Summary
우리는 살아있는 세포에서 갭 접합을 통해 셀룰러 통신을 시각화 루시퍼 노란색의 단일 세포 미세 주입을 수행하고 몇 가지 유용한 팁을 제공하는 방법을 여기에 대해 설명합니다. 우리는이 논문으로 인해 기능 갭 접합에 세포 결합의 정도를 평가하기 위해 모두 도움이 될 것으로 기대하고있다. 여기에 설명 된 모든 1,000 달톤 이하의 분자량을 가진 다른 형광 염료에 적응 원칙적으로 될 수있다.
Introduction
갭 접합은 인접 셀 1 사이에서 상호 통신을 허용 간 채널입니다. 이 통신은 각각의 채널 간을 형성 connexon 또는 hemichannel에 기여 둘 이상의 이웃 셀을 연결한다. 포유 동물 세포에서, connexon는 세포질 내에서이 네 개의 경막 도메인 및 C 및 N 단자 여섯 코넥 단량체에 의해 형성된다. 간극 연접 만 이온 초 메신저 작은 대사의 흐름을 허용하지만, 또한 시냅스 전달, 심장 수축, 세포 성장과 분화 3, 4, 5, 6 등의 많은 생리적 과정에 셀룰러 통신의 여러 형태에 기여하지 7,8. 또한 갭 접합이와 관련이있다암 9, 10, 11 근위축증 일부 유전 질환 및 질병 12 탈수 초성 질환을 포함하는 많은.
간 크로스 토크의이 유형은 여러 가지 방법으로 13, 14, 15, 16에 의해 평가 될 수있다. 본 논문에서는, 우리는 살아있는 세포에서 갭 접합을 통해 셀룰러 통신을 시각화 루시퍼 노란색의 단일 세포 미세 주입을 수행하는 방법을 보여줍니다. 우리는 셀과 마이크로 피펫의 미세 조작기의 사용과 흉선 상피 세포 라인에 루시퍼 노란색 염료의 주입을 준비하는 방법에 대해 설명합니다. 일반적으로이 실험 절차는 염료와 함께로드 셀에 연결 셀의 평균에 의해 분석 될 수있다. 또한,이 방법은 갭 아래 분자량을 갖는 다른 형광 염료로 사용될 수있다약 1,000 달톤 인 접합 차단.
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Protocol
세포의 1. 준비
- 흉선 상피 세포 라인 (IT76M1) 또는 셀의 문화를 유지하는 것은 인큐베이터에서 테스트하기 (37 ° C / 5 % CO 2).
- PBS 1X와 세포를 씻으 (이 항목에 배를 반복).
- 5 분 동안 세포에 트립신을 추가합니다.
- 트립신 원심 분리 (5 분, 800 XG)와 함께 세포를 10 % FBS (소 태아 혈청)와 (항목 1.3 첨가 트립신 볼륨 회) 배지를 추가한다.
- 혈구의 세포를 계산합니다.
- 세포를 결합 할 수 있도록 서로 밀착 될 필요가 같은 세포 유형에 따른 세포의 농도를 조정. 주 : 우리의 경우는 35mm 배양 접시 당 3 × 105 세포를 사용 하였다.
2. 마이크로 피펫 준비
- 직경의 최종 0.2 μm의 유리 모세관 마이크로 피펫 (1.5 mm 직경)로 지정된 약 30 MΩ의 최종 저항을 달성하도록 마이크로 피펫을 당겨F "> 17, 18.
참고 : 또는 주입 피펫을 구입할 수 있습니다. 저항이 셀 크기에 따라, 예를 들어 높은 저항 미세 예 (100-150 MΩ) 19, 췌장 선포 세포에 필요한 것이다. 발생할 수있는 일반적인 문제는 다음 마이크로 피펫을 방해 할 수 있습니다 전에 여과 또는 원심 분리를 요구할 수있다 루시퍼 노란색 용액의 침전이다. 주입 전에, 마이크로 피펫을 방해 또는 중단 (13)의 임의의 유형이 있는지 감지하는 현미경으로 분석한다. 마이크로 피펫을 식염수 내부 마이크로 피펫 팁 LY 주입함으로써 시험 될 수있다.
