Summary
タンパク質の立体構造とダイナミクスは、タンパク質の構造と機能の関係を理解するための鍵となります。高分解能質量分析と組み合わせた水素の交換は、タンパク質のコンフォメーションのダイナミクスを研究だけでなく、接触インタフェースおよびアロステリック効果を含むタンパク質 - リガンドとタンパク質 - タンパク質相互作用を特徴付けるための汎用的な方法である。
Abstract
すべての細胞プロセスは、タンパク質の機能に依存します。所与のタンパク質の機能性は、そのユニークなアミノ酸配列の直接的な結果であるが、それは単一の定義された三次元配置またはより一般的には相互変換する立体配座のアンサンブル内にポリペプチド鎖の折り畳みによって実現される。タンパク質の立体構造とその機能との間の接続を調査すると、タンパク質は、タスクの彼らの多種多様を満たすことができる方法を完全に理解するために不可欠である。その機能的なサイクルを進行しながら、タンパク質が受けるコンホメーション変化を研究するための一つの可能性は、高分解能質量分析(HX-MS)と組み合わせた水素を1 H / 2 H交換である。 HX-MSは、 例えば結晶解析によって得られた構造情報に新たな次元を追加して汎用性の高い、堅牢な方法です。これは、小さいモルの結合は、フォールディング及びアンフォールディングタンパク質を研究するために使用されているeculeリガンド、タンパク質 - タンパク質相互作用、触媒作用、およびアロステリック酵素に連結コンホメーション変化。タンパク質の量は非常に限られているまたはタンパク質の結晶化が不可能な場合に加えて、HX-MSは、しばしば使用される。ここでは、HX-MSを用いたタンパク質のダイナミクスを研究するための一般的なプロトコルを提供し、どのように複雑では2つのタンパク質の相互作用界面を明らかにすることを例として説明します。
Introduction
タンパク質およびタンパク質複合体の結晶構造の数は、近年急速に増加した。彼らは、これらのタンパク質の構造組織の貴重なスナップショットを提示し、構造 - 機能分析のための基礎を提供する。しかし、タンパク質のダイナミクスとその機能のために不可欠な立体構造変化は、、めったにX線結晶構造解析によって明らかにされていません。クライオelectronmicroscopyは、一方で、異なる構造タンパク質およびタンパク質複合体を捕捉することができるが、一般的に二次構造レベル1にコンホメーション変化を下に解決できない。原子細部で溶液中のタンパク質のコンフォメーションダイナミックスは、NMRによって解決することができますが、この方法では、まだ比較的小さいサイズ(一般的には≤30 kDa)ののタンパク質に制限されて実験を妨げるタンパク質を高濃度(≥100μM)を、必要とされているオリゴマー化または凝集しやすいタンパク質2。一つの方法は、その高分解能X線結晶学およびクライオelectronmicroscopy間をブリッジすることができ、タンパク質サイズ又は濃度によって限定されないアミド水素1 H / 2質量分析(MS)と組み合わせたH-交換(HX)である。近年では、この方法は、タンパク質のダイナミクス、タンパク質のフォールディング、タンパク質の安定性およびコンフォメーション変化3-5の分析のための貴重な分析ツールを開発しました。この方法の分子的基礎は、タンパク質がD 2 O溶液中に置かれたときに重水素原子と交換するであろうタンパク質中の骨格アミド水素の不安定な性質である。経時的なタンパク質質量のその後の増加は、高分解能MSで測定する。
HXは温度のみに依存する短い非構造化ペプチド、触媒濃度-及び誘導のために隣接する残基のアミノ酸側鎖(OH、H 3 O +、すなわち pHが、 図3を参照)、ネコalyticと立体効果。固有の化学交換速度k CH ONこれらの効果は、エレガントな白ら 6によって定量化されたプログラムは、pHおよび温度に依存してポリペプチド内の各アミノ酸のK CHを算出する(礼儀Z.チャン)、提供されています。中性pH及び周囲温度でのk個のchが 10 1〜10 3秒-1のオーダーである。きつく折り畳まれたタンパク質の内部へのイオン-折り畳まれたタンパク質で、HXは、主に二次構造における水素結合とOHの水和のアクセス制限による軽微な程度に遅くなる大きさの2-9桁です。天然タンパク質中のHXはそのため部分的または全体的な展開、化学交換と式に従って天然の状態にリフォールディングを関与(1)とK OBS開口率kのOP、クロージング率kのCLと真性化学交換に依存して観測された為替レートRAテchの k個の式(2)に従って。
天然の状態条件下のk opは k個のchのよりもはるかに小さく、分母に無視することができる。 EX1とEX2と呼ばれる2の極端な為替制度があります。 k個のclが k chを (EX1)よりもはるかに小さい場合に観察された速度は、開口率と実質的に等しく、HXは、構造要素のアンフォールディングの直接の観察を可能にする。構造的要素の開始時に一度にすべてのアミドプロトン交換は、同位体ピーク7の二峰性の分布によって、MSに容易に観察可能であるような為替制度、。 k個のclが k chをよりはるかに大きい場合には、比例定数は折りたたみ展開均衡に等しいができる(EX2)が観察された速度は、k個のchのに比例する定数K uは k個のオペアンプ CL。同位体分布がほぼ同じままであるこれらの条件下では、多くの開閉イベントは、平均質量が徐々に増加をもたらす、重陽子のすべてのアミドプロトン交換前に必要である。 EX2体制はΔGUアンフォールディングの自由エネルギーと構造要素の、したがって安定性の決定を可能にする。ネイティブ状態の条件の下でEX2政権が最も一般的である。 pHとカオトロピック剤の添加の増加は、EX1に交換メカニズムをシフトすることができます。したがって、HX-MSは、熱力学ならびにタンパク質フォールディングの動力学的パラメーターおよびコンフォメーション変化を探索するために使用することができる。
