Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Chemistry
Click here for the English version

Chemistry

Анализируя Динамика белков с использованием водорода валютный масс-спектрометрии

Published: November 29, 2013 doi: 10.3791/50839
Automatic Translation
1, 1
1Zentrum für Molekulare Biologie der Universität Heidelberg (ZMBH), University of Heidelberg

Summary

Конформации белка и динамика являются ключевыми для понимания взаимосвязи между структурой и функции белка. Обмен водорода в сочетании с масс-спектрометрии высокого разрешения является универсальным методом для изучения конформационной динамики белков, а также характеризующие белок-лиганд и белок-белковых взаимодействий, в том числе контактных интерфейсов и аллостерических эффектов.

Abstract

Все клеточные процессы зависят от функциональности белков. Хотя функциональность данного белка является прямым следствием его уникальной аминокислотной последовательности, он реализуется только по сворачивания полипептидной цепи в единую определенную трехмерную договоренности или чаще в ансамбль взаимопревращени конформации. Исследуя связь между конформации белка и его функции Поэтому для полного понимания того, как белки в состоянии выполнить их большое разнообразие задач. Одной из возможностей для изучения конформационных изменений белка претерпевает в то время как прогрессирует через его функционального цикла представляет собой водород-1Н / 2 Н-обменного в сочетании с масс-спектрометрии высокого разрешения (HX-MS). HX-МС является универсальным и надежный метод, который добавляет новое измерение к структурной информации, полученной, например, кристаллографии. Он используется для изучения белок складывания и раскладывания, связывание небольшой мольecule лиганды, белок-белковые взаимодействия, конформационные изменения, связанные с ферментативного катализа и allostery. Кроме того, HX-MS часто используется, когда количество белка очень ограничено или кристаллизации белка не представляется возможным. Здесь мы предлагаем общий протокол для изучения динамики белков с HX-МС и описать в качестве примера, как показывают интерфейс взаимодействия двух белков в комплексе.

Introduction

Количество кристаллических структур белков и белковых комплексов резко увеличилось в последние годы. Они представляют бесценные снимки структурной организации этих белков и обеспечить основу для структуры и функции анализа. Тем не менее, динамика белков и конформационных изменений, которые необходимы для их функций, которые редко показал с помощью рентгеновской кристаллографии. Крио-Электронная микроскопия, с другой стороны, имеет возможность захвата белка и белковых комплексов в различных конформаций, но в целом не может решить конформационные изменения до среднего уровня структуры 1. Конформационная динамика белков в растворе на атомном деталей может быть решен только с помощью ЯМР, но этот метод по-прежнему ограничен белков относительно небольших размеров (обычно ≤ 30 кДа) и нуждается в высокой концентрации белков (≥ 100 мкм), что затрудняет эксперименты с олигомеризации или агрегации, склонные белков 2. Одним из методов,способна преодолеть между высоким разрешением рентгеновской кристаллографии и крио-Электронная микроскопия и который не ограничен размером белка или концентрации водорода является амид-1Н / 2 Н-обменного (HX) в сочетании с масс-спектрометрией (MS). В последние годы этот метод разработан для ценного аналитического инструмента для анализа динамики белков, сворачивания белка, стабильности белка и конформационных изменений 3-5. Молекулярные основы этого метода является лабильным характер системообразующих амидных атомов водорода в белках, которые будут обмениваться с атомами дейтерия, когда белок помещается в D 2 O раствора. Последующее увеличение массы белка с течением времени измеряется с высоким разрешением MS.

В коротких неструктурированных пептидов HX зависит только от температуры, концентрации катализатора (ОН -, Н 3 О + т.е. рН, см. рисунок 3) и боковых цепей аминокислот из соседних остатков из-за индуктивной, кошкиalytic и пространственные эффекты. Эти эффекты на внутренней химической обменный курс К ч были элегантно количественно Бай и др.. 6 и программа доступна (любезность З. Чжан), который вычисляет К ч для каждой аминокислоты в полипептид в зависимости от рН и температуры. При нейтральном рН и температуре окружающей среды К ч составляет порядка 10 1 -10 3 с -1. В свернутых белков HX может быть 2-9 порядков медленнее в основном за счет водородных связей в вторичной структуры и в меньшей степени за счет ограниченного доступа гидратированных ОН - ионов к внутренней части плотно уложенного белка. HX в нативных белков поэтому подразумевает частичную или глобальной разворачивается, химический обмен и повторной укладки в нативном состоянии в соответствии с уравнением (1) и наблюдаемые курсы обмена K набл зависеть от темпов открытия К ор, скорость закрытия К кл и внутренней химического обмена раТе К ч в соответствии с уравнением (2).

Уравнения 1-2
Под носителями государственных условиях к оп намного меньше, чем К ч и ими можно пренебречь в знаменателе. Есть два крайних режимов обмена называемые EX1 и EX2. Если к кл намного меньше, чем К ч (EX1) наблюдаемая скорость практически равна скорости открытия и HX позволяет сразу же наблюдение разворачивание структурного элемента. Такой обмен режим, где все амидные протоны обмен сразу при открытии структурного элемента, легко наблюдаемая в MS бимодальным распределением изотопов пиков 7. Если к кл намного больше, чем К ч (EX2) наблюдаемая скорость пропорциональна К ч причем коэффициент пропорциональности равен складных-разворачивания равновесий постоянная К U = K оп кл. В этих условиях многие открытия и закрытия мероприятия необходимы, прежде всего обмен амидные протонов для дейтронов, что приводит к постепенному увеличению средней массы в то время как изотопный распределение остается примерно такой же. Режим EX2 позволяет определить свободной энергии разворачивается ΔG и и поэтому стабильность структурного элемента. Под родной государственной состоянии режим EX2 является наиболее распространенным. Повышение рН и добавлением хаотропных агентов можно сдвинуть обменный механизм EX1. Таким образом, HX-MS может быть использован для изучения термодинамических а также кинетические параметры складывания белка и конформационных изменений.

