Summary
Biz canlı hücrelerin boşluk bağlantıları aracılığıyla hücresel iletişim görselleştirmek için Lucifer Sarı bir tek hücreli mikroenjeksiyon gerçekleştirin ve bazı yararlı ipuçları sağlamak için nasıl burada açıklamak. Biz bu kağıt nedeniyle fonksiyonel gap junction hücresel bağlantı derecesini değerlendirmek için herkese yardımcı olacağını bekliyoruz. Burada tarif edilen her şey 1,000 Dalton altında molekül ağırlığına sahip diğer floresan boyalar için uyarlanmış, ilke olarak, olabilir.
Introduction
Gap junction komşu hücrelerden 1 arasında bağ kurar izin hücrelerarası kanallardır. Bu iletişim, her biri içi kanal oluşturmak üzere bir connexon ya hemichannel katkıda bulunur, iki ya da daha fazla komşu hücreler, bağlanır. Memeli hücrelerinde, connexon sitoplazma 2 içinde dört transmembran ve bir C ve N terminal ile altı connexins monomer oluşturulmuştur. Ara bağlantılar, yalnızca iyonlar, ikinci haberciler ve küçük metabolitlerin akışına izin vermek, ama aynı zamanda sinaptik iletim kalp kasılması, hücre büyümesi ve farklılaşması, 3, 4, 5, 6 gibi birçok fizyolojik işlemlerde, hücresel haberleşme birçok şekilde katkıda 7, 8. Buna ek olarak ara bağlantılar ile ilişkilendirilmiştirkanser 9, 10, müsküler atrofi 11, bazı genetik hastalıklar ve hastalıkların 12 demiyelinizan dahil olmak üzere birçok hastalık.
Arası karışma Bu tür çeşitli yöntemlerle 13, 14, 15, 16 ile değerlendirilebilir. Bu yazıda canlı hücrelerin boşluk bağlantıları aracılığıyla hücresel iletişim görselleştirmek için Lucifer Sarı bir tek hücreli mikroenjeksiyon nasıl gerçekleştirileceğini gösterir. Bu hücreler ve mikropipet, mikromanipülatör kullanımını ve timik epitelial hücre çizgisinde Lucifer sarı boyadan enjeksiyonun hazırlanması için nasıl ele. Genellikle, bu deney prosedürü, boyası yüklendi hücreye bağlanan hücrelerin ortalama analiz edilebilir. Buna ek olarak, bu yöntem, boşluk altında molekül ağırlığına sahip diğer floresan boyalar ile birlikte kullanılabiliryaklaşık 1000 dalton olan kavşak kesme.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Hücrelerin hazırlanması 1.
- Bir timüs epitelyal hücre hattı (IT76M1) ya da hücrenin bir kültür muhafaza bir kuluçka makinesi içinde, test edilecek (37 ° C /% 5 CO2).
- PBS 1x hücreleri yıkayın (bu öğeyi 3x tekrarlayın).
- 5 dakika için bir hücre için tripsin ekleyin.
- tripsin ve santrifüj (5 dakika boyunca 800 x g) ile hücrelerin% 10 FBS (fetal inek serumu) ile (Madde 1.3 ilave tripsin hacminin iki kez) orta ekleyin.
- Bir hemasitometre hücreleri saymak.
- Hücreler kavrama sağlamak için birbirleri ile yakın temas içinde olması gibi hücre tipine göre hücre yoğunluğunu ayarlayın. Not: Bizim durumumuzda, biz 35 mm petri başına 3 x 10 5 hücreler kullanılmaktadır.
2. Mikropipet Hazırlık
- çapında bir son 0.2 um bir cam kılcal mikropipet (1.5 mm çap) için belirtildiği gibi yaklaşık 30 M? nihai direnci elde edecek şekilde mikropipet çekinf "> 17, 18.
