Summary
Nous décrivons ici comment effectuer une microinjection seule cellule de Lucifer Jaune pour visualiser la communication cellulaire via gap-jonctions dans les cellules vivantes, et de fournir quelques conseils utiles. Nous nous attendons à ce que ce document aidera tout le monde à évaluer le degré de couplage cellulaire en raison de jonctions lacunaires fonctionnels. Tout ce qui est décrit ici pourrait être, en principe, adapté à d'autres colorants fluorescents ayant un poids moléculaire inférieur à 1000 Daltons.
Introduction
Les jonctions lacunaires sont des canaux intercellulaires qui permettent l'intercommunication entre les cellules voisines 1. Cette communication relie deux ou plusieurs cellules voisines, où chacun contribue avec un connexon ou hemichannel pour former le canal intercellulaire. Dans les cellules de mammifères, l'connexon est formé par six connexines, des monomères avec quatre domaines transmembranaires et un C et N terminaux dans le cytoplasme 2. Les jonctions lacunaires permettent non seulement le flux d'ions, les seconds messagers et de petits metabolites, mais contribuent également à de nombreuses formes de communication cellulaire dans de nombreux processus physiologiques, tels que la transmission synaptique, la contraction du coeur, la croissance et la différenciation cellulaire 3, 4, 5, 6, 7, 8. En outre jonctions lacunaires ont été associées àde nombreuses maladies telles que le cancer 9, 10, 11 l' atrophie musculaire, certaines maladies génétiques et des maladies démyélinisantes 12.
Ce type de diaphonie intercellulaire peut être évaluée par plusieurs méthodes 13, 14, 15, 16. Dans cet article, nous montrons comment effectuer une microinjection seule cellule de Lucifer Jaune pour visualiser la communication cellulaire via gap-jonctions dans les cellules vivantes. Nous discutons de la façon de préparer les cellules et la micropipette, l'utilisation du micromanipulateur et l'injection de Lucifer colorant jaune dans une lignée de cellules épithéliales du thymus. En général, cette procédure expérimentale pourrait être analysé par la moyenne des cellules connectées à la cellule chargée avec un colorant. En outre, ce procédé pourrait être utilisé avec d'autres colorants fluorescents ayant un poids moléculaire inférieur à l'écartjonctions de coupure qui est d'environ 1000 daltons.
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Protocol
1. Préparation des cellules
- Maintenir une culture d'une lignée de cellules épithéliales du thymus (IT76M1) ou d'une cellule à tester dans un incubateur (37 ° C / 5% de CO 2).
- Laver les cellules avec du PBS 1x (répéter cet article 3x).
- Ajouter à la trypsine les cellules pendant 5 min.
- Ajouter du milieu (deux fois le volume de la trypsine ajoutée à l'article 1.3) avec 10% de FBS (sérum bovin fœtal) aux cellules avec de la trypsine et de centrifugation (800 g pendant 5 min).
- Compter les cellules dans un hémocytomètre.
- Ajuster la densité des cellules en fonction du type de cellule que les cellules doivent être en contact étroit les uns avec les autres pour permettre le couplage. Remarque: Dans notre cas, nous avons utilisé 3 x 10 5 cellules par 35 mm boîte de Pétri.
2. Micropipette Préparation
- Retirer la micropipette tel que spécifié à partir d'une micropipette capillaire en verre (diamètre 1,5 mm) jusqu'à une valeur finale de 0,2 pm de diamètre de façon à obtenir une résistance finale d'environ 30 MQf "> 17, 18.
NOTE: Alternativement, pipettes d'injection peuvent être achetés. La résistance dépend de la taille des cellules, par exemple , une micro - électrode de la résistance plus élevée serait nécessaire pour les cellules acineuses pancréatiques, par exemple (100-150 MQ) 19. Un problème commun qui pourrait se produire est la précipitation de Lucifer solution jaune qui peut alors obstruer la micropipette et peut nécessiter une filtration ou centrifugation avant. Avant l' injection, la micropipette doit être analysée au microscope pour détecter s'il y a une obstruction ou tout autre type de perturbation 13. La micropipette peut être testé en injectant LY avec la pointe de micropipette dans une solution saline.
3. Test de la Micropipette
- Préparer la solution jaune Lucifer (5%) dans 150 mmol / l de LiCl et charger le micro-pipette à l'aide d'une seringue ou par remblaiement (mis en elle LY solution).
- Placer le microtuyauterieTTE sur 35 mm boîte de Pétri avec les cellules IT76M1 sur le poste de travail de microinjection et plonger la pointe de la micropipette de verre dans le milieu cellulaire. Focus sur la micropipette et effectuer un test de teinture circulant en appliquant une impulsion.
4. unicellulaire jaune Lucifer microinjection
- Concentrez microscope juste au-dessus de la couche de cellules en utilisant un fi cation magni élevée (40X), puis abaissez lentement la pipette pour les cellules en utilisant le micromanipulateur.
