Analysere Protein Dynamics Bruke Hydrogen Exchange-massespektrometri

Summary

Protein konformasjon og dynamikk er nøkkelen til å forstå forholdet mellom protein struktur og funksjon. Hydrogen utveksling kombinert med høy oppløsning massespektrometri er en anvendelig metode for å studere konformasjonsendringer dynamikken i proteiner, så vel som å karakterisere protein-ligand-og protein-protein interaksjoner, herunder kontaktgrensesnitt og allosteriske effekter.

Abstract

Alle cellulære prosesser avhenger av funksjonaliteten til proteiner. Selv om funksjonaliteten til et gitt protein er en direkte følge av den unike aminosyresekvens er det bare realiseres ved folding av polypeptidkjeden til en enkelt definert tredimensjonalt arrangement, eller mer vanlig i et ensemble av innbyrdes omdanning konformasjonen. Gransker sammenheng mellom protein konformasjon og dens funksjon er derfor avgjørende for en fullstendig forståelse av hvordan proteiner er i stand til å oppfylle sitt store utvalg av oppgaver. En mulighet for å studere konformasjonsendringer et protein gjennomgår mens videre gjennom dets funksjonelle syklus er ^hydrogen-1 H / ² H-utveksling i kombinasjon med høyoppløsende massespektrometri (HX-MS). HX-MS er en allsidig og robust metode som gir en ny dimensjon til strukturell informasjon fås ved f.eks krystallografi. Den brukes til å studere protein folding og utfoldelse, binding av små molecule ligander, protein-protein interaksjoner, konformasjonsendringer knyttet til enzymkatalyse, og allostery. I tillegg er HX-MS ofte brukes når mengden av protein er meget begrenset eller krystallisering av proteinet er ikke gjennomførbart. Her gir vi en generell protokoll for å studere protein dynamikk med HX-MS og beskrive som et eksempel hvordan å avsløre samspillet grensesnittet av to proteiner i et kompleks.

Introduction

Antallet krystallstrukturer av proteiner og proteinkomplekser økt raskt de siste årene. De presenterer uvurderlige øyeblikksbilder av den strukturelle organisering av disse proteinene, og gir grunnlag for struktur-funksjonsanalyse. Imidlertid dynamikken i proteiner og de konformasjonsendringer, som er avgjørende for deres funksjoner, er sjelden åpenbart av røntgenkrystallografi. Cryo-elektron, på den annen side, er i stand til å fange protein og proteinkomplekser i forskjellige konformasjoner, men generelt kan ikke løse konformasjonsendringer ned til sekundær struktur nivå ^1. Konformasjonsendring dynamikk proteiner i oppløsning ved atom detaljer kan bare løses ved NMR, men denne metoden er fortsatt begrenset til proteiner i forholdsvis små størrelser (generelt ≤ 30 kDa) og trenger høye konsentrasjoner av proteiner (≥ 100 mm), noe som vanskeliggjør forsøk med oligomerization eller aggregering utsatt proteiner ^to. En metode somer i stand til å bygge bro mellom høy oppløsning røntgenkrystallografi og cryo-elektron og som ikke er begrenset av protein størrelse eller konsentrasjonen er hydrogen ^amid-1 H / ² H-utveksling (HX) i kombinasjon med massespektrometri (MS). Denne metoden har de siste årene utviklet seg til et verdifullt analytisk verktøy for analyse av protein dynamikk, proteinfolding, protein stabilitet og konformasjonsendringer ^3-5. Den molekylære basis for denne metoden er den labile naturen til ryggraden amid-hydrogener i proteiner, som vil utveksler med deuterium-atomer når proteinet er plassert i en _{D-2-O-løsning.} Den påfølgende økning i proteinmassen over tid måles med høy oppløsning MS.