NOT: Alternatif olarak, enjeksiyon pipetler satın alınabilir. Dirençli hücre boyutuna bağlıdır, örneğin, daha yüksek bir direnç mikroelektrot örneğin (100-150 MQ) 19 için, pankreas asinar hücreleri için gerekli olacaktır. oluşabilecek yaygın bir sorun daha sonra mikropipet engelleyebilir ve önceki filtrasyon veya santrifüj gerektirebilir Lucifer Sarı çözümün yağış olduğunu. Enjeksiyon öncesinde, mikropipet bir engel veya bozulması 13 her türlü varsa tespit etmek için mikroskop altında analiz edilmelidir. Mikropipet, tuzlu çözelti içinde mikro pipet ile LY enjekte edilmesiyle test edilebilir.
3. Test Mikropipet
- 150 mg / L Lici içinde Lucifer Sarı solüsyonu (% 5) hazırlayın ve bir şırınga kullanılarak mikropipet yüklemek veya dolgu ile (o LY Çözüm koymak).
- micropipe yerleştirinmikroenjeksiyon iş istasyonunda IT76M1 hücreleri ile 35 mm Petri kabı içinde TTE hücre ortama cam mikropipet ucu daldırın. Mikropipet odaklanın ve bir darbe uygulayarak bir boya akan testi uygulayın.
4. Tek hücreli Lucifer Sarı Mikroenjeksiyon
- sonra yavaş yavaş Mikromanipülatör kullanarak hücrelere pipet düşürmek, sağ yüksek Magni fi katyon (40X) kullanılarak hücre katmanının üstüne mikroskop odaklanın.
- ucu hücre zarını dokunmak yeterli yakınken hedef hücreyi delinme ve hücre içine LY tanıtmak için küçük bir hiperpolarizan darbe uygulamak. boyanın net yük bağlıdır uygulanan voltaj enjekte edilecek. Tablo 1 'de gösterildiği gibi, alternatif olarak, bazı diğer boyalar ile birlikte, bu teknik kullanılabilir.
Not: Prensip olarak MW ile herhangi bir hidrofil boya daha az 1KDa kullanılabilir daha. Bununla birlikte, devir hızı ağırlığı ve hidrofilisite göre değişebilir. Buna ek olarak, ukullanılan boyanın nspecific transferi değerlendirilmelidir. - Hücre görüntüleri boya enjekte edildikten sonra 3 dakika Yakalama veya zaman atlamalı mikroskobu (30 fps) ile küçük bir film yapmak.
NOT: Benzer bir yaklaşım (2015) 20 Hitomi ve ark görülebilir. Şekil 2'de gösterildiği gibi, hücreler arası köprü ile iletişimi (eksik mitoz), ara bağlantılar üzerinden geçmesi, ancak önerilir arası köprü ve nanotubules bazı türleri geçer etmez Rodamin dekstran (2 ila 10 KDa), bir ko-enjeksiyon önlemek için .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bu hücreler 43 21 konneksin oluşan fonksiyonel gap junction ifade etmek açıklandığı gibi timik epitel hücre çizgisi IT-76MI gap junction ile boya kaplin değerlendirmek için kullanıldı. pipet ucu altındaki bir hücreye uygulandığında Şekil 1, Lucifer Yellow enjeksiyonunu göstermektedir. Birkaç dakika sonra, bağlanmış hücreler boşluk bağlantıları ile floresan boya difüzyonu gösteren floresan (yıldız) haline gelir. hücre ve zaman şekilde flüoresan hale gelen kadar sayısı doğrudan bu hücreler arasındaki hücresel haberleşme derecesi ile ilişkilidir. Şekil 2, timik epitelial hücrelerinde LY enjeksiyonu ve ek (insert d) LY ve rodamin Dekstran (10kDa) 'nin enjeksiyonu gösterir gösterir. Beklendiği gibi rodamin dekstran çünkü yüksek moleküler ağırlıklı rağmen LY komşu hücreye geçer. Buna ek olarak, GJ engelleyici varlığı (insert f), oktanol, bloÇevre hücrelere boya geçişini cked. Alternatif olarak, bir belirli hücre veya GJ fonksiyonu üzerinde bir ilacın etkisinin bağlantı derecesini değerlendirmek. Şekil 3A veya deksametazon olmadan TEC hücrelerinde LY enjeksiyonu gösterir. Daha sonra 100 hücre deksametazon varlığında ve iletişim 1 ya da 2 hücrelerinin yüzdesi, enjekte edilmiştir ilaçsız kontrol ile ilgili olarak benzer. kontrol grubu ile karşılaştırıldığında, ancak iletişim 3 ya da 4 hücrelerinin sayısı yüksektir. Beş ya da 6 hücre ve deksametazon varlığında GJ iletişim ile 7 ya da 8 hücreleri, böylece deksametazon TEC hücrelerinde bağlama derecesini artırdığını göstermektedir, kontrol gözlenmedi.