- Piquer la cellule cible lorsque la pointe est assez proche de toucher la membrane cellulaire, et d'appliquer une petite impulsion hyperpolarisant pour introduire le LY dans la cellule. La tension appliquée dépendra de la charge nette de colorant pour être injecté. En variante, d'autres colorants peuvent être utilisés avec cette technique, comme indiqué dans le tableau 1.
Remarque: En principe, tout colorant hydrophile ayant un PM inférieur à 1KDa pourrait être utilisé. Toutefois, le taux de transfert peut varier en fonction du poids et de l'hydrophilie. En outre, utransfert nspecific du colorant utilisé doit être évaluée. - Capture d'images de cellules 3 min après l'injection de colorant ou faire un petit film avec la microscopie de laps de temps (30 fps).
NOTE: Une approche similaire pourrait être vu dans Hitomi et al (2015) 20. Afin d' éviter la communication par des ponts intercellulaires (mitose incomplète), un co-injection de rhodamine dextran (de 2 à 10 kDa), qui ne passe pas à travers les jonctions lacunaires , mais passe par des ponts intercellulaires et certains types de nanotubules est recommandé comme représenté sur la figure 2 .
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Representative Results
Lignée de cellules épithéliales thymiques IT-76MI ont été utilisés pour évaluer le couplage de colorant par des jonctions lacunaires que ces cellules ont été décrites pour exprimer des jonctions lacunaires fonctionnels formés par les connexines 43 21. La figure 1 montre l'injection de jaune Lucifer lorsqu'elle est appliquée dans une cellule au-dessous de la pointe de la pipette. Au bout de quelques minutes, les cellules connectées deviennent fluorescentes (astérisques) indiquant la diffusion du colorant fluorescent à travers les jonctions lacunaires. Le nombre de cellules et de temps pour devient fluorescent est directement associé au degré de communication cellulaire entre ces cellules. La figure 2 montre l'injection de LY dans les cellules épithéliales thymiques et les inserts (insert d) montrent la co-injection de LY et rhodamine Dextran (10 kDa). Comme prévu, le LY passe à une cellule voisine, bien que la rhodamine Dextran ne pas en raison de son poids moléculaire élevé. En outre, la présence d'un bloqueur de GJ (insert f), octanol, blocked le passage du colorant aux cellules environnantes. En variante, on peut évaluer le degré de couplage d'une cellule spécifique ou de l'effet d'un médicament sur la fonction GJ. La figure 3A montre l'injection de LY dans les cellules TEC avec ou sans dexaméthasone. Puis 100 cellules ont été injectées en présence de dexaméthasone et le pourcentage de 1 ou 2 cellules communicantes est similaire par rapport au témoin sans médicament. Cependant, le nombre de 3 ou 4 cellules communicantes est plus élevée par rapport à contrôler. Cinq ou 6 cellules et 7 ou 8 cellules avec communication GJ en présence de dexaméthasone n'a pas été observée dans le contrôle, ce qui indique que la dexaméthasone augmente le degré de couplage dans les cellules TEC.
Figure 1: Lucifer injection jaune dans les cellules IT-76MI. (A) La micropipette à proximité de la membrane cellulaire. (B (C) une impulsion de test a été généré afin de vérifier si l'électrode est en fait l' injection du colorant. (D) La pipette a touché la membrane cellulaire et il a été chargé avec Lucifer colorant jaune. (F) La cellule chargée a permis au colorant de passer à travers les jonctions lacunaires à au moins cinq cellules voisines (indiquée par les flèches), X20. F) Un zoom numérique a été fait pour permettre une meilleure visualisation. Les astérisques indiquent les cellules qui ont été chargées dans la microscopie de phase de contraste (figure 1A). S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2: Lucifer injection jaune dans les cellules épithéliales thymiques (TEC). En contraste de phase et par microscopie à fluorescence. (A B) de cellules humaines thymique épithéliale. (C et D) thymique Nurse Cell, (E et F) lignée cellulaire Une souris thymique épithéliale, respectivement. L'insert en (D) montre la même cellule (flèche) après une injection de rhodamine-dextran 10 kDa (non perméable à travers les jonctions gap). Les inserts en (E) et (F) montrent l'absence de transfert de colorant dans la ligne de TEC pré-traitée avec octanol 1 mM (une jonction de blocage de l' écart) pendant 10 min. Dans tous les panneaux astérisques marquent les cellules injectées. (AF) X 200. Reproduit de Alves et al. 1995 5. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 3: Gap jonction communication accrue par la dexaméthasone dans une lignée de cellules épithéliales de rat. TEC ont été traitées avec 1 uM de dexaméthasone, et le degré de couplage a été évaluée par le dosage par transfert de colorant jaune Lucifer. (A) Les champs de microscopie (contraste de phase et fluorescence, respectivement, dans les panneaux gauche et droit) , représentant la cellule injectée et celles qui ont été couplés lors LY a été injecté (grossissement 320X). Dans tous les panneaux astérisques marquent les cellules injectées. (B) histogrammes montrant le schéma de couplage de contrôle et les cellules traitées à la dexaméthasone. L'analyse comprend 100 microinjections par groupe. Reproduit de Alves et al., 2000 23. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
| COLORANT | MW | Excitation / Emission |
| acide carboxylique hydroxycoumarine | 206 | 386/488 |
| bleu calcéine | 321 | 360/449 |
| 4 ', 6-diamidino-2-phénylindole | 279 | 358/461 |
| carboxyfluorescéine | 376 | 492/517 |
| éthidium, l'iodure (bromure) | 314 | 518/605 |
| Lucifer Yellow CH | 443 | 428/536 |
| alexa Fluor 488 | 570,5 | 495/519 |
| calcéine | 622 | 494/517 |
| l'iodure de propidium | 414 | 535/617 |
Tableau 1: Colorants actuellement utilisé pour des expériences de microinjection. Ici,certains ont utilisé des colorants ayant un poids moléculaire et la longueur d'onde d'excitation / émission.