3. 테스트하기 마이크로 피펫
- 150 밀리몰 / L LiCl을에서 루시퍼 노란색 용액 (5 %)을 준비하고 주사기를 사용하여 마이크로 피펫을로드하거나 메우기에 의해 (그것을 LY 솔루션에 넣어).
- 마이크로 파이프를 배치마이크로 인젝션 워크 스테이션 IT76M1 세포와 35mm 페트리 접시 위에 TTE 셀 매체에 유리 마이크로 피펫의 팁 잠수함. 마이크로 피펫에 초점 펄스를 적용하여 염료 흐르는 테스트를 수행합니다.
4. 단일 셀 루시퍼 노란색 미세 주입
- 천천히 미세 조작기를 이용하여 세포에 피펫을 낮추고, 오른쪽 높은 그니 인터넷 양이온 (40X)을 사용하여 전지 층 위에 초점 현미경.
- 선단이 세포막을 터치하기에 충분히 근접 할 때 표적 세포 천공 및 세포 내로 LY 소개 작은 hyperpolarizing 펄스를 적용한다. 염료의 순 비용에 따라 달라집니다인가 전압을 주입한다. 표 1에 나타낸 바와 같이 다르게는, 다른 염료는 이러한 기술과 함께 사용될 수있다.
참고 : 원칙적으로 MW있는 모든 친수성 염료 이하 1KDa을 사용할 수있는 것보다. 그러나, 전송 속도는 무게와 친수성에 따라 달라질 수있다. 또한, 유를사용되는 염료의 nspecific 전송이 평가되어야한다. - 셀 이미지를 염료 주입 후 3 분을 캡처 또는 시간 경과 현미경 (초당 30 프레임)으로 작은 영화를 만들.
참고 : 유사한 접근 방식 (2015) 20 히토미 등으로 볼 수있다. 그림 2와 같이 간 교량에 의한 통신 (불완전 유사 분열), 갭 접합을 통과하지만 권장 간 교량 및 nanotubules의 특정 유형을 통과하지 않습니다 rhodamin 덱스 트란 (2에서 10 KDa의에)의 공동 주입을 방지하려면 .
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Representative Results
이 세포는 (43) (21) 넥신에 의해 형성 기능 갭 접합을 표현 설명했다으로 흉선 상피 세포주 IT-76MI는 갭 접합에 의해 염료 커플 링을 평가하는 데 사용되었다. 피펫의 팁 아래 하나의 셀에 적용 할 때 그림 1은 루시퍼 노란색의 주입을 보여줍니다. 몇 분 후, 연결된 셀 갭 정션을 통한 형광 염료의 확산을 나타내는 형광체 (별표)가된다. 세포 및 시간 형광되었다 할 수는 직접 이들 세포 간의 셀룰러 통신의 정도와 관련된다. 도 2는 흉선 상피 세포 LY의 주입 및 삽입 (삽입 d)는 LY 로다 민 및 덱스 트란 (10KDa)의 공동 - 주입을 보여 나타낸다. 예상대로 로다 민 덱스 트란 안 때문에 고 분자량의 수행 있지만 LY는, 인접 셀에 전달합니다. 또한, GJ 차단제의 존재 (삽입 F), 옥탄 올, BLO주변 셀들에 대한 염료의 통로 cked. 대안 적으로, 하나의 특정 셀 또는 GJ의 기능에 대한 약물의 효과의 결합의 정도를 평가할 수있다. 도 3a는 또는 덱사메타손없이 TEC 세포에서 LY의 주입을 보여줍니다. 그런 다음 100 세포 덱사메타손의 존재와 통신하는 하나 또는 두 세포의 비율로 주입 한 것은 약물없이 제어 관련하여 유사 하였다. 제어 비교할 때 통신 3 또는 4 셀의 수는 높았다. 다섯 또는 여섯 세포와 덱사 메사 존의 존재 하에서 GJ 통신 7 또는 8 세포 따라서 덱사메타손은 TEC 세포 결합의 정도를 증가되었음을 나타내는 제어에서 관찰되지 않았다.