Şekil 1: IT-76MI hücrelerinde Lucifer Sarı enjeksiyon. Hücre zarına yakın (A) mikropipet. (B (C) Bir test darbe elektrot aslında boya enjekte olup olmadığını doğrulamak için oluşturulmuştur. (D) pipet hücre zarı dokundu ve Lucifer Sarı boya ile suçlandı. (E) şarj hücresi (oklar ile gösterilen) en az beş komşu hücrelere gap junction ile X20 geçmesine boya sağladı. F) bir dijital zoom daha iyi görselleştirme izin için yapıldı. Yıldız kontrast faz mikroskobu (Şekil 1A) tahsil edildi hücreleri işaret etmektedir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 2: timik epitelial hücreler (TEC) olarak Lucifer Yellow enjeksiyonu. Faz kontrast ve floresan mikroskobu. (A B) İnsan Timik epitel hücresi. (C ve D), sırasıyla Timik Hemşire Celi, (E ve F) fare timik epitelial hücre çizgisi. (D) 'de geçme rodamin-dekstran 10kDa bir enjeksiyon (boşluk bağlantıları yoluyla geçirgen olmayan) sonrasında aynı hücreyi (ok). (E) ve (F) 'de ekler TEC hattı, 10 dakika boyunca, oktanol, 1 mM (bir boşluk birleşim blokeri) ile önceden tedavi edilen boya transferi olmadığını göstermektedir. tüm panellerde asteriskler enjekte hücreleri işaretlemek. Alves ve ark dan çoğaltılmıştır (AF) X 200. 1995 5. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 3: Boşluk kavşak Haberleşmen, bir sıçan epitel hücre çizgisinde deksametason artmıştır. TEC 1 uM deksametazon ile tedavi edilmiştir ve bağlanma derecesi Lucifer Yellow boya transferi testi ile değerlendirildi. (A) Mikroskopi alanlar (sol ve sağ paneller sırasıyla faz kontrast ve floresan,) enjekte hücre ve LY (büyütme 320X) enjekte edildiğinde birleştirildi o tasvir. tüm panellerde asteriskler enjekte hücreleri işaretlemek. (B) Histogramlar kontrol ve deksametazon ile tedavi edilen hücrelerin bağlantı örüntüsünü gösteren. Analiz grubu 100 microinjections oluşmaktadır. Alves ve ark., 2000, 23 çoğaltılmıştır. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
| BOYA | MW | Uyarma / Emisyon |
| hidroksikumarin-karboksilik asit | 206 | 386/488 |
| kalsein mavi | 321 | 360/449 |
| 4 ', 6-diamidino-2-fenilindol dihidroklorür | 279 | 358/461 |
| carboxyfluorescein | 376 | 492/517 |
| Etidyum iyodür (bromür) | 314 | 518/605 |
| Lucifer Sarı CH | 443 | 428/536 |
| alexa fluor 488 | 570,5 | 495/519 |
| kalsein | 622 | 494/517 |
| propidium iyodür | 414 | 535/617 |
Tablo 1: Boyalar anda mikroenjeksiyon deneylerde kullanılır. Burada,moleküler ağırlığı ve uyarım / emisyon dalga boyu boyalar kullanılır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hücrelerarası kanallar tarafından geçirgen 16 gerekmesine rağmen, fonksiyonel hücrelerarası boşluk kavşak varlığını, membran geçirmeyen izleyiciler, kullanımını doğrulamak için. Fluoresein, ilk fluoresan boya hücre-hücre bağlama 22, sigara kavşak zarlar 3 ila geçirgendir ve bu nedenle, Lucifer sarı boya 15 ile ikame edilmiş gözlemlemek. Şu anda, florasan izleyiciler birçok farklı türleri arasında en iyi seçim kapsam ve deney koşullarına bağlıdır bulmak için. floresan boyalar ile birlikte hücre yükleme prosedürü morfolojisinin değerlendirilmesi, tek hücre fonksiyonu ve hücreler arasındaki transfer kinetik hız verir. Ayrıca, boya mikroenjeksiyon C derece, çünkü hücreler 21, 23 arasındaki boşluk, birleşme fizyolojik rolü hakkında daha iyi bir anlayış sağlarellular iletişim bağlanmış hücre sayısı ile ilgilidir.