Как упоминалось выше HX внутренне рН и температура зависят и обмен полураспада полностью открытой растворителя протона магистральной амидной группы находится между 5-400 мс при физиологическом значении рН (рН 7,6) и 30 ° С, но 10 мин до> 15 час при среднем значении> 2 ч при рН 2,9 и 0 °С (для протона первого магистральной амидной связи полипептида, который обменивается с периодом полураспада ок. 1-2 мин исключением). В таких медленно обменивающихся условиях можно переварить примера с использованием протеазы (например пепсин), которые активны в этих условиях, с нашими потерять всю информацию, содержащуюся в объединенных дейтронов. С момента введения язвенной пищеварения при медленных условиях обмена, не только общие HX кинетика полноразмерные белки могут быть проанализированы, но HX могут быть локализованы в конкретных регионах 8,9. Пространственное разрешение в настоящее время ограничивается размером пептической фрагментов, полученных, которая является в целом 10-30 остатков. Тем не менее, перекрывающиеся фрагменты, созданные за счет неспецифического характера расщепления пепсином может привести к увеличению пространственного разрешения. Кроме того, несколько других протеаз, оказались активными при условиях закалки, однако, значительно менее эффективен, чем пепсина 10. Кроме того увеличилисьсебе пространственного разрешения может быть достигнуто путем фрагментации пептидов в газовой фазе методами, которые сохранились дейтерирование шаблон например захвата электронов диссоциации (ECD), перенос электрона диссоциации (ETD) и инфракрасного многофотонная диссоциация (ИКМФД) 11-13. Эти методы предотвращения потери пространственного разрешения в связи с внутримолекулярной миграции протонов ("скремблирования"), которое наблюдается на столкновительное диссоциации (CID) наиболее часто используется методика фрагментации. Однако эти методы требуют оптимизации для каждого отдельного пептида и, таким образом, все еще довольно сложной задачей.

HX-MS была использована для анализа белок-лиганд и белок-белковых взаимодействий в том числе вирусного капсида сборки 14-17. Белок разворачивается и повторной укладки, а также температуры, вызванные конформационные изменения были исследованы 7,18,19. Фосфорилирования и один аминокислотный мутация связанных конформационные изменения 16,20 и nucleotязь-индуцированные изменения были проанализированы 21,22. Таким образом, этот метод кажется идеально подходит для анализа сборки и динамики молекулярных машин. Один привлекательным кандидатом, механизм которого имеет большое общий интерес, является компаньонка комплекс Hsp90.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Подготовка буферов и Белки Образцы

  1. Подготовка H 2 O буфер. Использование Hsp90 стандартный буфер (40 мМ HEPES / KOH, рН 7,5, 50 мМ KCl, 5 мМ MgCl 2, 10% глицерина) в H 2 O буфер.
    Примечание: Если образец подвергают диализу перед анализом, использовать буфер диализа как Н 2 О буфера. Очень важно, чтобы уплотнительное буфера D 2 отличается от вывода буфера H 2 только в изотопа водорода. Летучие буферы, такие как NH 4 CO 3 или NH 4-ацетат или буферные компоненты не подходят!
  2. Подготовка D 2 O буфер путем лиофилизации Hsp90 стандартного буфера с помощью вакуумного концентратора. После полного испарения H 2 O добавлять чистый D 2 O в пробирку, чтобы достичь первоначального общего объема (например, 1 мл буфера с 15% глицерина требует добавления 850 мкл D 2 O). Повторите полное испарение буфера и повторного растворения буфер / соль комкомпоненты в D 2 O 2x.
  3. Подготовка закалки буфер (0,4 М KH 2 PO 4 / H 3 PO 4 рН 2,2).
    Примечание: Чтобы повысить эффективность язвенной дайджест очень стабильными белками 4 М гуанидин гидрохлорид и 0,5 М трис (2-карбоксиэтил) фосфин (ТСЕР-HCl) могут быть добавлены.
  4. Подготовьте 100% контрольного образца (6 М гуанидина гидрохлорид, D 2 O). Добавить гидрохлорид гуанидина к аликвоте Hsp90, чтобы достичь конечной концентрации 6 М Полностью испаряется H 2 O из образца и добавить D 2 O в пробирку, чтобы достичь первоначального общего объема (например, 100 мкл образца с 10% глицерина требует добавления 90 мкл D 2 O). Повторите полное испарение буфера и растворяться компоненты буфера / соли в D 2 O.
    Примечание: 20-100 пмоль образца требуются для каждой инъекции. Подготовьте достаточно образец иметь контроль на каждый день HX-MS экспериментов 100%.
  5. Подготовка 50 пмоль Hsp90 в 5 мкл Hsp90 стандартного буфера.
    Примечание: количество 20-100 пмоль образца требуется для каждой точки исходных данных. Объем образца в реакции, 1-5 мкл идеально. Отрегулируйте концентрацию, чтобы соответствовать этим требованиям. Любой буфер может быть использован тех пор, пока он не содержит моющие средства или летучие компоненты.

2. Получения иммобилизованных Пепсин на альдегидов Активированный бисер

  1. Растворите 80 мг свежего пепсин в 2 мл 50 мМ цитрата натрия (рН 5).
  2. Растворите 20 мг натрийцианборгидрида, обращаться с осторожностью (очень токсичного!) В 1 мл 2 М Na 2 SO 4 и добавить в пепсина решения.
  3. Инкубировать смесь в течение 10 мин при комнатной температуре при перемешивании осторожно (например, пленка шейкер).
  4. Добавить 600 мг шарики с иммобилизованными альдегидных групп к смеси и инкубируют в течение 5-10 мин при комнатной температуре.
  5. Добавить 2,2 мл 2 М Na 2 SO4 (рН 5) в 100 мкл аликвоты через каждые 3 мин в течение одного часа медленно соль из пепсин. Аккуратно перемешайте пробу между дополнений в накладных шейкере при комнатной температуре.
  6. Инкубируйте пепсина бусы при 4 ° С в течение 14-16 ч / ночь в накладных шейкере.
  7. Реакцию останавливают добавлением 1 мл из 1 М этаноламина и инкубации при комнатной температуре в течение 2 часов.
  8. Спином вниз бисером в 50 мл трубки сокола при 500 оборотах в минуту, отбросить супернатант и ресуспендируют бисером в 0,1% муравьиной кислоты. Повторите этот шаг 2x. После последнего центрифугирования, отбросить супернатант и объем оценку бусины. Добавить эквивалентный объем 0,1% муравьиной кислоты и хранить при 4 ° С.

3. Подготовка столбцов для Амид водород-обмен

  1. Используйте столбцы охраны с внутренним диаметром 1 мм для улавливания столбцы и 2 мм для колонок пепсина.
  2. Отвинтите одну сторону защитной колонкой и снимите фильтр. Плотно винт упаковка Funnэль на открытом конце колонны. С помощью 1/16 дюймовый адаптер и трубку для крепления пустой шприц (5 мл) к нижней выходе из колонки. Убедитесь в том, чтобы исправить это газонепроницаемая к защитной колонкой.
  3. Нанести несколько капель суспензии материала шарика в верхней части воронки. Потяните поршень шприца, чтобы сосать суспензии через воронку в защитной колонкой. Применение более суспензии материала шарик на воронку и продолжать процедуру до тех пор столбец охрана не будет полностью заполнен шарик материала. Удалить воронку и поместить фильтр и фильтр кольцо на открытом конце. Плотно завинтить крышку колонки на колонку охраны и удалите шприц с другой стороны. Закройте оба конца столбцов охраны пробками, чтобы избежать высыхания из столбца материала.