I korte ustrukturerte peptider HX bare er avhengig av temperatur, katalysatorkonsentrasjon (OH ^-, H ₃ O ⁺ dvs. pH, se figur 3) og aminosyre-sidekjeder av tilstøtende rester på grunn av induktiv, kattalytic og steriske effekter. Disse effekter på den iboende kjemiske kursen k _ch er elegant kvantifisert ved Bai et al. ^6. og et program er tilgjengelig (gjengitt med Z. Zhang), som beregner k _ch for hver aminosyre i et polypeptid som er avhengig av pH og temperatur. Ved nøytral pH og temperaturer k _ch er i størrelsesorden av 10 ¹ -10 ³ sek ^-1. I foldede proteiner kan HX være 2-9 størrelsesordener langsommere hovedsakelig på grunn av hydrogenbinding i den sekundære struktur og til en mindre grad på grunn av begrenset tilgang av hydratiserte OH ^– ioner i det indre av en tett foldet protein. HX i native proteiner impliserer derfor delvis eller global utfoldelse, kjemisk utveksling og refolding til den opprinnelige tilstanden i henhold til ligning (1) og observerte valutakurser k _obs avhenger åpning pris k _op, sluttkursen k _cl og den iboende kjemisk utveksling rate k _ch i henhold til ligning (2).

Under innfødte state k _op er mye mindre enn k _lm og kan neglisjeres i nevneren. Det er to ekstreme valutaregimer kalt EX1 og EX2. Hvis k _cl er mye mindre enn k _lm (EX1) den observerte hastighet er praktisk talt lik åpningsfrekvensen og HX tillater umiddelbar observasjon av utfoldelsen av et strukturelt element. En slik utveksling regime, hvor alle amid-protoner veksling med en gang ved åpning av det strukturelle element, er lett observerbar ved MS av en bimodal fordeling av isotopen toppene ^7. Hvis k _cl er mye større enn k _lm (EX2) den observerte hastighet er proporsjonal med k _ch hvorved proporsjonalitetskonstanten er lik brette-utfolding likevekter konstant K _u = k _op </sub> / K _cl. Under disse forholdene, mange åpning og lukking hendelser er nødvendig før all amid protoner bytte for deuterons, som fører til en gradvis økning i gjennomsnittlig masse mens isotoper fordelingen forblir omtrent det samme. Den EX2 regime tillater bestemmelse av den frie energi for utfolding ΔG _u og dermed stabiliteten av et strukturelt element. Under naturlige tilstand tilstand EX2 regimet er mest vanlig. Økning av pH og tillegg av chaotropiske agenter kan skifte utveksling mekanisme for å EX1. Derfor kan HX-MS brukes til å utforske termodynamiske og kinetiske parametre for proteinfolding og konformasjonsendringer.

Som nevnt ovenfor HX er iboende pH-og temperaturavhengig, og vekslingshalveringstiden for et helt løsningsmiddel utsettes proton av ryggraden amidgruppe er mellom 5 til 400 msek ved fysiologisk pH (pH 7,6) og 30 ° C, men 10 min til> 15 timer med et gjennomsnitt på> 2 timer ved pH 2,9 og 0 °C (unntatt for protonet i det første ryggraden amidbinding av et polypeptid, som utveksling med en halveringstid på ca. 1-2 min). Under slike treg utveksle forhold det er mulig å fordøye prøven ved hjelp av proteaser (f.eks pepsin) som er aktive under disse forholdene, uten å miste all informasjon som finnes i de inkorporerte deuterons. Siden introduksjonen av peptisk fordøyelse under forhold med liten utveksling av betingelser, kan ikke bare de samlede HX kinetikken for full-lengde proteiner analyseres men HX kan være lokalisert til spesifikke regioner ^8,9. Romlig oppløsning er for tiden begrenset til størrelsen på peptisk fragmenter genereres, noe som er generelt mellom 10 til 30 rester. Imidlertid kan overlappende fragmenter som er opprettet på grunn av den ikke-spesifikke karakter av spalting av pepsin føre til en økning i romlig oppløsning. I tillegg ble flere andre proteaser funnet å være aktiv etter dempingen forholdene, men mye mindre effektiv enn Pepsin ^10. Videre øktese av romlig oppløsning kan nås med fragmentering av peptider i gassfase ved hjelp av metoder som bevarte den deutereringsgrad mønster som elektron-fangst dissosiasjon (ECD), elektron overføring dissosiasjon (ETD) og infrarød multiphoton dissosiasjon (IRMPD) ^11-13. Disse teknikkene hindre tap av romlig oppløsning på grunn av intramolekylær proton migrasjon ("scrambling"), som er observert av kollisjons-indusert dissosiasjon (CID) er det mest brukte fragmentering teknikken. Men disse metoder krever optimalisering for hver enkelt peptid, og er således fremdeles ganske krevende.

HX-MS ble benyttet for å analysere protein-ligand-og protein-protein interaksjoner blant annet viralt kapsid enheten ^14-17. Protein utfoldelse og refolding samt temperaturinduserte konformasjonsendringer ble undersøkt ^7,18,19. Fosforylering og enkelt aminosyre mutasjon relaterte konformasjonsendringer ^16,20 og nucleotide-induserte endringer ble analysert ^21,22. Derfor synes denne metoden ideelt egnet til å analysere montering og dynamikken i molekylære maskiner. En attraktiv kandidat, hvis mekanismen er av stor allmenn interesse, er det Hsp90 anstand kompleks.

Protocol

En. Forberedelse av buffere og proteinprøver Forbered H 2 O buffer. Bruk Hsp90 standard buffer (40 mM HEPES / KOH, pH 7,5, 50 mM KCl, 5 mM MgCl2, 10% glycerol) i H 2 O buffer. Merk: Hvis prøven ble dialysert før analysen bruker dialyse buffer som H 2 O buffer. Det er viktig at D 2 O buffer er forskjellig fra H 2 O buffer bare i hydrogen isotop. Flyktige buffere som NH 4 CO 3 eller 4-NH-eller…

Representative Results

Hsp90 er en molekylær anstand i gjær og medlem av Hsp90 anstand familien. Ved å gå gjennom en kompleks ATPase syklus det hjelper sene folding trinn av mange protein klienter. Effektiv folding krever overføring av kunder fra Hsp70 og samhandling av co-anstand Sti1/Hop. Sti1 bindes direkte til Hsp90 og letter klient binding ved hemming av Hsp90 sin ATPase-aktivitet. Interaksjon av Hsp90 med Sti1 ble nylig studert ved hjelp av HX-MS 23. Her presenterer representative resultater fra de underliggende eksperim…

Discussion

Binding av en interaksjon partner til et protein som forårsaker uunngåelig forandringer i løsningsmiddel tilgang på bindingsstedet. I tillegg er mange proteiner gjennomgår dynamisk konformasjonsendringer ved binding, noe som påvirker andre deler enn de faktiske bindingsgrensesnittet. HX-MS er en robust metode for å overvåke disse endringene og er selv i stand til å avsløre konformasjonsendringer i proteiner på tidsskalaer som andre metoder ikke kan dekke.

For å kunne utføre HX-M…

Materials

Reagent/Equipment	Company	Catalogue number	Comments (optional)
maXis QTOF	Bruker
nanoAcquity UPLC	Waters Corp.
Shimadzu 10AD-VP	Shimadzu
6-port Valve EPC6W with microelectric actuator	Valco	#EPC6W
Injection valve (manual)	Rheodyne	#7725
Poros AL20 media	Applied Biosystems	#1-6029-06
Poros R2	Applied Biosystems	#1-1118-02
Pepsin	Sigma	#P6887	use fresh pepsin
Microbore (1 mm)	IDEX	#C-128
Microbore (2 mm)	IDEX	#C-130B
Acquity UPLC BEH C8 Column	Waters Corp.	#186002876
Thermomixer	Eppendorf	#5355000.011
Tubing (various diameters)	IDEX
Fittings	IDEX	#PK-110 with PK-100