Birkaç anahtar faktör başarılı mikroenjeksiyon verilerini elde etmek için çok önemlidir. Normal hücre homeostasis ve bütünlük dolayısıyla, kısa enjeksiyon süresi boya ve mikroenjeksiyon ile teknik uzmanlık (<1 sn) tabi tutulmalıdır. Çekilen görüntülerin daha iyi bir çözünürlük elde temel faktörler soğutmalı bir CCD kamera, yerinde floresan filtreleri ve yüksek NA objektif 14 kullanımını yaşıyor. 1) ızgaraları ile hücre kültür yemekleri de cam alt yemekler yüksek çözünürlüklü mikroskopi uygulamaları için kullanılması gereken özel bir enjekte hücre, görselleştirmek için tavsiye edilir;: olarak da, bazı ipuçları yararlı olabilir 2) microinjections başlamadan önce 10-20 çekti iğne yapmak için tavsiye edilir; 3) Boya çözeltisi içine pipet dokunarak kapilariteyi kullanarak boya ile mikropipet yükleme, çok yararlı olabilir elektrot ucu direnci bağlı; 4) Meme, yeterli yukarıda ucu ve 2 ila 3 mm doldurmak için, bir kaç mikrolitresi pipet bütün vücudu yük için gerekli değildir; 5) daha az büyütülmüş lens ile denemeyi başlatmak ve pipet duvarlar gölge görmeye çalışalım. Daha sonra, örneğin 40x veya daha büyük olarak, yüksek büyütme amacı geçmek, mümkün olduğunca ve hücre dokunmadan önce yakın pipet hareket; 6) Bazı gruplar, bir pnömatik mikroenjektör kullanımı. bu kesin değildir ve bilinmeyen hacimleri enjekte edebilir çünkü pnömatik enjeksiyon en iyi seçenek değildir; Bir darbe ile protokol boya bilinen bir hacmi enjekte standardize edilebilir. Ayrıca, çünkü derinlik sitoplazmada yukarıdaki zarına enjekte tavsiye edilir; çekirdekte yukarıdaki zarında bulunan enjeksiyon onu yaralama ve hücre fizyolojisini etkileyebilir. Son olarak, çok düz olmayan hücreler, düz olanlar üzerinde tercih edilir.
Özet olarak, bu yöntem, boşluk bağlantıları, ancak ihtiyacının arası iletişim çalışma etkilidirs uzmanlık / deneyim ve iyi malzeme ve ekipmanları, yüksek kaliteli veri elde etmek. Biz bu makalede ve video yardım başlayanlar anlamak ve bu tekniği gerçekleştirmek için umuyoruz.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Lucifer yellow | Sigma | L0259 | |
| Lithium Chloride | Sigma | L4408 | |
| PBS tablets | Sigma | P4417 | |
| RPMI | Sigma | R4130 | |
| Bovine fetal serum | Cultilab | ||
| Trypsin | Sigma | T4799 | |
| vibration-insulated table | Newport | VH3036W-OPT | A vibration-insulated table is needed to protect the experiments from vibration and avoid cell damage |
| Micromanipulator | Narishige | MMO-203 | This equipment allows precision adjustments of the micropipette, which is needed for cell micro injection. |
| Current Generator | Digitimer | DS2 | To produce the dye flow through the micropipette, a current below one nano ampere was given using a current generator with an electrode inside the micropipette or an amplifier which has a capacitance compensation circuit (old electrometer) or current injection functions of new patch clamp amplifiers, and the ground wire submersed in the plate dish. Alternatively, the dye can be injected by a pneumatic microinjector, following the factory recommendations. |
References
- Bennett, M. V., et al. Gap junctions: new tools, new answers, new questions. Neuron. 6 (3), 305-320 (1991).