4. Настройка системы для обмена водорода масс-спектрометрии (HX-MS)

  1. Подключите колонки ловушки с системой ВЭЖХ (рис. 1). Равновесие, установив расход столбецнасос до 0,4 мл / мин с 0,1% муравьиной кислоты в качестве растворителя. Не подключайте колонки пепсина, ни аналитической колонки еще.
  2. Калибровка масс-спектрометра и соединить выпускное отверстие ВЭЖХ на источник масс-спектрометра.

5. Определение динамического диапазона бирже

  1. Подготовка сверхчистой растворитель А (0,1% муравьиная кислота в воде) и растворитель В ультрачистой (0,1% муравьиной кислоты в ацетонитриле); готовые смешанные растворители являются коммерчески доступными. Продуйте ВЭЖХ насосы. Настройка хроматографии и методов масс-спектрометрии в программном обеспечении управления путем выбора программы ступенчатым градиентом после короткого шага обессоливания. Для полной длины Hsp90 использовать шаг обессоливания 1-2 мин с последующим переключением 6-ходовой клапан с опреснения / НАГРУЗКИ для элюирования и ступенчатый градиент от 90% растворителя A/10% растворителя B до 5% растворителя A/95% растворителя Б. Перед инъекцией установить Форсунка для загрузки и 6-ходовой клапан для опреснения / положение загрузки.
    Примечание: Не используйте пепсин или аналитическую колонку в течение этого эксперимента.
  2. Подготовка 100-200 пмоль Hsp90 в 1-10 мкл H 2 O буфера и инкубировать в течение 10 мин при 30 ° С Добавить температуру доводили D 2 O буфер, чтобы довести объем выборки до 100 мкл и инкубировать точно в течение определенного периода времени (например, 10 сек, 100 сек, 1000 сек). Добавить 100 мкл закалки буфер и перемешать с помощью пипетки вверх и вниз. Введите образец 200 мкл в инъекционный порт впрыска клапана с помощью шприца Гамильтона. Запустите программу хроматографии и переключите Форсунка в инъекционные положении. После 2 мин переключения 6-ходовой клапан с опреснения / погрузки для элюирования. Повторите это по крайней мере три временных точках.
  3. Повторите шаг 5.2, но добавить 2-3x избыток Sti1 к образцу Hsp90 до инкубации в течение 10 мин при 30 ° С
  4. Определить белковые массы полнометражные по деконволюции спектров в средствах массовой программного обеспечения спектрометрии. Рассчитать количество incorporatред дейтроны путем сравнения молекулярную массу полной длины Hsp90 с наблюдаемой массы после каждого запуска (например, 10 сек, 100 сек, 1000 сек).
  5. Участок объединенной дейтронов для Hsp90 в отсутствие и в присутствии Sti1 (ось у) в зависимости от времени (ось х). Определить временной точке в динамическом диапазоне, где различие между двумя кривыми максимальна. Используйте это значение для времени инкубации в D 2 O при определении Hsp90-Sti1 интерфейс и динамику на уровне пептидов.

6. Определение язвенной пептидов Использование MS / MS Spectra

  1. Подключите колонки пепсина и аналитическую колонку в систему.
  2. Настройте параметры для хроматографии и масс-спектрометрии в программном обеспечении управления, выбирая градиент тип и метод масс-спектрометрии. Выберите длинное градиент (например, более чем 90 мин), чтобы обеспечить хорошее разрешение хроматографического. Включение MS / MS спектры на масс-спектрометре.
    Примечание: Хорошо разрешениемТион на ВЭЖХ и высокой точностью массы имеют наивысший приоритет в этом шаге.
  3. Подготовка 100-200 пмоль Hsp90 в 100 мкл H 2 O буфера. Добавить 100 мкл закалки буфер и перемешать с помощью пипетки вверх и вниз. Введите образец 200 мкл в инъекционный порт впрыска клапана с помощью шприца Гамильтона. Запустите программу хроматографии и переключите Форсунка в инъекционные положении. После 2 мин переключения 6-ходовой клапан с опреснения / погрузки элюироваться позицию.
    Примечание: Если больше чем один белок должен быть проанализирован в HX-МС (т.е. интерфейсы белок-белкового взаимодействия) пептиды для каждого белка должны быть определены индивидуально.
  4. Определить язвенной пептиды Hsp90 с помощью функции поиска базу данных (то есть талисман) для полученных пептидов.
    Примечание: Можно использовать пользовательскую базу данных как целью является определить, как много язвенной пептиды, насколько это возможно и анализ делается с очищенным белком. Образец чистоты будет чпр. должны быть приняты во внимание.
  5. Повторите этот шаг без MS / MS и с градиентом, который будет использоваться для фактического эксперимента HX. Для Hsp90 и Sti1 использовать 10 мин градиент от 90% растворителя A/10% растворителя B в 45% растворителя A/55% растворителя Б.
    Примечание: градиенты, как правило, между 5-15 мин и очень зависят от сложности выборки и технические характеристики системы HX.
  6. Определить времени удерживания язвенной пептидов, идентифицированных в 6,4 градиента, используемого в 6,5 и создать список, содержащий 1.) Пептидной последовательности 2.) Пептид государственное обвинение и 3.) Время удерживания. Это будет использоваться для идентификации каждого пептида после HX экспериментов.
    Примечание: Помните, что пептиды с небольшой м / г различий, идентичный уровня заряда и одинаковое время удерживания может быть источником двусмысленности.