그림 1 : IT-76MI 세포에서 루시퍼 노란색 주입. 세포막에 가까운 (A)를 마이크로 피펫. (B (C) 시험 펄스 전극 실제로 염료를 주입되었는지 여부를 검증하기 위해 생성 하였다. (D) 피펫은 세포막을 터치하고 루시퍼 옐로우 염료로 채웠다. (E)가 대전 된 셀 (화살표로 표시) 적어도 다섯 인접 셀 갭 접합을 통해 X20 합격 염료시켰다. F)은 디지털 줌을 더 시각화 할 수 있도록 이루어졌다. 별표 콘트라스트 위상 현미경 (도 1a)에 충전 된 셀을 지적한다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2 : 흉선 상피 세포 (TEC)에서 루시퍼 노란색 주입. 위상 콘트라스트와 형광 현미경. (A B) 인간의 흉선 상피 세포. (C와 D)을 각각 간호사 흉선 세포 (E 및 F) 마우스 흉선 상피 세포주. (D)의 삽입 로다 민 - 덱스 트란 10KDa의 주입 (갭 접합을 통해 투과되지 않음) 후 동일한 셀 (화살표)를 보여줍니다. (E) 및 (F)의 삽입은 TEC 라인 10 분간 옥탄 올 1 ㎜ (갭 정션 차단제)로 사전 처리의 염료 전사의 부재를 나타낸다. 모든 패널에서 별표 주입 된 세포를 표시합니다. 알베스 등의 알에서 재현 (AF) X (200). 1995 년 5. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3 : 갭 접합 communication은 쥐 상피 세포 라인에 덱사메타손 증가했다. TEC는 1 μM 덱사메타손 처리하고, 결합도는 루시퍼 옐로우 염료 전사 분석으로 평가 하였다. (A) 현미경 필드 (좌측 및 우측 패널에 각각 위상차 및 형광) 주입이 셀 LY (배율 320X)를 주입했을 때 결합 된 것과 묘사. 모든 패널에서 별표 주입 된 세포를 표시합니다. (B) 히스토그램 제어 및 덱사메타손 처리 된 세포의 결합 패턴을 도시. 분석은 그룹 당 100 microinjections 구성되어 있습니다. 알베스 등., 2000 (23)에서 재현. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 물든 색 | MW | 여기 / 방출 |
| 하이드 록시 쿠마린 카르 복실 산 | (206) | 488분의 386 |
| 칼 세인 블루 | (321) | 449분의 360 |
| 4 ', 6-diamidino-2-페닐 인돌 염산염 | 279 | 461분의 358 |
| 카르복시 | 376 | 517분의 492 |
| 에티 디움 요오다 이드 (브로마이드) | (314) | 605분의 518 |
| 루시퍼 노란색 CH | 443 | 536분의 428 |
| 알렉사 플루오르 488 | 570.5 | 519분의 495 |
| 칼 세인 | (622) | 517분의 494 |
| 요오드화 프로피 듐 | (414) | 617분의 535 |
표 1 : 염료 현재 마이크로 인젝션 실험에 사용 하였다. 여기에서,일부 분자량 여기 / 발광 파장을 갖는 염료를 사용했다.
