الجسم كله من ماصة، قليلة ميكرولتر لملء طرف و2-3 مم فوق قمة كافية. 5) بدء التجربة مع عدسة مكبرة أقل ونحاول أن نرى ظلال الجدران ماصة. بعد ذلك، نقل ماصة أقرب وقت ممكن، وقبل لمس الخلية، وتحول إلى هدف أعلى التكبير، مثل 40X أو أكثر. 6) بعض الجماعات تستخدم microinjector الهوائية. حقن هوائي ليست الخيار الأفضل لأنها ليست دقيقة، ويمكن ضخ كميات غير معروفة. مع نبض البروتوكول يمكن أن تكون موحدة لحقن يعرف حجم الصبغة. بالإضافة إلى ذلك، فمن المستحسن أن يحقن الغشاء فوق العصارة الخلوية بسبب عمق. الحقن في الغشاء فوق نواة يمكن أن تجرح به وتؤثر فسيولوجيا الخلية. وأخيرا، والخلايا التي ليست مسطحة للغاية هي الأفضل على تلك مسطحة.
وباختصار، هذه الطريقة فعالة لدراسة الاتصالات بين الخلايا من خلال تقاطعات الفجوة ولكن الحاجةالصورة الخبرات / خبرة ومادة جيدة والمعدات للحصول على بيانات عالية الجودة. نأمل أن تكون هذه المادة ومساعدة الفيديو للمبتدئين لفهم وأداء هذه التقنية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Lucifer yellow | Sigma | L0259 | |
| Lithium Chloride | Sigma | L4408 | |
| PBS tablets | Sigma | P4417 | |
| RPMI | Sigma | R4130 | |
| Bovine fetal serum | Cultilab | ||
| Trypsin | Sigma | T4799 | |
| vibration-insulated table | Newport | VH3036W-OPT | A vibration-insulated table is needed to protect the experiments from vibration and avoid cell damage |
| Micromanipulator | Narishige | MMO-203 | This equipment allows precision adjustments of the micropipette, which is needed for cell micro injection. |
| Current Generator | Digitimer | DS2 | To produce the dye flow through the micropipette, a current below one nano ampere was given using a current generator with an electrode inside the micropipette or an amplifier which has a capacitance compensation circuit (old electrometer) or current injection functions of new patch clamp amplifiers, and the ground wire submersed in the plate dish. Alternatively, the dye can be injected by a pneumatic microinjector, following the factory recommendations. |
References
- Bennett, M. V., et al. Gap junctions: new tools, new answers, new questions. Neuron. 6 (3), 305-320 (1991).
- Orellana, J. A., Martinez, A. D., Retamal, M. A. Gap junction channels and hemichannels in the CNS: Regulation by signaling molecules. Neuropharmacology. , (2013).
- Peracchia, C. Structural correlates of gap junction permeation. Int Rev Cytol. 66, 81-146 (1980).
- Loewenstein, W. R. Junctional intercellular communication and the control of growth. Biochim Biophys Acta. 560 (1), 1-65 (1979).
- Alves, L. A., et al. Functional gap junctions in thymic epithelial cells are formed by connexin 43. Eur.J Immunol. 25 (2), 431-437 (1995).
- Alves, L. A., et al. Are there functional gap junctions or junctional hemichannels in macrophages? Blood. 88 (1), 328-334 (1996).
- Fonseca, P. C., et al. Characterization of connexin 30.3 and 43 in thymocytes. Immunology letters. 94 (1-2), 65-75 (2004).
- Nihei, O. K., et al. Modulatory effects of cAMP and PKC activation on gap junctional intercellular communication among thymic epithelial cells. BMC Cell Biol. 11, 3 (2010).
- Czyz, J., Szpak, K., Madeja, Z. The role of connexins in prostate cancer promotion and progression. Nat Rev Urol. 9 (5), 274-282 (2012).
- El-Saghir, J. A., El-Habre, E. T., El-Sabban, M. E., Talhouk, R. S. Connexins: a junctional crossroad to breast cancer. Int J Dev Biol. 55 (7-9), 773-780 (2011).
- Cea, L. A., et al. Connexin- and pannexin-based channels in normal skeletal muscles and their possible role in muscle atrophy. J Membr Biol. 245 (8), 423-436 (2012).
- Cotrina, M. L., Nedergaard, M. Brain connexins in demyelinating diseases: therapeutic potential of glial targets. Brain Res. 1487, 61-68 (2012).
- Park, H. an-A., R, S., Khanna, S. avita, Sen, C. handan K. Current Technologies in Single-Cell Microinjection and Application to Study Signal Transduction. Methods in Redox Signaling. , Chapter 10 (2010).
- Abbaci, M., Barberi-Heyob, M., Blondel, W., Guillemin, F., Didelon, J. Advantages and limitations of commonly used methods to assay the molecular permeability of gap junctional intercellular communication. Biotechniques. 45 (1), 33-52 (2008).
- Stewart, W. W. Functional connections between cells as revealed by dye-coupling with a highly fluorescent naphthalimide tracer. Cell. 14 (3), 741-759 (1978).
- Meda, P. Probing the function of connexin channels in primary tissues. Methods. 20 (2), 232-244 (2000).
- Klaunig, J. E., Shi, Y. Assessment of gap junctional intercellular communication. Curr Protoc Toxicol. , Chapter 2 Unit2 17 (2009).
- Hanani, M. Lucifer yellow - an angel rather than the devil. J Cell Mol Med. 16 (1), 22-31 (2012).
- Orci, L., Biochemistry, C. Blockage of Cell-to-Cell Communication within Pancreatic Acini Is Associated with Increased Basal Release of Amylase Materials and Methods Preparation of Acini. Cell. 103 (August), 475-483 (1986).
- Hitomi, M., et al. Differential connexin function enhances self-renewal in glioblastoma. Cell Rep. 11 (7), 1031-1042 (2015).
- Nihei, O. K., Campos de Carvalho,, C, A., Spray, D. C., Savino, W., Alves, L. A. A novel form of cellular communication among thymic epithelial cells: intercellular calcium wave propagation. Am J Physiol Cell Physiol. 285 (5), C1304-C1313 (2003).
- Kanno, Y., Loewenstein, W. R.
- Alves, L. A., Nihei, O. K., Fonseca, P. C., Carvalho, A. C., Savino, W. Gap junction modulation by extracellular signaling molecules: the thymus model. Braz J Med Biol Res. 33 (4), 457-465 (2000).