7. Идентификация взаимодействию Интерфейсы белок-белковых

  1. Настройте градиент и метод масс-спектрометрии в контрольной Softwarэ. Используйте линейный градиент на 10 минут с 90% растворителя A/10% растворителя B до 45% растворителя A/55% B. растворителя Загрузите массовый метод спектрометрии, который оптимизирован для обнаружения масс между 300-1500 т / г, хотя большинство из пептиды будет ниже 1000 м / г. Установите Форсунка в положение нагрузки, 6-ходовой клапан в НАГРУЗКА / обессоливания позиции. Установка скорости потока загрузочного насоса к 0,4 мл / мин.
    Примечание: длина и тип градиента образец зависит и может должны быть оптимизированы. Более длинные градиенты улучшить разрешение хроматографии но уменьшить включение дейтронов в белки из-за бэк-обмен. Выбранные методы должны быть одинаковыми для всех экспериментах для сравнения.
  2. Для справки unexchanged подготовить 20-100 пмоль Hsp90 в 100 мкл H 2 O буфера. Добавить 100 мкл ледяной закалки буфер, пипетки вверх и вниз в два раза и ввести образец в инъекции клапана ВЭЖХ. Сразу запустить программу хроматографии и программные средствазуд впрыска клапан в инъекционные положении. После 2 мин переключения 6-ходовой клапан с опреснения / погрузки элюироваться позицию. Делайте это в течение Hsp90 и Sti1 индивидуально и для смеси белков.
  3. Подготовка 20-100 пмоль Hsp90 в объеме 1-5 мкл. Добавить температуру доводили D 2 O буфер, чтобы довести объем выборки до 100 мкл и инкубировать точно в течение определенного периода времени (например, 30 с; для конформационные динамика см. примечание). Добавить 100 мкл ледяной закалки буфера, пипетки вверх и вниз дважды и быстро впрыснуть 200 мкл в инъекции клапана ВЭЖХ. Сразу запустить программу хроматографии и переключите Форсунка в инъекционные положении. После 2 мин переключения 6-ходовой клапан с опреснения / погрузки элюироваться позицию. Для этого для каждого белка по отдельности, чтобы определить дейтронов включение в каждого пептида в отсутствии взаимодействующего белка.
    Примечание: При изучении динамики CONFORформационной изменения, повторить эксперимент с различным временем инкубации Hsp90 в D 2 O буфера. Попытка охватить широкий шкалу времени путем выбора времени инкубации логарифмически (например, 10 сек, 30 сек, 100 сек, 300 сек, 1000 сек и т.д.). D 2 O буфера и буфера выборок должны быть точно идентична для изотопа водорода исключением.
  4. Подготовка равное количество 100% контрольного образца (20-100 пмоль) и добавить D 2 O буфера, чтобы довести объем выборки до 100 мкл. Добавить 100 мкл ледяной закалки буфера, пипетки вверх и вниз дважды и быстро впрыснуть 200 мкл в инъекции клапана ВЭЖХ. Сразу запустить программу хроматографии и переключите Форсунка в инъекционные положении. После 2 мин переключения 6-ходовой клапан с опреснения / погрузки элюироваться позицию.
  5. Для определения поверхности взаимодействия смешать Hsp90 с по крайней мере, 2-кратного избытка Sti1 чтобы сдвинуть равновесие в связанном состоянии (см. примечание) и инкубироватьпри желаемой температуре до образования комплекса не находится в равновесии. Добавить температуру доводили D 2 O буфер, чтобы довести объем выборки до 100 мкл и инкубировать точно в течение определенного периода времени (например, 30 сек). Добавить 100 мкл ледяной закалки буфера, пипетки вверх и вниз дважды и быстро вводить в инъекции клапана ВЭЖХ. После 2 мин переключения 6-ходовой клапан с опреснения / погрузки элюироваться позицию. Повторите этот эксперимент с 20-100 пмоль Sti1 и сверх Hsp90.
    Примечание: абсолютные концентрации зависит от диссоциации константы равновесия взаимодействия. В идеале, после разбавления в D 2 O концентрация белка добавляют в избытке должно быть по крайней мере в 10 раз K D (соответствует> 85% нижнего концентрированной белок связан).
  6. Анализ полученных данных с соответствующим программным обеспечением и использовать время удерживания определено на этапе 6,5 найти каждого пептида в анализе. РасчетыТе центр тяжести распределения изотопов для unexchanged белка (шаг 7.2) и для HX экспериментов (шаг 7.3).
    Примечание: Несмотря на то, изотопные узоры обмениваемых пептидов отличаться от их unexchanged коллегами, как знание о зарядового состояния пептида и высокая масса точность масс-спектрометра позволяет легко определения центров тяжести.
  7. Сравните включение дейтронов белка-мишени только и с превышением связывания партнера. Это может быть сделано автоматически с коммерческим программным обеспечением или вручную с электронными таблицами. Значения контрольного образца 100% обозначим максимальный обмен на каждого пептида и может быть использовано для определения количества D 2 O этикетка потерянного в ходе эксперимента из-за задней обмена.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Hsp90 представляет собой молекулярный сопровождающий в дрожжах и член шаперонной семьи Hsp90. Идя через сложную АТФазы цикла она помогает поздние этапы складывания многих клиентов белка. Эффективное складывающиеся требуется передачу клиентов от Hsp70 и взаимодействие со-шаперонной Sti1/Hop. Sti1 непосредственно связывается с Hsp90 и облегчает клиенту связывание путем ингибирования АТФазы Hsp90 в. Взаимодействие Hsp90 с Sti1 недавно изучали с помощью HX-MS 23. Здесь мы представляем репрезентативные результаты основных экспериментов следующие выше протокола.

Непосредственное взаимодействие белок-белок был испытан путем маркировки белковый комплекс в равновесии с D 2 O и сравнения спектров пептидов Sti1 в отсутствие и в присутствии Hsp90.The Результирующая разность участке можно видеть на фиг.5А (данные из 23). Пептиды ориентированы сверху вниз, начиная с N-конца. В основном пептиды вTPR2a и TPR2b показывают сильную защиту в присутствии Hsp90 (отрицательные значения D + Hsp90 - D-Hsp90), указывая, что эти регионы взаимодействуют с Hsp90. Защита в TPR2a может быть легко рационализировать от кристаллической структуры Sti1-TPR2a-TPR2b в комплексе с пептидом, представляющим С-концевой MEEVD-мотив Hsp90 (фиг.5В). Такая четкая защита в белок-белковых взаимодействий не всегда соблюдается. Защита в Hsp90 в присутствии Sti1 не столь выраженным, а не как локализованные как в Sti1 (фиг. 5С и 5D). Все пептиды показать немножко повышенную защиту от дейтрона включения в присутствии Sti1. Sti1 очевидно стабилизирует Hsp90 во всем мире как никакой другой регион белка не показывает больше гибкости в присутствии Sti1. Мы можем, однако, не отличить, если это сводится дейтрона включение происходит от прямого взаимодействия с Sti1 или через аллостерических воздействия на конформациииз Hsp90. Информация, полученная снижает предполагаемый сайт взаимодействия до нескольких пептидов (например, пептидных 43-62 из NBD). Дополнительные эксперименты, такие как сшивки обычно используются для подтверждения сайты связывания после HX-MS 23. Следует отметить, что охват последовательность Hsp90 уменьшается при измерении комплекс Hsp90-Sti1. С Sti1 был добавлен в 3,5-кратном избытке теоретическая общая сумма пептидов в анализе были некоторые в четыре раза выше, чем с одним только Hsp90. Это увеличивает риск Sti1 пептидов затмевает или перекрывающихся Hsp90 пептиды при анализе. Для оптимизации для повышения охвата последовательность лучше хроматографического разделения, кажется, наиболее перспективный подход.