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Discussion
간 채널에 의해 투과성 16 요구되지만, 기능적 간 간극 결합의 존재, 불 투과성 멤브레인 추적자의 사용을 확인하기 위해. 형광, 제 형광 염료는 세포 간 결합 (22), 비 접합부 (3) 사이의 막 투과성이므로 루시퍼 옐로우 염료 (15)에 의해 치환 된 관찰. 현재, 형광 추적자의 많은 다른 유형 중에서 최선의 선택 범위와 실험의 조건에 따라 달라집니다 찾을 수 있습니다. 형광 염료 셀 로딩의 과정 형태의 평가, 단셀의 기능과 셀 간의 이동의 운동 속도를 허용한다. 또한, 염료는 마이크로 인젝션 C 정도되므로, 셀 (21), (23) 사이의 갭 정션의 생리적 역할에 대한 이해를 허용ellular 통신 연결된 셀의 개수와 관련이있다.
몇 가지 주요 인자가 성공적으로 미세 주사 된 데이터를 얻기 위해 중요하다. 정상 세포의 항상성 및 무결성 따라서, 짧은 분사 시간 염료 및 미세 주입과 기술 전문 지식 (<1 초) 필요를 유지해야합니다. 캡쳐 된 이미지들의 더 나은 해상도를 얻는데 중요한 인자가 냉각 CCD 카메라 대신에 형광 필터와 높은 NA 대물 렌즈 (14)를 사용하는 데있다. 1) 그리드와 세포 배양 접시는 유리 바닥 요리 고해상도 현미경 응용 프로그램에 사용되어야하는 특정 주입 된 세포를 시각화하는 것이 좋습니다;으로 또한 몇 가지 팁이 도움이 될 수 있습니다 2)는 microinjections를 시작하기 전에 10-20 뽑아 바늘을하는 것이 좋습니다; 3) 염료 용액에 피펫 팁을 터치하여 모세관 현상을 이용한 염료 마이크로 피펫 로딩 매우 유용 할 수있는 전극 팁의 저항에 따라; 4)은 선단이 충분 위에 팁과 2 내지 3 mm를 채우는 몇 ㎕를 피펫의 몸 전체를로드 할 필요가 없다; 5) 이하 확대 렌즈로 실험을 시작하고 피펫 벽의 그림자를 보려고. 그 후, 예컨대 40 배 이상으로, 더 높은 배율의 대물 렌즈로 전환 가능한 셀을 터치하기 전에 가까운 피펫 이동; 6) 일부 그룹은 공기 마이크로 인젝터를 사용합니다. 그것은 정확하지 알려지지 볼륨 주입 수 있으므로 공기 주입 최상의 선택이 아니다; 펄스 프로토콜과 염료의 공지 된 양을 분사하도록 표준화 될 수있다. 또한, 때문에 깊이의 세포질 위의 막에 주입하는 것이 좋습니다; 핵 위의 막에 주입을 손상 및 세포 생리학에 영향을 미칠 수 있습니다. 마지막으로, 너무 평평하지 않은 세포는 평면 사람 이상이 바람직하다.
요약하면,이 방법은 간극 연접하지만 필요에 의해 세포 간 통신을 연구하는 것이 유효하다전문성 / 경험 양호한 재료 및 장비는 고품질의 데이터를 얻었다. 우리는이 문서와 비디오 도움 초보자가 이해하고이 기술을 수행 할 수 있기를 바랍니다.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Lucifer yellow | Sigma | L0259 | |
| Lithium Chloride | Sigma | L4408 | |
| PBS tablets | Sigma | P4417 | |
| RPMI | Sigma | R4130 | |
| Bovine fetal serum | Cultilab | ||
| Trypsin | Sigma | T4799 | |
| vibration-insulated table | Newport | VH3036W-OPT | A vibration-insulated table is needed to protect the experiments from vibration and avoid cell damage |
| Micromanipulator | Narishige | MMO-203 | This equipment allows precision adjustments of the micropipette, which is needed for cell micro injection. |
| Current Generator | Digitimer | DS2 | To produce the dye flow through the micropipette, a current below one nano ampere was given using a current generator with an electrode inside the micropipette or an amplifier which has a capacitance compensation circuit (old electrometer) or current injection functions of new patch clamp amplifiers, and the ground wire submersed in the plate dish. Alternatively, the dye can be injected by a pneumatic microinjector, following the factory recommendations. |
References
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