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Discussion
Afin de vérifier la présence de intercellulaire fonctionnelle jonction lacunaire, l'utilisation de traceurs, qui sont membrane imperméable, bien perméable par des canaux intercellulaires sont nécessaires 16. Fluorescéine, le premier colorant fluorescent pour l' observation de cellule à cellule de couplage 22 est perméable entre les membranes non jonctionnels 3 et a par conséquent été remplacé par Lucifer Yellow 15 colorant. Actuellement, pour trouver le meilleur choix parmi les nombreux types différents de traceurs fluorescents dépend de la portée et les conditions de l'expérience. La procédure de chargement des cellules avec des colorants fluorescents permet l'évaluation de la morphologie, la fonction des cellules simples et la vitesse cinétique du transfert entre les cellules. De plus, la micro - injection de colorant permet une meilleure compréhension du rôle physiologique des jonctions communicantes entre les cellules 21, 23, étant donné que le degré de cellular communication est lié au nombre de cellules couplées.
Plusieurs facteurs clés sont essentiels pour obtenir avec succès les données de microinjection. homéostasie cellulaire normale et l'intégrité doivent être maintenus, donc un temps d'injection courte (<1 s) de colorant et de l'expertise technique avec microinjection est nécessaire. Les facteurs clés à obtenir une meilleure résolution des images capturées est d' avoir une caméra CCD refroidie, les filtres de fluorescence en place et l'utilisation d'un objectif NA élevé 14. En outre, quelques conseils peuvent être utiles en tant que: 1) des boîtes de culture cellulaire avec des grilles sont recommandées pour visualiser une cellule injectée particulier, également des plats à fond de verre doivent être utilisées pour les applications de microscopie à haute résolution; 2) il est recommandé de faire 10-20 aiguilles tirées avant de commencer microinjections; 3) en fonction de la résistance de la pointe de l'électrode peut être très utile, le chargement de la micropipette avec le colorant en utilisant la capillarité en touchant la pointe de la pipette dans la solution de colorant; 4) il est nécessaire de charger l'ensemble du corps de la pipette, quelques microlitres pour remplir la pointe et de 2 à 3 mm au-dessus de la pointe est suffisante; 5) commencer l'expérience avec un objectif moins agrandie et essayer de voir l'ombre des murs de pipettes. Ensuite, déplacez la pipette aussi près que possible et avant de toucher la cellule, passer à l'objectif de grossissement plus élevé, comme 40x ou plus; 6) Certains groupes utilisent un micro-injecteur pneumatique. injection pneumatique est pas le meilleur choix car il est pas précis et pourrait injecter des volumes inconnus; avec une impulsion du protocole pourrait être standardisé pour injecter un volume connu de colorant. De plus, il est recommandé d'injecter dans la membrane au-dessus du cytosol à cause de la profondeur; injection dans la membrane au-dessus du noyau pourrait lui nuire et nuire à la physiologie cellulaire. Enfin, les cellules qui ne sont pas trop plat sont préférables à ceux plats.
En résumé, cette méthode est efficace pour étudier la communication intercellulaire par les jonctions lacunaires mais nécessités expertise / expérience et du bon matériel et de l'équipement pour obtenir des données de haute qualité. Nous espérons que cet article et aide vidéo débutants à comprendre et à exécuter cette technique.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Lucifer yellow | Sigma | L0259 | |
| Lithium Chloride | Sigma | L4408 | |
| PBS tablets | Sigma | P4417 | |
| RPMI | Sigma | R4130 | |
| Bovine fetal serum | Cultilab | ||
| Trypsin | Sigma | T4799 | |
| vibration-insulated table | Newport | VH3036W-OPT | A vibration-insulated table is needed to protect the experiments from vibration and avoid cell damage |
| Micromanipulator | Narishige | MMO-203 | This equipment allows precision adjustments of the micropipette, which is needed for cell micro injection. |
| Current Generator | Digitimer | DS2 | To produce the dye flow through the micropipette, a current below one nano ampere was given using a current generator with an electrode inside the micropipette or an amplifier which has a capacitance compensation circuit (old electrometer) or current injection functions of new patch clamp amplifiers, and the ground wire submersed in the plate dish. Alternatively, the dye can be injected by a pneumatic microinjector, following the factory recommendations. |
References
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