Одной из возможностей для изучения динамики различных регионов белка является использование непрерывной маркировки HX-МС. Она включает в себя инкубацию уравновешенной образца белка в D 2 O для различных периодов времени и, следовательно, позволяет предсказания о стабильностиОтдельные сегменты белка. 6 иллюстрирует спектры пептида 43-62 от NBD из Hsp90 в присутствии и в отсутствие 3,5-кратным избытком Sti1. В периоды инкубации были выбраны по логарифмической шкале (10 сек, 100 сек и 1000 сек), чтобы получить хорошее покрытие в широком временном окне. Спектры пептидные показывают время в зависимости включение дейтерия в белок, который увеличивает в течение более длительных периодов инкубации. Для пептида 43-62 обмена следует EX2 механизм, где к десятичного << к кл. Степень защиты изменяется в течение времени инкубации, показывая главное различие в короткие сроки инкубации и почти аналогичным курсу на длинной временной точке. Это говорит о более низкой стабилизации градусов или регион динамических взаимодействий с частыми диссоциации и реассоциации. Либо наблюдали защита обусловлена ​​общим пониженном курсу амидных протонов в пептид или эффекта может быть назначен один или дваконкретные амидные протоны, которые обмениваются более медленно в присутствии Sti1. В этом случае последний гораздо более вероятно, что кристаллическая структура Hsp90 показало этот регион, чтобы быть подвержены цикл, а не регулярная вторичная структура, как α-спиралей или β-листы.

Важно отметить, что задняя обмен не вычитается из данных, приведенных подразумевая, что наблюдаемые эффекты будет более выраженным, как только нормализуется к 100% контроль.

Рисунок 1
Рисунок 1. Установка для ВЭЖХ HX-МС. а) Типовая конфигурация из HX-MS создан. Различные цветные области представляют разделы поддерживаются при разных температурах. Образец вводят в образец петли инжекторного клапана (в режиме нагрузкой, голубой) и после переключения клапана в "режим вводить" (черный) прокачивают черезстолбец пепсин в 6-х ходового клапана. В столбце пепсин поддерживается примерно при 10 ° С, чтобы улучшить ферментативную активность пепсина. 6-ходовой клапан имеет два режима, "Режим загрузки / обессоливания" и "элюционного Mode" (см. B). После обессоливания образца пептиды хроматографически разделены с градиентом ацетонитрила на аналитической колонке с обращенной фазой. Пептиды затем распыляют в масс-спектрометр с ESI-источника. Б) Режимы 6-ходовой клапан. Сразу после HX 6-ходовой клапан находится в «Погрузка / обессоливания Позиция" в ловушку язвенная пептидов на колонке ловушки. Это продолжается в течение до трех минут, чтобы удалить любые соли или соединения реакции буферов, которые могут повлиять на масс-спектрометрии. После этого 6-ходовой клапан переключается в "элюции Mode" поставив загруженную колонку ловушки на пути потока между градиента насоса и аналитической колонке. Захваченные язвенная пептиды теперь выделяться из ловушки ColuMN и стать разделяют в градиенте 0,1% муравьиной acid/0.1% муравьиной кислоты в ацетонитриле.

Рисунок 2
Рисунок 2. Расход схему эксперимента HX. 1) Цель белок очищают и поставляется в стандартных буферов без моющих средств. 2) белок ферментативно гидролизовали пепсином и пептические пептиды идентифицированы и охарактеризованы с помощью масс-спектрометрии тандем (MS / MS). Только после последовательность получения, взимают государственную и удержания время как многие пептидов, насколько это возможно HX-МС может быть успешно выполнена. 3) Экспериментальные условия устанавливаются такие как инкубации белка в определенных условиях (добавление лиганд / химического соединения или сдвига в температуре или рН. 4) HX выполняется путем разбавления образца 1:10 или выше в D 2 O буфера . D 2 O буфер должен быть идентичен буфере выборок для AVOID буферные эффекты. Затем образец выдерживают именно в течение определенного периода времени. 5) После инкубации реакцию останавливают и вводили в систему ВЭЖХ-МС. Образец претерпевает ферментативное отщепление и полученные пептиды пептические разделены в градиенте органическом растворителе и вводят в масс-спектрометре. 6) Анализ полученных спектров пептидов. Центры тяжести спектров пептидов сравнивают в различных условиях реакции. Это может быть сделано вручную с помощью соответствующего программного обеспечения или автоматически с помощью программы анализа HX.

Рисунок 3
Рисунок 3. Водородного обмена механизм. Реакция обмена водорода может быть катализируемой основанием или кислотой-и, следовательно, зависит от минимальной скорости обмена между рН 2,5 и 3 в зависимости от боковых цепей остатков, фланкирующих амидную связь 6 рН. Duкольцо обессоливания и хроматографического разделения пептидов, которая выполняется в Н 2 О, содержащих растворители, включенные дейтоны обменялись назад для протонов по тому же механизму ("назад обмена"). Таким образом, оптимизация системы и используемых растворителей имеет решающее значение для снижения потерь, включенных дейтронов.

Рисунок 4
Рисунок 4. Принцип HX-МС. Связывание лиганда белка приводит защиты амидной позвоночника водороды на сайте связывания от окружающего растворителя. Это уменьшает обменные курсы пострадавших протонов и уменьшает включение дейтронов. Поскольку разница между масса протона и дейтрона 1 Da, пептиды, полученные из этой области белка покажет более низкую M / Z в масс-спектрометрии. Сравнивая спектры пептидов экспериментахв отсутствие и в присутствии связывающего партнера покажет смещение центра тяжести спектров для снижения значения M / Z (событий защиты). Регионы, которые проявляют заметную защиту после того связывания партнера являются потенциальными сайты связывания. В зависимости от охвата последовательности и наличия перекрывающихся пептидов сайты связывания может быть сужен до нескольких аминокислот.

Рисунок 5
Рисунок 5. Взаимодействие Hsp90 и Sti1. , разница участок дейтрона включения в Sti1 в присутствии связывающего партнера Hsp90 минус дейтронов включение в Sti1 в отсутствие Hsp90 (Data из 23). б, Мультфильм представление фрагмента Sti1 состоящий TPR2a и TPR2b (PDB код 3UQ3) в комплексе с пептида, который представляет С-концевой MEEVD-мотив Hsp90. Мультфильм цветной AccorДин с количеством протонов амидных защищенных от дейтронов регистрации, как указано. с, разница участок Hsp90 в присутствии св зывающегос партнера Sti1. Наблюдаемое дейтронов включение в Hsp90 после 10 мин инкубации с 3.5x избыточного Sti1 при 30 ° С и 30 сек; HX при той же температуре. Эксперимент проводили в трех экземплярах и стандартная ошибка среднего показан для каждого пептида. Глобальные отрицательные значения обозначают пониженное включение дейтронов и поэтому более высокую общую стабильность Hsp90 в присутствии Sti1. Вернуться обмен не рассматривался в этом эксперименте. Д, Мультфильм представление дрожжей Hsp90 (PDB код 2CG9) окрашены в соответствии с количеством амидных протонов, защищенных от дейтрона включения, как указано в пункте б. Нажмите здесь, чтобы увеличить рисунок .