HX上述したように本質的になる骨格アミド基の完全に露出したプロトン溶媒のpHおよび温度依存性の交換半減期は、生理的pH(pH7.6)中で5〜400ミリ秒、および30℃、しかし10分の間である> pHは2.9と0℃で> 2時間の平均は15時間( およその半減期との交流ポリペプチドの最初の骨格アミド結合、1〜2分間のプロトンを除く)C。そのような遅い交換条件下ではタイムアウトが組み込ま重陽子に含まれるすべての情報を失うことに、これらの条件下で活性であるプロテアーゼ( 例えばペプシン)を用いて試料を消化することができる。遅い交換の条件でペプシン消化の導入以来、完全長タンパク質の全体的なHX速度のみならず、解析することができますが、HXは特定の領域8,9に局在することができます。空間分解能は、現在、10〜30残基の間、一般的に消化され生成されたフラグメントの大きさに制限される。しかし、ペプシンによって起因する切断の非特異的な性質のために作成された重複フラグメントは、空間分解能の増加につながる可能性があります。さらに、いくつかの他のプロテアーゼしかしながら、はるかに効率的な10ペプシンより、急冷条件下で活性であることが判明した。さらにincrea空間分解能のそれは、例えば、電子捕獲解離(ECD)、電子移動解離(ETD)と、赤外多光子解離(IRMPD)11-13として重水素化パターンを保存方法によって、気相中のペプチドの断片化によって到達することができる。これらの技術は、衝突誘起解離(CID)によって観察された分子内プロトン移動(「スクランブル」)、最も一般的に使用される断片化法に空間分解能の損失を防ぐ。しかし、これらの方法は、すべての個々のペプチドについての最適化を必要とし、したがって、依然として非常に困難である。
HX-MSは、ウイルスキャプシドアセンブリ14-17を含むタンパク質-リガンドとタンパク質-タンパク質相互作用を分析するために使用されている。タンパク質がアンフォールディングおよびリフォールディングだけでなく、温度が誘発されるコンフォメーション変化は、7,18,19を調査した。リン酸化と、単一のアミノ酸変異に関連したコンホメーション変化16,20とnucleotアミド誘導変化は21,22を分析した。したがって、この方法は、アセンブリおよび分子機械の動力学を分析するために理想的に好適と思われる。そのメカニズム大将軍興味深い1つの魅力的な候補者は、Hsp90のシャペロン複合体である。
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Protocol
1。バッファーおよびタンパク質サンプルの調製
- H 2 Oのバッファを準備します。 H 2 OバッファとしてのHsp90標準緩衝液(40mMのHEPES / KOH、pH7.5で、50mMのKCl、5mMのMgCl 2、10%グリセロール)の使用。
注 :サンプルは、分析の前に透析した場合、H 2 Oのバッファとして透析緩衝液を使用しています。それは、D 2 Oのバッファのみ水素同位体中のH 2 Oバッファと異なっていることが不可欠です。 NH 4 CO 3又はNH 4 -アセテートまたはバッファーの構成要素のような揮発性のバッファが適切ではない! - 真空濃縮器を用いたHsp90標準緩衝液の凍結乾燥により、D 2 Oのバッファを準備します。 H 2 Oを完全に蒸発させた後、初期の全体積( 例えば、1〜850μlのD 2 Oの添加を必要とし、15%グリセロール緩衝液ミリリットル)に達するまでチューブに純粋なD 2 Oを加える。バッファの完全な蒸発を繰り返し、バッファ/塩COMを再溶解D 2 O 2X内ponents。
- クエンチバッファーを準備します(0.4M KH 2 PO 4 / H 3 PO 4 pHは2.2)。
注 :4 M塩酸グアニジンおよび0.5 Mトリス(2 -カルボキシエチル)ホスフィン(TCEP塩酸)を添加することができる非常に安定なタンパク質のペプシン消化物の効率を改善する。 - 100%の対照サンプル(6 M塩酸グアニジン、D 2 O)を調製する。完全に試料からH 2 Oを蒸発させ、10%グリセロールとの最初の合計体積( 例えば 、100μlのサンプルに到達するためにチューブにD 2 Oを追加6 M.の最終濃度に達するようにするHsp90アリコートに塩酸グアニジンを追加添加を必要とする90μlのD 2 O)の。バッファの完全な蒸発を繰り返しとD 2 Oのバッファ/塩成分を再溶解
注意 :サンプルの20〜100 pmolの各注射のために必要とされる。 HX-MS実験の日々のために100%のコントロールを持ってするのに十分なサンプルを準備します。 - 5μLのHsp90標準バッファに50ピコモルのHsp90を準備します。
注意 :サンプルの20〜100 pmolの量は、生データの各ポイントに必要です。反応中の試料の量は、理想的には1〜5μLです。これらの要件に合わせて濃度を調整します。任意の緩衝剤は、それが洗剤または揮発性成分を含んでいないとして使用することができる。
2。アルデヒド活性化ビーズ上に固定化ペプシンの調製
- 2ミリリットルの50mMクエン酸ナトリウム(pHは5)に80mgの新鮮なペプシンを溶解する。
- 、シアノ水素化ホウ素ナトリウム20mgを溶解する1ミリリットルの2MのNa 2 SO 4でのケア( 非常に毒性が強い !)で処理し、ペプシン溶液に加える。
- 穏やかに( 例えば、オーバーヘッドシェーカー)を攪拌しながら室温で10分間混合物をインキュベートする。
- 混合物に固定化されたアルデヒド基を有する600mgのビーズを添加し、室温で5〜10分間インキュベートする。
- SO 2のNa 2の2.2ミリリットルを追加します。4100μlのアリコート中(pHが5)3分毎に1時間以上、ゆっくりペプシンを塩に。そっと室温でオーバーヘッドシェーカーに追加間のサンプルをミックス。
- オーバーヘッドシェーカー中で一晩14〜16時/ 4℃でペプシンビーズをインキュベートする。
- 2時間室温で1ミリリットルの1Mエタノールアミンおよびインキュベーションを加えることにより反応を停止さ。
- 、500 rpmで50ミリリットルファルコンチューブ内のビーズをスピンダウンし、上清を廃棄し、0.1%ギ酸中でビーズを懸濁します。このステップの2倍を繰り返します。最後の遠心分離工程の後、上清およびビーズの推定体積を捨てる。 0.1%ギ酸の当量を添加し、4℃で保存し
3。アミド水素交換用カラムの作製
- 列をトラップすると、ペプシン列の2ミリメートルと1ミリメートルの内径のガードカラムを使用してください。
- ガードカラムの片側を外し、フィルターを取り外します。しっかり表示Funn梱包ネジ列の開放端の上にEL。塔の底部出口に空のシリンジ(5ミリリットル)を添付し、1/16インチのアダプターとチューブを使用してください。ガードカラムに気密それを修正してください。
- 漏斗の上にスラリービーズ材料を数滴を適用する。ガードカラムに漏斗でスラリーを吸引するシリンジのプランジャを引く。漏斗の上に、よりスラリービーズ材料を適用し、ガードカラムが完全にビーズ材料で満たされるまでの手順を続けます。漏斗を取り外し、開放端にフィルター、フィルターリングを配置。しっかりとガードカラムにカラム·スクリューキャップと反対側からシリンジを取り外します。カラム材料から乾燥を避けるためにプラグでガードカラムの両端を閉じる。
4。水素交換質量分析(HX-MS)のためのシステムの設定
- HPLCシステムでトラップカラム( 図1)を接続します。の流量を設定することにより、カラムを平衡化溶媒として0.1%ギ酸を0.4ミリリットル/分でポンプ。まだペプシン列や分析カラムを接続しないでください。
- 質量分析計を較正し、質量分析計のソースにHPLCの出口を接続する。
5。為替のダイナミックレンジの決定
- 超純溶媒A(水中0.1%ギ酸)、超純溶媒B(アセトニトリル中0.1%ギ酸)を調製し、レディーミクスト溶媒市販されている。 HPLCポンプをパージします。短い脱塩工程の後に段階勾配を使用してプログラムを選択することで、クロマトグラフィーおよび制御ソフトウェアにおける質量分析法を設定します。フルレングスのHsp90 5%に溶出するために脱塩/ LOADおよび90%の溶媒A/10%溶媒Bから段階的勾配から溶媒A/95%の溶媒を6ポートバルブを切り替えることで、その後1〜2分の脱塩工程を使用B.は、注入前/積載位置を脱塩するためにロードするために噴射弁および6ポートバルブを設定します。
ノートこの実験中にペプシンや分析カラムを使用しないでください。 - 1月10日μlのH 2 OバッファにHsp90の100〜200 pmolのを準備し、30℃で10分間インキュベート100μLまでのサンプル量を持参し、一定の期間( 例えば 10秒、100秒、千秒)のために、正確にインキュベートし、温度調整のD 2 Oのバッファを追加します。 100μlのクエンチ緩衝液を添加し、上下にピペッティングにより混和する。ハミルトンシリンジを有する噴射弁の噴射口に200μlのサンプルを注入する。ー·プログラムを開始して、インジェクトの位置に注入バルブを切り替える。 2分後に溶出するために脱塩/ LOADINGから6ポートバルブを切り替える。少なくとも3の時点でこれを繰り返します。
- 手順を繰り返しますが、5.2は以前の30℃で10分間インキュベートしたHsp90サンプルにSTI1の2〜3倍の過剰を追加
- 質量分析ソフトウェアでスペクトルのデコンボリューションにより全長タンパク質の質量を決定。 incorporatの数を計算し各実行( 例えば 、10秒、100秒、千秒)後に観察された質量との完全長Hsp90の分子量を比較することによって、重陽子を編
- 非存在と時間(x軸)対STI1(y軸)の存在下でのHsp90のため援用重陽子をプロットする。両方の曲線間の差が最大であるダイナミックレンジの時点を決定します。ペプチドレベルでのHsp90-STI1インターフェイスとダイナミクスを識別するとき、D 2 O中のインキュベーション時間のためにこの値を使用します。
6。 MS / MSスペクトルを用いて消化ペプチドの定量
- システムにペプシンカラムと分析カラムを接続します。
- グラデーションの種類及び質量分析法を選択することによって、制御ソフトウェアにおけるクロマトグラフィーおよび質量分析のためのパラメータを設定する。良いクロマトグラフの解像度を確保するために長い勾配( 例えば 90以上の分)を選択します。質量分析計でのMS / MSスペクトルを有効にします。
注:良い分解能HPLCおよび高い質量精度へのTiONは、このステップで最も高い優先度を持っている。 - 100μlのH 2 OバッファにHsp90の100〜200 pmolのを準備します。 100μlのクエンチ緩衝液を添加し、上下にピペッティングにより混和する。ハミルトンシリンジを有する噴射弁の噴射口に200μlのサンプルを注入する。ー·プログラムを開始して、インジェクトの位置に注入バルブを切り替える。 2分の位置に溶出するために脱塩/ LOADINGから6ポートバルブを切り替えた後。
注 :複数のタンパク質が、HX-MS( すなわち、タンパク質-タンパク質相互作用インターフェース)で分析する場合には各タンパク質のペプチドは、個別に決定されなければならない。 - 得られたペプチドのデータベース( すなわちマスコット)を検索することによって、Hsp90の消化性ペプチドを同定する。
注 :目的は、できるだけ多くの消化性ペプチドを決定することであると分析は、精製タンパク質を用いて行われているようにこれは、カスタム·データベースを使用することが可能である。サンプル純度意志H考慮すべきaveは。 - MS / MSせずに、実際のHX実験に使用される勾配で、この手順を繰り返します。 Hsp90はとSTI1は45%で、溶媒A/55%溶媒Bに90%の溶媒A/10%溶媒Bから10分間の勾配を使用してください
注意 :グラデーションは通常の間5〜15分間であり、高度にサンプルの複雑さおよびHXシステムの仕様に依存します。 - 6.5で使用するグラデーションで6.4で識別された消化性ペプチドの保持時間を決定し、1を含むリストを作成してください。)ペプチド配列2)のペプチド電荷状態と3。)保持時間。これはHX実験後に各ペプチドを識別するために使用されます。
注意 :小のm / zの違い、同一の電荷状態と同一の保持時間を有するペプチドは、曖昧さの原因となる可能性があることに注意してください。
7。タンパク質 - タンパク質相互作用界面の同定
- 制御softwarを勾配と質量分析法を設定E。のほとんどが、300〜1,500のm / zの間の質量の検出のために最適化されている質量分析法を読み込み溶媒A/55%溶媒Bでの45%と90%溶媒A/10%溶媒Bの10分間の直線勾配を使用しペプチドは、千メートル/ zの下になります。負荷位置、ロード/脱塩位置に6ポートバルブへの注入バルブを設定します。 0.4ミリリットル/分に装填ポンプの流量を設定する。
注意 :長さやグラデーションの種類は、サンプルに依存しており、最適化されなければならないことがある。長い勾配はクロマトグラフィの分解能を向上させることが、バック交換をする予定蛋白質に重陽子の取り込みを減少させる。選択された方法は、比較される全ての実験で同じである必要がある。 - 未交換の参考のために100μlのH 2 OバッファにHsp90の20〜100 pmolのを準備します。二回ピペット上下に、100μLの氷冷クエンチバッファーを添加し、HPLCの注入バルブに試料を注入する。すぐにクロマトグラフィー·プログラムとSWを開始INJECT位置に噴射弁かゆみ。 2分の位置に溶出するために脱塩/ LOADINGから6ポートバルブを切り替えた後。個別タンパク質の混合物のためのHsp90とSTI1のためにこれを行う。
- 1-5μLの容量でHsp90の20〜100 pmolのを準備します。 100μlにサンプル量を表示し、一定の期間のために、正確にインキュベート2 Oバッファに温度調整され、Dを追加します( 例:30秒; ノートを参照してコンフォメーションダイナミックスの場合)。氷のように冷たいクエンチ緩衝液100μl、ピペットアップを追加し、上下二回、迅速に、HPLCの注入バルブに200μLを注入。すぐにクロマトグラフィー·プログラムを開始し、噴射位置に注入バルブを切り替える。 2分の位置に溶出するために脱塩/ LOADINGから6ポートバルブを切り替えた後。相互作用するタンパク質の非存在下での各ペプチドへの重陽子の取り込みを決定するために、個々のタンパク質のためにこれを行います。
注意 :準拠した形のダイナミクスを研究するときmational変化、D 2 OバッファにHsp90の異なるインキュベーション時間で実験を繰り返す。 ( 例えば 、10秒、30秒、100秒、300秒、千秒など ) を対数的にインキュベーション時間を選択することで、広いタイムスケールをカバーしよう。 D 2 Oバッファとサンプル·バッファは、水素同位体を除いて、正確に同じでなければなりません。 - 100%のコントロールサンプル(20〜100ピコモル)を同量を用意し、100μlまでのサンプル量をもたらすためにD 2 Oバッファを追加します。氷のように冷たいクエンチ緩衝液100μl、ピペットアップを追加し、上下二回、迅速に、HPLCの注入バルブに200μLを注入。すぐにクロマトグラフィー·プログラムを開始し、噴射位置に注入バルブを切り替える。 2分の位置に溶出するために脱塩/ LOADINGから6ポートバルブを切り替えた後。
- 相互作用面を決定するため( 注 )束縛状態に平衡を移動し、インキュベートするSTI1の少なくとも2倍過剰のHsp90を混ぜる所望の温度での複合体形成は、平衡状態になるまで。温度調整Dの100μlにサンプル量を表示し、一定の期間のために、正確にインキュベート2 Oバッファ( 例えば 30秒)を追加します。氷のように冷たいクエンチ緩衝液100μl、ピペットアップを追加し、上下二回、迅速に、HPLCの注入バルブに注入。 2分の位置に溶出するために脱塩/ LOADINGから6ポートバルブを切り替えた後。 20〜100 STI1のピコモルとHsp90の過剰のこの実験を繰り返します。
注意 :絶対濃度は、相互作用の解離平衡定数に依存します。理想的には、D 2 Oへの希釈後のタンパク質の濃度が(下限濃縮タンパク質の> 85%に相当する)は、少なくとも10倍のK Dであるべきで過剰に添加した。 - 適切なソフトウェアで取得したデータを分析し、分析の各ペプチドを発見するために、ステップ6.5で決定された保持時間を使用しています。 CalculaTE未交換タンパク質(ステップ7.2)用およびHX実験(ステップ7.3)のための同位体分布の重心。
注意 :交換されたペプチドの同位体パターンは、ペプチドの電荷状態についての知識と重心の容易な決定を可能にする質量分析装置の高い質量精度の両方、彼らの未交換の対応が異なって見える場合があるが。 - 単独および結合パートナー過剰の標的タンパク質の重陽子の取り込みを比較してください。これはスプレッドシートプログラムで自動的に商用ソフトウェアにあるか、手動で行うことができます。 100%の対照サンプルの値は、各ペプチドの最大の交換を表し、O標識による逆交換し、実験中に失わD 2の量を決定するために使用することができる。
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Representative Results
Hsp90は、酵母およびHSP90シャペロンファミリーのメンバーの分子シャペロンである。複雑なATPアーゼサイクルを経由することにより、多くのタンパク質のクライアントの後期折りたたみステップを支援します。効率的な折りたたみのHsp70のクライアントからの移転と共同シャペロンSti1/Hopの相互作用を必要とする。 STI1は直接のHsp90に結合したHsp90のATPase活性の阻害によって結合クライアントを容易にします。 STI1とHsp90の相互作用は、最近、HX-MS 23を用いて検討した。ここでは、上記のプロトコルに従って、基礎となる実験の代表的な結果を提示する。
直接的なタンパク質-タンパク質相互作用は、D 2 Oと平衡状態にあるタンパク質複合体を標識し、Hsp90.The得られた差分値プロットの非存在下および存在下でSTI1ペプチドのスペクトルを比較する図5A(23からのデータ)に見ることができることにより試験した。ペプチドは、N末端から始まる上から下に向かって配向されている。主にペプチド中これらの領域はHsp90と相互作用することを示し、 - TPR2aとTPR2bは、(D-Hsp90は D +のHsp90に負の値)Hsp90の存在下で強力な保護を示しています。 TPR2aでの保護は簡単にHsp90のC末端MEEVDモチーフ( 図5B)を表すペプチドとの複合体中のSTI1-TPR2a-TPR2bの結晶構造から合理化することができます。タンパク質 - タンパク質相互作用におけるこのような明確な保護は、常に観察されない。 STI1の存在下でのHsp90での保護は、STI1( 図5Cおよび5D)のように局所的なほど顕著ではないではありません。すべてのペプチドは、STI1の存在下での重陽子の取り込みからわずかに増加した保護を示しています。タンパク質のリージョンがSTI1の存在下でより多くの柔軟性を示していないようSTI1は明らかに世界的にHsp90のを安定化させる。この減少した重陽子取り込みはSTI1またはコンフォメーションに対するアロステリック効果によって直接的な相互作用に由来する場合、我々は、しかし、区別することはできませんHsp90の。得られた情報は、いくつかのペプチド(NBDの例えば 、ペプチド43-62)に推定される相互作用部位を低減します。このような架橋のような追加実験は、一般的にHX-MS後の23結合部位を確認するために使用される。 Hsp90は、STI1複合体を測定する場合に注目すべきは、Hsp90の配列カバー率が低下する。 STI1が3.5倍過剰に添加されて以来、分析中のペプチドの理論的、全体的な量は、いくつかの一人でHsp90と比べて四重高かった。これは、分析中のHsp90ペプチドを曇らせるまたは重複STI1ペプチドのリスクを増大させる。高いシーケンスカバー率より良いクロマトグラフ分離を最適化するには、最も有望なアプローチであると思われる。
異なるタンパク質の領域のダイナミクスを研究するための一つの可能性は、連続的な標識HX-MSの使用である。これは、異なる期間D 2 O中で平衡化したタンパク質試料をインキュベートすることを含むことができ、したがって、の安定性についての予測個々のタンパク質のセグメント。 図6は、STI1の3.5倍過剰の存在下および非存在下でHsp90のNBD由来のペプチド43-62のスペクトルを示す。インキュベーション時間は、広い時間ウインドウにわたって良好なカバレッジを得るために対数目盛(10秒、100秒、1000秒)に選ばれました。ペプチドスペクトルは、より長いインキュベーション時間を増加させるためのタンパク質への重水素の取り込みの時間依存性を示す。ペプチド43-62交換がEX2メカニズムのk INT << K CLに従います。最長時点での短いインキュベーション時間に大きな違いを示すインキュベーション時間全体にわたって保護変化し、ほぼ同様の為替相場の程度。これは低い程度の安定化や頻繁な解離と再会合を持つ動的な相互作用の領域を示唆している。観察された保護がペプチドまたは有効なアミドプロトンの全体的な減少、為替レートによるもののいずれかが1または2に割り当てることができますSTI1の存在下で、よりゆっくりと交換する特定のアミドプロトン。この場合、後者ははるかに可能性のHsp90結晶構造として公開されたループではなく、α-へリックスやβシートのような正規の二次構造であることが、この領域を明らかにしている。
なお、バック交換が観察された効果が100%コントロールに正規化された一回より顕著になることを意味示されたデータから差し引かれていないことを言及することが重要である。
図1。 HX-MS用のHPLCセットアップ。 A)HX-MSの典型的な構成を設定。異なる色の領域が異なる温度に維持セクションを表す。サンプルは、(LOADモードにおいて、シアン)噴射弁の試料ループに注入し、「モードを注入」(黒)に切替弁を介して圧送された後に6ポートバルブへのペプシン列。ペプシンカラムをペプシンの酵素活性を改善するために、10℃でほぼ維持される。 6ポートバルブは、2つのモード、「ロード/脱塩モード」と「溶出モード」(Bを参照)。試料の脱塩後のペプチドは、クロマトグラフィー分析用逆相カラムで、アセトニトリル勾配で分離されている。次いで、ペプチドをESI源を有する質量分析計に噴霧される。6ポートバルブのb)のモード。直接HX後の6ポートバルブはトラップする「ロード/脱塩位置」トラップカラム上消化性ペプチドである。これは、質量分析に干渉する可能性反応緩衝液の任意の塩又は化合物を除去するまで3分間継続する。この後、「溶離モード」に6ポートバルブスイッチは、勾配ポンプと分析カラムの間の流路に装填トラップカラムを置く。トラップされた消化性ペプチドは、今トラップcoluから溶出Mnおよびアセトニトリル中0.1%ギacid/0.1%ギ酸の勾配で分離になる。
図2。 HX実験のスキームを流れ 。 1)標的タンパク質は、界面活性剤なしで精製され、標準的な緩衝液中に供給される。 2)タンパク質は、酵素ペプシンで消化し、消化ペプチドはタンデム質量分析(MS / MS)によって同定し、特徴づけられる。配列のみを取得した後、可能な限りHX-MSが正常に実行されるように多くのペプチドの状態および保持時間充電してください。 3)実験条件は、特定の条件(温度やpHのリガンド/化学化合物またはシフトの追加の下で、このようなタンパク質のインキュベーションとして設定されています。4)HXは、D 2 Oのバッファにサンプル1時10分以降に希釈することにより行われている。 D 2 Oバッファは、AVOにサンプルバッファと同一である必要がありますIDバッファ効果。次いで、試料を、定義された期間にわたって正確にインキュベートする。 5)インキュベーション後、反応をクエンチし、HPLC-MSシステムに注入した。試料は酵素的に切断され、得られた消化ペプチドを、有機溶媒勾配で分離し、質量分析計に注入される。得られたペプチドスペクトルの6)の分析。ペプチドスペクトルの重心は、異なる反応条件下で比較される。これはHX解析プログラムによって自動的に適切なソフトウェアまたはを使って手動で行うことができます。
図3。水素交換機構。水素交換の反応は、塩基又は酸によって触媒することができるので、アミド結合に隣接する6残基の側鎖に応じてpHを2.5と3の間の最小の為替レートのpH依存性である。デュリング脱塩およびH 2 Oを含有溶媒中で行われているペプチドのクロマトグラフ分離は、組み込まれた重陽子は、同じメカニズム(「バック交換」)によると、陽子のために戻って交換されます。従って、システム及び使用される溶媒の最適化は、組み込まれた重陽子の損失を低減することが重要である。
図4。 HX-MSの原理 。周囲の溶媒からの結合部位にアミドバックボーン水素の保護におけるタンパク質へのリガンドの結合。これは、影響を受けたプロトンの為替レートを低下させ、重陽子の取り込みを減少させる。陽子と重陽子との重量差は1 Daであるため、タンパク質のこの領域に由来するペプチドは、質量分析の下位のm / zが表示されます。実験のペプチドのスペクトルを比較する非存在下および結合パートナーの存在下でのm / z値(保護イベント)を低下させるスペクトルの重心のずれを明らかにする。結合パートナーの添加後顕著な保護を示す地域は、潜在的な結合部位である。配列カバー率及び結合部位の重複ペプチドの可用性に応じて、いくつかのアミノ酸に絞り込むことができる。
図5。 Hsp90のとSTI1の相互作用。 (23からのデータ)のHsp90が存在しない場合にSTI1にパートナーのHsp90マイナス重陽子の取り込みを結合の存在下でSTI1に重陽子の取り込み、差分プロットTPR2aとTPR2b(PDBコード3UQ3)を含むSTI1の断片を。B、漫画の表現Hsp90のC末端MEEVDモチーフを表しペプチドとの複合体。漫画はアコー着色されている丁示されているように重陽子混入から保護アミドプロトンの数に。C、パートナーSTI1結合の存在下でのHsp90の差プロット。同じ温度で、HX、30℃、30秒で3.5倍過剰STI1で10分間のプレインキュベーション後のHsp90に観測された重陽子内蔵。実験は三連で行い、平均値の標準誤差を、各ペプチドについて示されている。グローバル負の値は重陽子の縮小取り込みおよびSTI1の存在下でのHsp90の、したがって、より高い全体的な安定性を示している。バック交換は、この実験では考慮されませんでした。D、酵母のHsp90(PDBコード2CG9)(b)に示したように重陽子混入から保護アミドプロトンの数に応じて色の漫画の表現は。 大きな画像を見るにはここをクリックしてください 。
図7。二峰distribut有するペプチドスペクトルの例はイオン。 Eに、重陽子混入ATPの非存在下および存在下での大腸菌のHsp90(22補遺から取られたデータ。 図3)。 192から206は、D 2 O(0%D)、30秒後、5分、10分、及びD 2 O中で30分のインキュベーション、および100%対照(100%D)中でのインキュベーションの前に示されているペプチド残基のスペクトル。 ATP(ATP-)の非存在下で典型的なEX2交換挙動が観察される。 ATP(+ ATP)の存在下で、強力な保護は、タンパク質の二つの集団と同様のATP結合した状態と第二の集団と同様のものを示し、30秒で及び同位体ピークの5分および10分で二峰性の分布で観察されるヌクレオチドのない状態。 30分でATPの非存在下および存在下の間に差は観察されない。二峰性分布は、おそらくこのタンパク質セグメントにおける高い柔軟性を備えたヌクレオチドのない状態を経てATP加水分解の遷移によって引き起こされます。これらのスペクトルは、古典EX1交換レジに似ている私。B、パルス標識センチ実験における同位体ピークの二峰性分布。E.大腸菌のHsp90は、10〜300秒間、ATPの非存在下又はATPの存在下でインキュベートし、続いて示される( 図22(a)から採取したデータ)としてD 2 O中に10秒間パルス標識した。二峰性の分布は、再び、分子の2共存集団、他よりも重陽子のために、より迅速に交換アミドプロトンの1つを示す。 ATPは遅く交換立体構造に交換するより速いから遅いの移行を誘導する。
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Discussion
タンパク質に相互作用パートナーの結合は、必然的に結合部位に溶媒接近の変化を引き起こす。さらに、多くのタンパク質は、実際の結合界面以外の領域に影響を結合すると、動的な立体構造変化を受ける。 HX-MSは、これらの変更を監視するための堅牢な方法であり、他の方法もカバーすることはできませんタイムスケール上のタンパク質の立体構造変化を明らかにすることさえ可能です。
首尾HX-MSを実行するには3点が重要である:1)最適なシステムのセットアップ、サンプル処理の2)正確な実行および3)慎重なデータ分析ペプチドスペクトルを割り当て、結果を解釈。
システムのセットアップ
質量分析は、ペプチドに重水素取り込みを検出するために使用されているので、試料調製に関して同じ注意がHX-MSに適用される。界面活性剤、塩及び質量分析証を妨害する他の化合物ULDは、解析の前に回避または削除。 HX-MSは、大きなタンパク質複合体の分析を可能にしながら、より高い複雑さは、ペプチド分離および質量分析の品質の向上が求められている。クロマトグラフィー条件の最適化は、質の良いデータを得るための鍵です。これは、高品質の有機溶媒、逆相材料の選択ならびに勾配および溶媒の最適化を伴う。有機溶媒でのカラムの洗浄は、バックグラウンドシグナルを減少させるために実験および一晩の間に行うことができる。質量分析法は、(300-1,200のm / zの間)、消化ペプチドの検出のために最適化されるべきである。異なるペプチドに由来する部分的に重複する同位体ピークのクラスターは区別することができるので、高分解能質量分析計が大幅にデータ分析を容易にする。
サンプルの処理は、HX-MSのために重要である。通常、私たちのバッファやサンプルが凝集してパーティションを削除するために13,000 RPM(微量遠心)で10分間スピンダウンしているCLES。さらに、いくつかのインラインフィルターは、カラムの目詰まりを防止するために、HPLCシステムにインストールすることができる。 Dのわずかな偏差が2 Oインキュベーション時間は、大きな効果を有することができる。非常に柔軟なタンパク質領域のために、ほんの数秒の違いは、重陽子、すべての組み込みおよびフル重水素との違いを作ることができます。タンパク質のダイナミクスだけでなく、本質的な為替レートは温度の関数であるため、サンプルおよびバッファのインキュベーションは厳密に制御された温度である。それは、常に、すべての実験のためのステップの正確な順序を繰り返すことが有利である。正しく実行された場合2実験間の誤差は比較的小さくなります。今日では、HX-MSための自動化システムが市販されており、検体処理の課題を減少させる。
データの分析
HX-MSにおける最も重要な工程は、特に、ペプチドスペクトルおよび重水素化レベルの決定の割り当てデータの分析である。目HX-MSの電子出力は、ペプチドスペクトルの多数を含有する、クロマトグラフの勾配の溶出プロファイルである。事業者のタスクは、プロトコールのステップ6で、MS / MSで同定されたペプチド)にこれらのスペクトルを割り当てることです。スペクトルはかなりHXの後に高いのm / zの方にシフトすることができ、これはやや困難な場合があります。また、スペクトルの部分的なオーバーラップは、ペプチドの割り当てを複雑にするかもしれない。彼らはしばしば重複ペプチドを解決することができるので、この場合、高質量精度で高分解能質量分析計を使用することは報わ。重水素の取り込みの差異は、ペプチドスペクトルの重心に基づいて計算される。重心を決定することができる。1)手動ペプチドスペクトルの各同位体ピークをマークし、表計算ソフト(Excel など 、マイクロソフト)に強度およびm / zの、その値を転送し、重心を計算することによって、または2)を割り当てるように設計されたソフトウェアで同位体ピークが同定されたペプチドに属すると計算すること重心を自動的に( 例えば HDExaminer、シエラ解析またはHeXicon 24,25)。
HX-MSの最適化
1)クロマトグラフィー(溶媒勾配の長さ/形状、異なる逆相材料の使用)を最適化または2)の酵素的切断を変える:評価可能なペプチドの数が低すぎる場合、実験を最適化するためのいくつかの他の可能性がある。タンパク質(代替プロテアーゼ、ペプシンで長い/短いインキュベーション時間、クエンチバッファに変性剤の付加)。彼らはどちらかのペプチドプール自体またはHPLC分離を変えるように、両方のパラメータは、ペプチドの溶出挙動を変更します。両方の最適化のアプローチは、ペプチドを再分類する必要性を犠牲にしています。他のプロテアーゼは、MS / MSによって同定し、ステップ6.6で説明したように特徴づけされなければならない別のペプチド)を生成します。クロマトグラフィー条件を変更しても、ペプチドプールが、保持TIが変更されることはありません個々のペプチドのMES。保持時間はその後)ステップ6.5のように再決定しなければならない。より高い保持時間が常に長い保持時間でバック交換が増加するにつれて、検出可能な標識の量を減少させることが言及されるべきである。 100%のコントロールへのデータの正規化は、逆交換に対処するための最良の方法です。ハイバック交換は、組み込まれた重陽子の損失、したがって、シグナルをもたらす。ことを強く最小限に戻って交換量を減らすことをお勧めします。異なるHX-MSセットアップは、ハードウェア、使用される緩衝液および溶媒の組成および26を使用される勾配のタイプに応じて、逆交換の発散速度を有することに留意されたい。
データを解釈する
データを分析する際に、同位体ピークの強度分布は、交換機構に指示を与えることができるので、慎重に評価される必要がある。それ以下の質量を有するペプチドのための2,000以上のダ未交換サンプルの同位体ピークの強度は、一般的に単一同位又は第一高同位体ピークより高い強度の非対称である。 EX2交換レジームの場合、この非対称の強度分布は、D 2 Oで時間を増加させ、より高いのm / zおよび約50%( 図7)による同位体クラスターの増加の幅へのシフトの増加とともにガウス状となる。導入EX2で述べたように、最も一般的にネイティブの条件でHX-MSで観察し、交流の観察された速度は、タンパク質の熱力学的安定することが定数K Uを展開し、平衡に比例する。対照的に、EX1交換レジームのための同位体クラスター有意に増加し、二峰性又は多峰強度分布の幅分布は25,27( 図7参照)が観察される。二峰性同位体分布は、必ず2つ以上の異なる分子種を示す分析では、潜在的に興味深いである。しかし、落とし穴の2種類があります。まず、同位体クラスターは、2つの異なるペプチドに由来するピークで構成されてもよい。それは同じようなのm / zと同一の電荷を持ったペプチドを未交換のサンプルのスペクトルを確認することが必須である。このようなペプチドは、通常、保持時間がわずかに異なり、同位体ピークの強度分布は、溶出時間とともに変化する。高分解能質量分析計においては、同じペプチドに属していない同位体ピークがm / z値の小数によって区別することができる。第二に、以前のHPLC-MSランからのキャリーオーバーは、28と観察される。そのようなキャリーオーバーは、nonexchanged種を表示および分析の実行の間に空白HPLCグラジエントを実行することによって解消することができる。見かけEX1の為替制度のための多くの理由があります。 1)変性剤EX1の存在下で、HXの実験では、頻繁に29を観察する。 2)自発的または誘導され、可逆的または不可逆的LOCAlやタンパク質のフォールディンググローバルEX1行動7,30,31が発生します。 3) 例えば基質ターンオーバーによって引き起こされ、HXと比べて遅い高次構造遷移、ATP加水分解は、原因EX1の為替制度( 図7a)22 に似た二峰性同位体分布。 4)パルスラベル実験におけるリガンド誘導遅いコンフォメーションの遷移もEX1様の署名( 図7b)22 を示す。
得られたデータの解釈は、このような困難なだけでなく、強力な技術HX-MSを作るもの、最終的にある。タンパク質ダイナミクスの幅広い知識は、タンパク質ダイナミクスの機構モデルに観測された保護/脱パターンからすべての方法を取得するために必要です。それにもかかわらず、生産高品質HX-MSデータは、比較的短い時間内に行われ、非常に再現性があることができる。データの解釈は明らかにタンパク質投資の構造上の任意の付加情報から利益を得るigated。他方側では、HX-MSは、構造決定のための結晶化を促進するために除去しなければならない可能性がある、柔軟であるタンパク質の部分を示すことができる。
HX-MSは大幅に質量分析とクロマトグラフィーの革新て利益法である。 HX-MSにおける最近の進歩は、更に、この技術32を使用することを広げる膜タンパク質の分析のための脂質ナノディスクの使用である。また、電子移動解離(ETD)と、電子捕獲解離(ECD)を用いることで、単一のアミノ酸11,12 33のレベルに援用重陽子の解像度を増加させるように、HX-MSのための強力な可能性を示す。
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Disclosures
我々は、開示することは何もありません。
Acknowledgments
私たちは、原稿にコメントをM·ボイセンに感謝します。このプロジェクトは、(MPMに1278/4-1 SFB638とMA、そして卓越したクラスター:CellNetworks EXC 1分の81)ドイツ学術振興によって資金を供給された。 CellNetworks:MPMは卓越性のクラスタの研究者でもある。
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
maXis QTOF | Bruker | ||
nanoAcquity UPLC | Waters Corp. | ||
Shimadzu 10AD-VP | Shimadzu | ||
6-port Valve EPC6W with microelectric actuator | Valco | #EPC6W | |
Injection valve (manual) | Rheodyne | #7725 | |
Poros AL20 media | Applied Biosystems | #1-6029-06 | |
Poros R2 | Applied Biosystems | #1-1118-02 | |
Pepsin | Sigma | #P6887 | use fresh pepsin |
Microbore (1 mm) | IDEX | #C-128 | |
Microbore (2 mm) | IDEX | #C-130B | |
Acquity UPLC BEH C8 Column | Waters Corp. | #186002876 | |
Thermomixer | Eppendorf | #5355000.011 | |
Tubing (various diameters) | IDEX | ||
Fittings | IDEX | #PK-110 with PK-100 |
References
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