- Orellana, J. A., Martinez, A. D., Retamal, M. A. Gap junction channels and hemichannels in the CNS: Regulation by signaling molecules. Neuropharmacology. , (2013).
- Peracchia, C. Structural correlates of gap junction permeation. Int Rev Cytol. 66, 81-146 (1980).
- Loewenstein, W. R. Junctional intercellular communication and the control of growth. Biochim Biophys Acta. 560 (1), 1-65 (1979).
- Alves, L. A., et al. Functional gap junctions in thymic epithelial cells are formed by connexin 43. Eur.J Immunol. 25 (2), 431-437 (1995).
- Alves, L. A., et al. Are there functional gap junctions or junctional hemichannels in macrophages? Blood. 88 (1), 328-334 (1996).
- Fonseca, P. C., et al. Characterization of connexin 30.3 and 43 in thymocytes. Immunology letters. 94 (1-2), 65-75 (2004).
- Nihei, O. K., et al. Modulatory effects of cAMP and PKC activation on gap junctional intercellular communication among thymic epithelial cells. BMC Cell Biol. 11, 3 (2010).
- Czyz, J., Szpak, K., Madeja, Z. The role of connexins in prostate cancer promotion and progression. Nat Rev Urol. 9 (5), 274-282 (2012).
- El-Saghir, J. A., El-Habre, E. T., El-Sabban, M. E., Talhouk, R. S. Connexins: a junctional crossroad to breast cancer. Int J Dev Biol. 55 (7-9), 773-780 (2011).
- Cea, L. A., et al. Connexin- and pannexin-based channels in normal skeletal muscles and their possible role in muscle atrophy. J Membr Biol. 245 (8), 423-436 (2012).
- Cotrina, M. L., Nedergaard, M. Brain connexins in demyelinating diseases: therapeutic potential of glial targets. Brain Res. 1487, 61-68 (2012).
- Park, H. an-A., R, S., Khanna, S. avita, Sen, C. handan K. Current Technologies in Single-Cell Microinjection and Application to Study Signal Transduction. Methods in Redox Signaling. , Chapter 10 (2010).
- Abbaci, M., Barberi-Heyob, M., Blondel, W., Guillemin, F., Didelon, J. Advantages and limitations of commonly used methods to assay the molecular permeability of gap junctional intercellular communication. Biotechniques. 45 (1), 33-52 (2008).
- Stewart, W. W. Functional connections between cells as revealed by dye-coupling with a highly fluorescent naphthalimide tracer. Cell. 14 (3), 741-759 (1978).
- Meda, P. Probing the function of connexin channels in primary tissues. Methods. 20 (2), 232-244 (2000).
- Klaunig, J. E., Shi, Y. Assessment of gap junctional intercellular communication. Curr Protoc Toxicol. , Chapter 2 Unit2 17 (2009).
- Hanani, M. Lucifer yellow - an angel rather than the devil. J Cell Mol Med. 16 (1), 22-31 (2012).
- Orci, L., Biochemistry, C. Blockage of Cell-to-Cell Communication within Pancreatic Acini Is Associated with Increased Basal Release of Amylase Materials and Methods Preparation of Acini. Cell. 103 (August), 475-483 (1986).
- Hitomi, M., et al. Differential connexin function enhances self-renewal in glioblastoma. Cell Rep. 11 (7), 1031-1042 (2015).
- Nihei, O. K., Campos de Carvalho,, C, A., Spray, D. C., Savino, W., Alves, L. A. A novel form of cellular communication among thymic epithelial cells: intercellular calcium wave propagation. Am J Physiol Cell Physiol. 285 (5), C1304-C1313 (2003).
- Kanno, Y., Loewenstein, W. R.
- Alves, L. A., Nihei, O. K., Fonseca, P. C., Carvalho, A. C., Savino, W. Gap junction modulation by extracellular signaling molecules: the thymus model. Braz J Med Biol Res. 33 (4), 457-465 (2000).