Рисунок 6. Время курс дейтрона включения в дрожжевой Hsp90 в отсутствие и в присутствии Sti1. , необработанные пептид спектры пептида 43-62 от нуклеотидной связывающий домен Hsp90 после замены непрерывной маркировки водорода. 20 мкМ Hsp90 инкубировали с 70 мкМ Sti1 в течение 10 мин при 30 ° С для достижения равновесия и D 2 O маркировка проводили при 30 ° С в течение 10 сек, 100 сек и 1000 сек. Красные маркеры точечные указывают расчетные центроиды для каждого пептида. Б, кинетика обмена пептида 43-62 в присутствии и в отсутствие избыточного 3.5x Sti1. Вернуться обмен не рассматривался в этом эксперименте.

Рисунок 7
Рисунок 7. Примеры пептидов спектров с бимодальном раздачиионная. , дейтронов включение в Е. палочка Hsp90 в отсутствие и в присутствии АТФ (данные взяты из 22 доп. рис. 3). Спектры пептидных остатков 192-206 показаны до инкубации в D 2 O (0% D), после 30 сек, 5 мин, 10 мин и 30 мин инкубации в D 2 O, и 100% контроль (100% D) . При отсутствии АТФ (ATP-) наблюдается типичное поведение EX2 обмен. В присутствии АТФ (+ АТФ) надежную защиту наблюдается при 30 сек и через 5 мин и 10 мин бимодальное распределение изотопного пиков, что указывает на две популяции белков, один население похожа на АТФ связанного состояния и второй аналогично нуклеотид-свободным государством. На 30 мин никакой разницы между отсутствие и в присутствии АТФ не наблюдается. Бимодальное распределение, скорее всего, вызвано гидролиза АТФ и переходе через нуклеотидной без состояния с большей гибкости в этом сегменте белка. Эти спектры напоминают классические Regi EX1 обменая. б, Бимодальный распределение изотопных пиков в импульсно-маркировки экспериментов HX. Е. палочка Hsp90 инкубировали в отсутствие АТФ или в присутствии АТФ для 10-300 сек, а следующий импульс меченных в течение 10 сек в D 2 O, как указано (данные, полученные от 22 фиг.4А). В бимодальное распределение указывают снова два сосуществующих популяций молекул, один обменивать быстрее, амидные протоны для дейтронов, чем другой. АТФ вызывает медленный переход от тем быстрее обменивать в медленной обмена конформации.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Связывание партнера взаимодействия с белком неизбежно приводит к изменениям в доступности растворителя на сайте связывания. Кроме того, многие белки подвергаются динамические конформационные изменения при связывании, которые влияют на другие регионы, чем действующей связывающей интерфейса. HX-МС является надежным методом для мониторинга этих изменений и даже способны выявить конформационные изменения в белках во временных масштабах, что другие методы не могут покрыть.

Чтобы успешно выполнить HX-MS три точки являются критическими: 1) оптимальная настройка системы; 2) точное выполнение обработки образцов и 3) анализ данных осторожным при назначении спектры пептидов и интерпретации результатов.

Настройка системы

Поскольку масс-спектрометрия используется для обнаружения дейтронов включение в пептидов, те же меры предосторожности, касающиеся подготовки проб применяются для HX-МС. Моющие средства, соли и другие соединения, которые мешают масс-спектрометрии шоULD избегать или удалены перед анализом. В то время как HX-MS позволяет анализировать крупных белковых комплексов, тем выше сложность требует повышению качества разделения пептидов и масс-спектрометрии. Оптимизация хроматографических условиях является ключом к получению качественных данных. Это включает в себя выбор высокого качества органических растворителей, обращенно-фазовой материал, а также оптимизировать градиентов и растворителей. Стиральная столбцов с органическими растворителями можно сделать между экспериментами и на ночь, чтобы уменьшить фоновый сигнал. Масс-спектрометрия методы должны быть оптимизированы для обнаружения пептической пептидов (между 300-1,200 м / з). Масс-спектрометры высокого разрешения значительно облегчит анализ данных, потому что частично перекрывающиеся изотопные пиковые кластеры, происходящие из различных пептидов можно отличить.

Обработка образцов имеет решающее значение для HX-МС. Обычно наши буферы и образцы центрифугировали в течение 10 мин при 13000 оборотов в минуту (микроцентрифужную) для удаления агрегатов и частицCles. Кроме того, несколько встроенные фильтры могут быть установлены в систему ВЭЖХ, чтобы предотвратить засорение столбцов. Незначительные отклонения в D 2 O время инкубации может иметь большие последствия. Для очень гибких регионов белковых разница всего на несколько секунд может сделать разницу между не дейтрона включения вообще и полной дейтерирования. Так как динамики белков, а также внутренняя курс являются функцией температуры, инкубирование образца и буферов плотно контролируемой температурой. Это выгодно, чтобы всегда повторять точную последовательность шагов для каждого эксперимента. Если выполнены правильно ошибка между двух экспериментов будет относительно небольшим. Сегодня автоматизированные системы HX-МС являются коммерчески доступными и уменьшить проблемы обработки образца.

Анализ данных

Наиболее важным шагом в HX-МС является анализ данных, в частности назначение спектров пептидов и определение уровней дейтерирования. Чте выход HX-МС Профиль элюции хроматографической градиента, содержащего большое количество спектров пептидов. Задача операторов состоит в назначении этих спектров с пептидами, определенных MS / MS в шаге 6) Протокола. Это может быть довольно трудно, поскольку спектры могут значительно смещаться в сторону более высокой т / г после HX. Также частичное перекрытие спектров может осложнить назначение пептидов. В этом случае использование масс-спектрометров высокого разрешения с высокой массовой точностью окупается, потому что они часто могут решить перекрывающихся пептидов. Различия в дейтрона включения рассчитываются на основе центрами тяжести спектров пептидов. В центроиды можно определить: 1) вручную, пометив каждый изотопный пик пептидной спектра и передачи его значения для интенсивности и т / г в программу электронных таблиц (например Excel, Microsoft) и расчета центра тяжести или 2) с программное обеспечение, предназначенное для назначения изотопные пики принадлежности к определенной пептида и рассчитатьцентроиды автоматически (например HDExaminer, Сьерра-Аналитика или Гексикон 24,25).

Оптимизация HX-МС

Если число оцениваемых пептидов является слишком низким, существует несколько других возможностей для оптимизации эксперимента: 1) оптимизация хроматографии (растворители, длина / форма градиента, использование различных обращенно-фазовой материала) или 2) изменение ферментативного расщепления белок (альтернативный протеазы, больше / короче время инкубации с пепсином, добавление денатурирующих агентов в буфер быстрого охлаждения). Оба параметра изменить поведение элюирования пептидов, поскольку они либо изменяет саму пула пептидов или разделение ВЭЖХ. Оба подхода оптимизации приходят по цене необходимости recharacterize пептиды. Другие протеазы будет производить различные пептиды, которые должны быть определены MS / MS и характеризуется как описано на стадии 6.6). Изменение условий хроматографии не изменит бассейн пептидный Но сохранение тиMES отдельных пептидов. Время удерживания затем должны быть redetermined как в шаге 6.5). Следует отметить, что более высокие значения времени удерживания всегда будет уменьшить количество определяемой меткой, как вернуться обмена увеличивается при более длительном времени удержания. Нормализация данных в 100% контроль является лучшим способом справиться с задней обмена. Высокая спинка обмен приводит к потере включены дейтронов и поэтому сигнала. Настоятельно рекомендуется, чтобы уменьшить количество задней обмена к минимуму. Следует отметить, что различные установок HX-MS будет иметь расходящиеся показатели задней обмена, в зависимости от аппаратных средств, состав используемых буферов и растворителей и типа градиентов, которые используются 26.

Интерпретация данных

При анализе данных, распределение интенсивности изотопных пиков необходимо оценивать осторожно, поскольку он может дать показания по обменному механизму. Для пептидов с массой менеечем 2000 Da интенсивности изотопных пиков unexchanged образца, как правило, асимметричной более высокой интенсивности для monoisotope или первого высшего пика изотопов. Для валютного режима EX2 это асимметричное распределение интенсивности становится гауссовым-как с увеличением времени в D 2 O и повышения акцент на более т / г и шириной изотопного увеличится примерно на 50% кластеров (рис. 7). Как уже упоминалось во введении EX2 чаще всего наблюдается в HX-МС в нативных условиях и наблюдаемая скорость обмена пропорционально равновесия разворачивается постоянная К U и, следовательно, к термодинамической стабильности белка. Напротив, для валютного режима EX1 распределение ширина изотопных кластеров значительно возрастает и бимодальных или мультимодальных распределений интенсивности наблюдаются (см. рисунок 7) 25,27. Бимодальные распределения изотопов всегда указывают два или более различных видов молекулв анализе, которые являются потенциально интересным. Однако, есть два типа ловушек. Во-первых, изотоп кластер может состоять из пиков, происходящих из двух различных пептидов. Поэтому обязательно проверить спектры образца unexchanged для пептидов с аналогичным т / г и одинаковым зарядом. Такие пептиды обычно немного отличаются по времени удерживания и распределение интенсивности изотопных пиков изменяется со временем элюции. В масс-спектрометров высокого разрешения, изотопные пики, которые не принадлежат к той же пептида может быть также отличить по знаков после запятой значений M / Z. Во-вторых, перенос с предыдущей ВЭЖХ-МС перспективе наблюдается 28. Такой перенос появляется как nonexchanged видов и могут быть устранены путем пустых ВЭЖХ градиентных трасс между анализа трасс. Есть много причин для видимого режима EX1 обмена. 1) в Нх экспериментов в присутствии денатурирующих EX1 часто наблюдается 29. 2) самопроизвольные и искусственные, обратимым или необратимым осдр. или глобальный разворачивание белков вызывает EX1 поведение 7,30,31. 3) конформационных переходов, которые медленно по сравнению с HX вызванного оборота например подложки, гидролиз АТФ вызывают бимодальные распределения изотопов напоминающие EX1 валютного режима (Рисунок 7а) 22. 4) лиганд-индуцированные медленные конформационные переходы в импульсно-маркировки экспериментов также проявляют EX1, как подпись (рис. 7б) 22.

Интерпретация полученных данных в конечном счете то, что делает HX-МС такой сложной, но и мощная техника. Широкий знание динамики белков требуется пройти весь путь от наблюдаемых картин защиты / снятия защиты с механистической модели динамики белка. Тем не менее, что обеспечивает высокое качество данных HX-MS может быть сделано в течение относительно короткого периода времени и является очень воспроизводимые. Интерпретация данных четко выгоды от любой дополнительной информации о структуре белка инвестироватьigated. С другой стороны, HX-MS может указывать, какие части белка являются гибкими, которые могут должны быть удалены, чтобы облегчить кристаллизацию для определения структуры.

HX-МС это метод, который значительно прибыли от инноваций в масс-спектрометрии и хроматографии. Недавний прогресс в HX-MS является использование липидных nanodiscs для анализа мембранных белков, что дополнительно расширяется использование этого метода 32. Кроме того, использование передачи диссоциации электронов (ETD) и электронного захвата диссоциации (ECD) показывают большой потенциал для HX-МС, поскольку это увеличивает разрешение включены дейтрона на уровне отдельных аминокислот 11,12 33.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Нам нечего раскрывать.

Acknowledgments

Мы благодарим М. Boysen замечания по рукописи. Этот проект был профинансирован Deutsche Forschungsgemeinschaft (SFB638 и MA 1278/4-1 в MPM и кластера передового опыта: CellNetworks EXC 81/1). MPM является следователь кластера передового опыта: CellNetworks.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
maXis QTOF Bruker
nanoAcquity UPLC Waters Corp.
Shimadzu 10AD-VP Shimadzu
6-port Valve EPC6W with microelectric actuator Valco #EPC6W
Injection valve (manual) Rheodyne #7725
Poros AL20 media Applied Biosystems #1-6029-06
Poros R2 Applied Biosystems #1-1118-02
Pepsin Sigma #P6887 use fresh pepsin
Microbore (1 mm) IDEX #C-128
Microbore (2 mm) IDEX #C-130B
Acquity UPLC BEH C8 Column Waters Corp. #186002876
Thermomixer Eppendorf #5355000.011
Tubing (various diameters) IDEX
Fittings IDEX #PK-110 with PK-100

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Saibil, H. R. Conformational changes studied by cryo-electron microscopy. Nat. Struct. Biol. 7 (9), 711-714 (2000).
  2. Mittermaier, A., Kay, L. E. New tools provide new insights in NMR studies of protein dynamics. Science. 312 (5771), 224-228 (2006).
  3. Hoofnagle, A. N., Resing, K. A., Ahn, N. G. Protein analysis by hydrogen exchange mass spectrometry. Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 32, 1-25 (2003).
  4. Wales, T. E., Engen, J. R. Hydrogen exchange mass spectrometry for the analysis of protein dynamics. Mass. Spectrom. Rev. 25 (1), 158-170 (2006).
  5. Konermann, L., Pan, J., Liu, Y. -H. Hydrogen exchange mass spectrometry for studying protein structure and dynamics. Chem Soc. Rev. 40 (3), 1224-1210 (2011).
  6. Bai, Y., Milne, J. S., Mayne, L., Englander, S. W. Primary structure effects on peptide group hydrogen exchange. Proteins. 17 (1), 75-86 (1993).
  7. Rist, W., Jørgensen, T. J. D., Roepstorff, P., Bukau, B., Mayer, M. P. Mapping temperature-induced conformational changes in the Escherichia coli heat shock transcription factor sigma 32 by amide hydrogen exchange. The Journal of biological chemistry. 278 (51), 51415-51421 (1074).
  8. Englander, J. J., Rogero, J. R., Englander, S. W. Protein hydrogen exchange studied by the fragment separation method. Anal Biochem. 147 (1), 234-244 (1985).
  9. Zhang, Z., Smith, D. L. Determination of amide hydrogen exchange by mass spectrometry: a new tool for protein structure elucidation. Protein Sci. 2 (4), 522-531 (1993).
  10. Cravello, L., Lascoux, D., Forest, E. Use of different proteases working in acidic conditions to improve sequence coverage and resolution in hydrogen/deuterium exchange of large proteins. Rapid Commun. Mass Spectrom. : RCM. 17 (21), 2387-2393 (2003).
  11. Rand, K. D., Zehl, M., Jensen, O. N., Jørgensen, T. J. D. Protein hydrogen exchange measured at single-residue resolution by electron transfer dissociation mass spectrometry. Anal chem. 81 (14), 5577-5584 (2009).
  12. Pan, J., Han, J., Borchers, C. H., Konermann, L. Electron capture dissociation of electrosprayed protein ions for spatially resolved hydrogen exchange measurements. J. Am. Chem. Soc. 130 (35), 11574-11575 (2008).
  13. Yamada, N., Suzuki, E. -I., Hirayama, K. Identification of the interface of a large protein-protein complex using H/D exchange and Fourier transform ion cyclotron resonance mass spectrometry. Rapid Commun. Mass Spectrom. 16 (4), 293-299 (2002).
  14. Lee, T., Hoofnagle, A. N., et al. Docking motif interactions in MAP kinases revealed by hydrogen exchange mass spectrometry. Mol. Cell. 14 (1), 43-55 (2004).
  15. Hasan, A., Smith, D. L., Smith, J. B. Alpha-crystallin regions affected by adenosine 5'-triphosphate identified by hydrogen-deuterium exchange. Biochem. 41 (52), 15876-15882 (2002).
  16. Lanman, J., Lam, T. T., Emmett, M. R., Marshall, A. G., Sakalian, M., Prevelige, P. E. Key interactions in HIV-1 maturation identified by hydrogen-deuterium exchange. Nat. Struct. Mol. Biol. 11 (7), 676-677 (2004).
  17. Wang, L., Lane, L. C., Smith, D. L. Detecting structural changes in viral capsids by hydrogen exchange and mass spectrometry. Protein Sci. 10 (6), 1234-1243 (2001).
  18. Pan, H., Raza, A. S., Smith, D. L. Equilibrium and kinetic folding of rabbit muscle triosephosphate isomerase by hydrogen exchange mass spectrometry. J. Mol. Biol. 336 (5), 1251-1263 (2004).
  19. Mazon, H., Marcillat, O., Forest, E., Smith, D. L., Vial, C. Conformational dynamics of the GdmHCl-induced molten globule state of creatine kinase monitored by hydrogen exchange and mass spectrometry. Biochem. 43 (17), 5045-5054 (2004).
  20. Lanman, J., Lam, T. T., et al. Identification of novel interactions in HIV-1 capsid protein assembly by high-resolution mass spectrometry. J. Mol. Biol. 325 (4), 759-772 (2003).
  21. Rist, W., Graf, C., Bukau, B., Mayer, M. P. Amide hydrogen exchange reveals conformational changes in hsp70 chaperones important for allosteric regulation. J. Biol. chem. 281 (24), 16493-16501 (2006).
  22. Graf, C., Stankiewicz, M., Kramer, G., Mayer, M. P. Spatially and kinetically resolved changes in the conformational dynamics of the Hsp90 chaperone machine. EMBO J. 28 (5), 602-613 (2009).
  23. Lee, C. -T., Graf, C., Mayer, F. J., Richter, S. M., Mayer, M. P. Dynamics of the regulation of Hsp90 by the co-chaperone Sti1. EMBO J. 31 (6), 1518-1528 (2012).
  24. Lou, X., Kirchner, M., et al. Deuteration distribution estimation with improved sequence coverage for HX/MS experiments. Bioinformatics. 26 (12), 1535-1541 (2010).
  25. Kreshuk, A., Stankiewicz, M., Lou, X., Kirchner, M., Hamprecht, F. A., Mayer, M. P. Automated detection and analysis of bimodal isotope peak distributions in H/D exchange mass spectrometry using HeXicon. Intl. J. mass spectrom. 302 (1-3), 125-131 (2011).
  26. Walters, B. T., Ricciuti, A., Mayne, L., Englander, S. W. Minimizing back exchange in the hydrogen exchange-mass spectrometry experiment. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 23 (12), 2132-2139 (2012).
  27. Weis, D. D., Wales, T. E., Engen, J. R., Hotchko, M., Ten Eyck, L. F. Identification and characterization of EX1 kinetics in H/D exchange mass spectrometry by peak width analysis. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 17 (11), 1498-1509 (2006).
  28. Fang, J., Rand, K. D., Beuning, P. J., Engen, J. R. False EX1 signatures caused by sample carryover during HX MS analyses. Intl. J. Mass Spectrom. 302 (1-3), 19-25 (2011).
  29. Deng, Y., Smith, D. L. Identification of unfolding domains in large proteins by their unfolding rates. Biochem. 37 (18), 6256-6262 (1998).
  30. Wales, T. E., Engen, J. R. Partial unfolding of diverse SH3 domains on a wide timescale. J. Mol. Biol. 357 (5), 1592-1604 (2006).
  31. Pan, Y., Piyadasa, H., O'Neil, J. D., Konermann, L. Conformational dynamics of a membrane transport protein probed by h/d exchange and covalent labeling: the glycerol facilitator. J. Mol. Biol. 416 (3), 400-413 (2012).
  32. Hebling, C. M., Morgan, C. R., Stafford, D. W., Jorgenson, J. W., Rand, K. D., Engen, J. R. Conformational analysis of membrane proteins in phospholipid bilayer nanodiscs by hydrogen exchange mass spectrometry. Anal chem. 82 (13), 5415-5419 (2010).
  33. Abzalimov, R. R., Kaplan, D. A., Easterling, M. L., Kaltashov, I. A. Protein conformations can be probed in top-down HDX MS experiments utilizing electron transfer dissociation of protein ions without hydrogen scrambling. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 20 (8), 1514-1517 (2009).

Tags

Химия выпуск 81 Молекулярные Шапероны масс-спектрометры аминокислот пептидов белков ферментов коферментов динамики белков конформационные изменения allostery сворачивание белков вторичная структура масс-спектрометрия
Анализируя Динамика белков с использованием водорода валютный масс-спектрометрии
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Hentze, N., Mayer, M. P. Analyzing… More

Hentze, N., Mayer, M. P. Analyzing Protein Dynamics Using Hydrogen Exchange Mass Spectrometry. J. Vis. Exp. (81), e50839, doi:10.3791/50839 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter