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Chemistry

El análisis de dinámica de proteínas utilizando hidrógeno Intercambio de Espectrometría de Masas

Published: November 29, 2013 doi: 10.3791/50839
Automatic Translation
1, 1
1Zentrum für Molekulare Biologie der Universität Heidelberg (ZMBH), University of Heidelberg

Summary

Conformación de la proteína y la dinámica son claves para entender la relación entre estructura y función de proteínas. Intercambio de hidrógeno acoplada a espectrometría de masas de alta resolución es un método versátil para estudiar la dinámica conformacionales de proteínas, así como la caracterización de la proteína-ligando y proteína-proteína interacciones, incluidas las interfaces de contacto y los efectos alostéricos.

Abstract

Todos los procesos celulares dependen de la funcionalidad de las proteínas. Aunque la funcionalidad de una proteína dada es la consecuencia directa de su secuencia de aminoácidos única, que sólo se realiza por el plegamiento de la cadena de polipéptido en una única disposición tridimensional definido o más comúnmente en un conjunto de conformaciones interconverting. La investigación de la relación entre la conformación de la proteína y su función es, por tanto, esencial para una comprensión completa de cómo las proteínas son capaces de cumplir con su gran variedad de tareas. Una posibilidad para estudiar los cambios conformacionales una proteína experimenta mientras avanza a través de su ciclo funcional es hidrógeno H-1/2 H-intercambio en combinación con espectrometría de masas de alta resolución (HX-MS). HX-EM es un método versátil y robusta que añade una nueva dimensión a la información estructural obtenida por ejemplo, cristalografía. Se utiliza para estudiar el plegamiento de proteínas y el despliegue, la unión de pequeña molligandos ecule, las interacciones proteína-proteína, cambios conformacionales ligados a la catálisis enzimática y allostery. Además, HX-MS se utiliza a menudo cuando la cantidad de proteína es muy limitada o la cristalización de la proteína no es factible. Aquí les ofrecemos un protocolo general para el estudio de la dinámica de proteínas con HX-MS y describimos como un ejemplo de cómo mostrar la interfaz de interacción de dos proteínas en un complejo.

Introduction

El número de estructuras cristalinas de proteínas y complejos de proteínas aumentó rápidamente en los últimos años. Presentan instantáneas invaluables de la organización estructural de estas proteínas y proporcionan una base para el análisis de la estructura-función. Sin embargo, la dinámica de las proteínas y los cambios conformacionales, que son esenciales para sus funciones, rara vez se revelaron mediante cristalografía de rayos X. Cryo-microscopia electrónica, por otro lado, es capaz de capturar complejos de proteínas y de proteínas en diferentes conformaciones, pero en general no puede resolver cambios conformacionales a nivel de la estructura secundaria 1. Dinámica conformacional de proteínas en solución a detalles atómicos sólo pueden ser resueltas por RMN, pero este método todavía se limita a proteínas de tamaños relativamente pequeños (generalmente ≤ 30 kDa) y las necesidades de altas concentraciones de proteínas (≥ 100 micras), lo que dificulta experimentos con oligomerización o de agregación de proteínas propensas 2. Un método quees capaz de tender un puente entre la alta resolución de la cristalografía de rayos X y microscopía electrónica de crio-y que no está limitado por el tamaño de la proteína o la concentración es amida de hidrógeno-1 H / 2 H-intercambio (HX) en combinación con espectrometría de masas (MS). En los últimos años este método se ha desarrollado a una herramienta analítica valiosa para el análisis de la dinámica de proteínas, plegamiento de proteínas, estabilidad de la proteína y cambios conformacionales 3-5. La base molecular de este método es la naturaleza lábil de la cadena principal hidrógenos amida en proteínas, que se intercambio con átomos de deuterio cuando la proteína se coloca en un D2O solución. El posterior aumento de la masa de la proteína con el tiempo se mide con alta resolución de la EM.

En péptidos no estructurados cortos sólo HX depende de la temperatura, concentración de catalizador (OH -, H 3 O + es decir, pH, véase la Figura 3) y cadenas laterales de aminoácidos de residuos adyacentes debido a inductiva, gatoefectos alytic y estéricos. Estos efectos sobre el intrínseca tasa de intercambio químico K CH han sido elegantemente cuantificado por Bai et al. 6 y un programa está disponible (por cortesía de Z. Zhang), que calcula k CH para cada aminoácido dentro de un polipéptido dependiente de pH y la temperatura. A pH neutro y temperaturas ambiente K es CH en el orden de 10 1 -10 3 seg -1. En proteínas plegadas HX puede ser 2-9 ordenes de magnitud más lento debido principalmente a enlaces de hidrógeno en la estructura secundaria y en un grado menor debido al acceso restringido de hidratadas iones OH - al interior de una proteína fuertemente plegada. HX en las proteínas nativas, por tanto, implica desarrollo, intercambio químico parcial o global y replegado al estado nativo de acuerdo con la ecuación (1) y los tipos de cambio observados k obs dependen de la tasa de apertura op k, los k cl tasa de cierre y el intercambio químico intrínseca raTE CH K según la ecuación (2).

Ecuaciones 1-2
En condiciones de estado nativos K OP es mucho menor que K CH y se puede despreciar en el denominador. Hay dos regímenes cambiarios extremos llamados EX1 y EX2. Si el K CL es mucho menor que K CH (EX1) la tasa observada es prácticamente igual a la tasa de apertura y HX permite la observación inmediata del despliegue de un elemento estructural. Tal régimen de cambio, donde todos los protones amida de cambio a la vez después de la apertura del elemento estructural, es fácilmente observable en la EM por una distribución bimodal de los picos de los isótopos 7. Si k CL es mucho mayor que K CH (EX2) la tasa observada es proporcional a k CH mediante el cual la constante de proporcionalidad es igual a los equilibrios de plegado-desplegado constante K U = K OP cl. En estas condiciones, muchos eventos de apertura y cierre son necesarios antes de todo el intercambio de protones de amida de deuterones, dando lugar a un aumento gradual de la masa media, mientras que la distribución isotópica sigue siendo más o menos el mismo. El régimen EX2 permite la determinación de la energía libre de despliegue Delta G u y, por tanto, la estabilidad de un elemento estructural. Bajo condición de estado nativo régimen EX2 es más común. Aumento del pH y la adición de agentes caotrópicos puede cambiar el mecanismo de intercambio de EX1. Por lo tanto, HX-MS se puede utilizar para explorar termodinámico así como los parámetros cinéticos de plegamiento de la proteína y cambios conformacionales.

Como se mencionó anteriormente HX es intrínsecamente dependiente de pH y la temperatura y el cambio de la vida media de un protón completamente expuestos al disolvente del grupo amida del eje central es de entre 5-400 mseg a pH fisiológico (pH 7,6) y 30 ° C, pero 10 min a> 15 h con un promedio de> 2 horas a pH 2,9 y 0 °C (excepto para el protón de la primera enlace amida columna vertebral de un polipéptido, que intercambia con una vida media de ca. 1-2 min). Bajo tales condiciones lento intercambio es posible digerir la muestra usando proteasas (por ejemplo pepsina) que son activas en estas condiciones, con sin perder toda la información contenida en los deuterones incorporados. Desde la introducción de la digestión péptica en condiciones de intercambio lento, no sólo la cinética global HX de proteínas de longitud completa pueden ser analizados pero HX se pueden localizar en regiones específicas 8,9. La resolución espacial se limita actualmente al tamaño de los fragmentos generados pépticas, que es en general entre 10-30 residuos. Sin embargo, la superposición de fragmentos creados debido a la naturaleza no específica de la escisión por la pepsina podrían conducir a un aumento de la resolución espacial. Además, se encontraron varias otras proteasas para ser activa en condiciones de templado, sin embargo, mucho menos eficiente que la pepsina 10. Además increse de resolución espacial se puede llegar por la fragmentación de péptidos en fase gaseosa por métodos que conservan el patrón deuteración tales como la disociación de captura de electrones (ECD), la transferencia de electrones de disociación (ETD) y disociación multifotónica infrarroja (IRMPD) 11-13. Estas técnicas evitan la pérdida de la resolución espacial debido a la migración intramolecular de protones ("aleatorización"), que se observa por la disociación inducida por colisión (CID) la técnica de fragmentación más comúnmente utilizado. Sin embargo, estos métodos requieren la optimización para cada péptido individual y es por lo tanto todavía bastante difícil.

HX-MS se ha utilizado para analizar la proteína-ligando y proteína-proteína interacciones, incluyendo el montaje de la cápside viral 14-17. Proteína despliegue y replegamiento y se investigaron temperatura inducidas cambios conformacionales 7,18,19. La fosforilación y solo aminoácido conformacional relacionados mutación cambia 16,20 y nucleotSe analizaron los cambios ide-inducidos 21,22. Por lo tanto, este método parece idealmente adecuado para analizar el montaje y la dinámica de máquinas moleculares. Un candidato atractivo, cuyo mecanismo es de gran interés general, es el complejo chaperona Hsp90.

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Protocol

1. Preparación de disoluciones y Proteína muestras

  1. Preparar H 2 O buffer. Tampón estándar Uso Hsp90 (40 mM de HEPES / KOH, pH 7,5, KCl 50 mM, MgCl2 5 mM, glicerol al 10%) como H 2 O tampón.
    Nota: Si la muestra se dializó antes del análisis, utilizar el tampón de diálisis como H 2 O tampón. Es esencial que la junta tampón D 2 difiere de la H 2 O tampón sólo en el isótopo de hidrógeno. Tampones volátiles como NH 4 CO 3 o NH 4 componentes de acetato o de amortiguamiento no son adecuados!
  2. Preparar D2O tampón de liofilización de tampón estándar Hsp90 usando un concentrador de vacío. Después de la evaporación completa de H 2 O añadir pura D2O al tubo para alcanzar el volumen total inicial (por ejemplo, 1 ml de tampón con 15% de glicerol requiere la adición de 850 l D2O). Repita la evaporación completa de la memoria intermedia y volver a disolver el COM / tampón de salnentes en D 2 O 2x.
  3. Prepare el buffer de enfriamiento (0,4 M KH 2 PO 4 / H 3 PO 4 pH 2.2).
    Nota: Para mejorar la eficiencia de digerido péptico de proteínas muy estables 4 M hidrocloruro de guanidina y 0,5 M Tris (2-carboxietil) fosfina (TCEP-HCl) se pueden agregar.
  4. Preparar la muestra de control 100% (6 M hidrocloruro de guanidina, D 2 O). Añadir clorhidrato de guanidina a una alícuota de Hsp90 para llegar a una concentración final de 6 M. Completamente evaporar H 2 O de la muestra y añadir D2O al tubo para alcanzar el volumen total inicial (por ejemplo, 100 l de muestra con 10% de glicerol requieren la adición de 90 l D 2 O). Repita la evaporación completa de la memoria intermedia y volver a disolver los componentes del tampón / sal en D 2 O.
    Nota: 20-100 pmol de muestra se requiere para cada inyección. Preparar suficiente muestra para tener un control del 100% para todos los días de experimentos HX-MS.
  5. Preparar 50 pmol Hsp90 en 5 l de tampón estándar Hsp90.
    Nota: Se requiere una cantidad de 20-100 pmol de muestra por cada punto de datos en bruto. El volumen de la muestra en la reacción es de 1-5 l idealmente. Ajustar la concentración para adaptarse a estos requisitos. Cualquier tampón puede ser usado, siempre y cuando que no contiene detergentes o componentes volátiles.

2. Preparación de la pepsina inmovilizada en Aldehído perlas activadas

  1. Disolver 80 mg de pepsina fresco en 2 ml de citrato de sodio 50 mM (pH 5).
  2. Disolver 20 mg de cianoborohidruro de sodio, manejar con cuidado (muy tóxico!) En 1 ml de 2 M de Na 2 SO 4 y añade a la solución de pepsina.
  3. Incubar mezcla durante 10 min a temperatura ambiente mientras se agita suavemente (por ejemplo, agitador de cabeza).
  4. Añadir 600 mg de perlas con grupos aldehído inmovilizados a la mezcla y se incuba durante 5-10 min a temperatura ambiente.
  5. Añadir 2,2 ml de 2 M de Na 2 SO4 (pH 5) en 100 alícuotas cada 3 minutos durante una hora a la sal lentamente a cabo la pepsina. Mezcle suavemente la muestra entre las adiciones en un agitador de arriba a temperatura ambiente.
  6. Incubar las perlas de pepsina a 4 ° C durante 14-16 h / durante la noche en un agitador por encima.
  7. Se detiene la reacción mediante la adición de 1 ml de etanolamina 1 M y la incubación a temperatura ambiente durante 2 h.
  8. Centrifugar las perlas en un tubo Falcon de 50 ml a 500 rpm, desechar el sobrenadante y resuspender las perlas en ácido fórmico al 0,1%. Repita este paso 2x. Después de la última etapa de centrifugación, desechar el sobrenadante y el volumen estimado de cuentas. Añadir un volumen equivalente de ácido fórmico al 0,1% y se almacenan a 4 ° C.

3. Preparación de las columnas de Amida de hidrógeno de intercambio

  1. Utilice columnas de guardia con un diámetro interno de 1 mm para atrapar columnas y de 2 mm para las columnas de pepsina.
  2. Desenrosque un lado de la columna de seguridad y retire el filtro. Atornille embalaje funnEL sobre el extremo abierto de la columna. Utilice un adaptador de 1/16 pulgadas y el tubo para conectar una jeringa vacía (5 ml) a la salida del fondo de la columna. Asegúrese de arreglarlo hermética con columna de seguridad.
  3. Aplicar unas pocas gotas de material de bolas de suspensión en la parte superior del embudo. Tire del émbolo de la jeringa para aspirar la suspensión a través del embudo en la columna de la guardia. Aplicar más material de bolas suspensión sobre el embudo y continuar el procedimiento hasta que la columna de seguridad está completamente lleno de material de bolas. Retire el embudo y colocar el filtro y el anillo del filtro en el extremo abierto. Atornille la tapa de la columna en la columna de seguridad y retire la jeringa del otro lado. Cierre ambos extremos de las columnas de guardia con tapones para evitar la desecación de material de la columna.

4. Configuración del Sistema de Intercambio de hidrógeno Espectrometría de Masas (HX-MS)

  1. Conectar la columna de la trampa con el sistema de HPLC (Figura 1). Equilibrar la columna mediante el establecimiento de la tasa de flujo debombear A a 0,4 ml / min con 0,1% de ácido fórmico como disolvente. No conecte la columna de la pepsina, ni la columna de análisis todavía.
  2. Calibrar el espectrómetro de masas y conectar la salida de la HPLC para la fuente del espectrómetro de masas.

5. Determinación del rango dinámico de intercambio

  1. Preparar ultrapura disolvente A (ácido fórmico al 0,1% en agua) y el disolvente B ultrapura (ácido fórmico al 0,1% en acetonitrilo); disolventes mixtos listos están disponibles comercialmente. Purgar las bombas de HPLC. Configuración de la cromatografía y métodos de espectrometría de masas en el software de control por la elección de un programa con un gradiente de paso después de una etapa de desalación corto. Por larga duración Hsp90 utilice un etapa de desalación 1-2 min seguido de conmutación de la válvula de 6 puertos de desalar / LOAD para eluir y un gradiente de paso de 90% A/10 solvente% de disolvente B al 5% de disolvente A/95% de disolvente B. Antes de la inyección ajusta la válvula de inyección de carga y la válvula de 6 puertos para desalar / posición de carga.
    Nota: No utilice un pepsina o columna de análisis durante este experimento.
  2. Preparar 100-200 pmol de Hsp90 en 1-10 l H 2 O tampón y se incuba durante 10 minutos a 30 ° C. Añadir temperatura ajustada D2O tampón para llevar el volumen de muestra de hasta 100 l e incubar exactamente por un período de tiempo definido (por ejemplo, 10 seg, 100 seg, 1.000 segundos). Añadir 100 l de tampón de enfriamiento y mezclar pipeteando arriba y abajo. Inyectar la muestra de 200 l en el puerto de inyección de la válvula de inyección con una jeringa Hamilton. Inicie el programa de cromatografía y cambiar la válvula de inyección en posición INJECT. Después de 2 min cambiar la válvula de 6 puertos de desalar / CARGA para eluir. Repita esto por lo menos tres puntos temporales.
  3. Repita el paso 5.2, pero añadir 2 a 3 veces superior a Sti1 a la muestra antes de la Hsp90 de incubar durante 10 min a 30 ° C.
  4. Determine las masas de proteínas de larga duración por deconvolución de los espectros en el software de la espectrometría de masas. Calcular el número de incorpoed deuterones comparando el peso molecular de la Hsp90 de longitud completa con la masa observada después de cada carrera (por ejemplo, 10 seg, 100 seg, 1.000 seg).
  5. Trace los deuterones incorporados para Hsp90 en ausencia y presencia de Sti1 (eje Y) frente al tiempo (eje x). Determinar el punto de tiempo en el rango dinámico en el que la diferencia entre las dos curvas es máxima. Utilice este valor para el tiempo de incubación en D 2 O en la identificación de interfaz de Hsp90-Sti1 y la dinámica en el nivel de péptidos.

6. Determinación de péptica péptidos usando espectros MS / MS

  1. Conectar la columna de la pepsina y la columna analítica para el sistema.
  2. Configurar los parámetros de la cromatografía y espectrometría de masas en el software de control por la elección de tipo de degradado y el método de espectrometría de masas. Elija un gradiente de largo (por ejemplo, más de 90 min) para asegurar una buena resolución cromatográfica. Habilitar espectros MS / MS en el espectrómetro de masas.
    Nota: Buena resoluciónción en el HPLC y de alta precisión en masa tiene la más alta prioridad en este paso.
  3. Preparar 100-200 pmol de Hsp90 en 100 l de H 2 O buffer. Añadir 100 l de tampón de enfriamiento y mezclar pipeteando arriba y abajo. Inyectar la muestra de 200 l en el puerto de inyección de la válvula de inyección con una jeringa Hamilton. Inicie el programa de cromatografía y cambiar la válvula de inyección en posición INJECT. Después de 2 min cambiar la válvula de 6 puertos de desalar / CARGA Para eluir posición.
    Nota: Si más de una proteína se va a analizar en HX-EM (es decir, interfaces de interacción proteína-proteína) los péptidos para cada proteína se han determinado individualmente.
  4. Identificar péptidos pépticas de Hsp90 buscando una base de datos (es decir, la mascota) para los péptidos resultantes.
    Nota: Es posible utilizar una base de datos personalizada ya que el objetivo es determinar como muchos péptidos pépticas como sea posible y el análisis se realiza con la proteína purificada. Pureza de la muestra será hAVE a ser tenido en cuenta.
  5. Repita este paso sin MS / MS y con el gradiente que se utilizará para el experimento HX real. Para Hsp90 y Sti1 utilizan un gradiente de 10 min desde el 90% A/10 solvente% de disolvente B al 45% de disolvente A/55% de disolvente B.
    Nota: Los degradados se sitúan entre 5 a 15 min y altamente dependerá de la complejidad de la muestra y las especificaciones del sistema HX.
  6. Tiempo de retención Determinar los tiempos de retención de los péptidos identificados pépticas en 6,4 en el gradiente utilizado en 6.5 y cree una lista que comprende 1.) Secuencia del péptido 2.) El estado de carga de péptidos y 3.). Esto se utiliza para identificar cada péptido después de los experimentos HX.
    Nota: Tenga en cuenta que los péptidos con diferencias pequeñas m / z, estado de carga idéntica y tiempo de retención idéntico pueden ser una fuente de ambigüedad.

7. Identificación de las interfaces de interacción proteína-proteína

  1. Configure el gradiente y el método de espectrometría de masas en el control de software. Utilice un gradiente lineal de 10 min de 90% A/10% B solvente solvente de disolvente B. 45% de disolvente A/55% Carga un método de espectrometría de masas que se ha optimizado para la detección de masas entre 300-1,500 m / z, aunque la mayoría de los péptidos estarán por debajo de 1 000 km / z. Ajuste la válvula de inyección en posición de carga, la válvula de 6 puertos en la carga / DESALINIZACION Posición. Ajuste el caudal de la bomba de carga de 0,4 ml / min.
    Nota: La longitud y el tipo de gradiente se muestra dependiente y puede tener que ser optimizado. Gradientes más largos mejoran la resolución de la cromatografía, pero disminuyen la incorporación de deuterones en proteínas debido al respaldo de cambio. Los métodos elegidos tienen que ser la misma para todos los experimentos que se compararán.
  2. Para la referencia unexchanged preparar 20-100 pmol de Hsp90 en 100 l de H 2 O tampón. Añadir 100 l de tampón enfriado con hielo de enfriamiento, la pipeta arriba y abajo dos veces e inyectar la muestra en la válvula de inyección de HPLC. Inmediatamente iniciar el programa de cromatografía y swpicar la válvula de inyección en posición INJECT. Después de 2 min cambiar la válvula de 6 puertos de desalar / CARGA Para eluir posición. Haga esto por Hsp90 y Sti1 individual y de la mezcla de proteínas.
  3. Preparar 20-100 pmol de Hsp90 en un volumen de 1-5 l. Agregar temperatura ajustada D2O tampón para llevar el volumen de muestra de hasta 100 l e incubar exactamente por un período de tiempo definido (por ejemplo, 30 seg; para dinámica de conformación ver nota). Añadir 100 l de tampón enfriado con hielo de enfriamiento, la pipeta arriba y abajo dos veces y rápidamente inyectar los 200 l en la válvula de inyección de HPLC. Inmediatamente iniciar el programa de cromatografía y cambiar la válvula de inyección en posición INJECT. Después de 2 min cambiar la válvula de 6 puertos de desalar / CARGA Para eluir posición. Hacer esto para cada proteína individual, para determinar la incorporación de deuterones en cada péptido en ausencia de la proteína interactuar.
    Nota: Cuando se estudia la dinámica de conforMational cambios, repita el experimento con diferentes tiempos de incubación de Hsp90 en D 2 O buffer. Trate de cubrir una amplia escala de tiempo eligiendo los tiempos de incubación de manera logarítmica (por ejemplo, 10 segundos, 30 segundos, 100 segundos, 300 segundos, 1.000 segundos, etc.) D2O tampón de tampón y la muestra debe ser exactamente idénticos, excepto por el isótopo de hidrógeno.
  4. Preparar una cantidad igual de muestra de control 100% (20-100 pmol) y añadir D2O tampón para llevar el volumen de la muestra hasta 100 l. Añadir 100 l de tampón enfriado con hielo de enfriamiento, la pipeta arriba y abajo dos veces y rápidamente inyectar los 200 l en la válvula de inyección de HPLC. Inmediatamente iniciar el programa de cromatografía y cambiar la válvula de inyección en posición INJECT. Después de 2 min cambiar la válvula de 6 puertos de desalar / CARGA Para eluir posición.
  5. Para determinar la superficie de interacción de la mezcla de Hsp90 con un exceso por lo menos 2 veces de Sti1 para desplazar el equilibrio hacia el estado de enlace (véase la nota) e incubara la temperatura deseada hasta que la formación del complejo se encuentra en equilibrio. Añadir temperatura ajustada D2O tampón para llevar el volumen de muestra de hasta 100 l e incubar exactamente por un período de tiempo definido (por ejemplo, 30 segundos). Añadir 100 l de tampón enfriado con hielo de enfriamiento, la pipeta arriba y abajo dos veces y rápidamente inyectar en la válvula de inyección de HPLC. Después de 2 min cambiar la válvula de 6 puertos de desalar / CARGA Para eluir posición. Repita este experimento con 20-100 pmol de Sti1 y el exceso de Hsp90.
    Nota: Las concentraciones absolutas dependen de la constante de equilibrio de disociación de la interacción. Idealmente, después de la dilución en D2O la concentración de la proteína añadida en exceso debe ser de al menos 10 veces la K D (correspondiente a> 85% de la proteína concentrada inferior unido).
  6. Analizar los datos adquiridos con el software adecuado y el uso de los tiempos de retención determinados en el paso 6.5 para encontrar cada péptido en el análisis. CalculaTE el centroide de la distribución de isótopos para la proteína unexchanged (paso 7.2) y para los experimentos HX (paso 7.3).
    Nota: Aunque los patrones de isótopos de péptidos intercambiados aspecto diferente de sus contrapartes unexchanged, tanto el conocimiento sobre el estado de carga del péptido y la masa de alta precisión del espectrómetro de masas permite una fácil determinación de los centroides.
  7. Comparar incorporación de deuterones de proteína diana solo y con exceso de pareja de unión. Esto se puede hacer automáticamente con el software comercial o manualmente con un programa de hojas de cálculo. Los valores de la muestra de control de 100% denotan el intercambio máxima para cada péptido y se pueden utilizar para determinar la cantidad de D 2 O etiqueta perdió durante el experimento debido al intercambio de nuevo.

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Representative Results

Hsp90 es una chaperona molecular en levaduras y miembro de la familia Hsp90 chaperón. Al pasar por un ciclo complejo ATPasa asiste pasos plegables finales de muchos clientes de proteína. De plegado eficiente requiere transferencia de clientes de Hsp70 y la interacción del Sti1/Hop co-chaperona. Sti1 se une directamente a la Hsp90 y facilita cliente de unión por inhibición de la actividad ATPasa de la Hsp90. La interacción de Hsp90 con Sti1 se estudió recientemente usando HX-MS 23. Aquí presentamos los resultados representativos de los experimentos subyacentes siguiendo el protocolo anterior.

La interacción directa de proteína-proteína se ensayó mediante el etiquetado de la proteína compleja en equilibrio con D 2 O y la comparación de los espectros de péptido Sti1 en ausencia y presencia de Hsp90.The resultante parcela diferencia se puede ver en la Figura 5A (datos de 23). Los péptidos están orientados de arriba a abajo empezando por el extremo N-terminal. En su mayoría péptidos enTPR2A y TPR2b muestran una fuerte protección en presencia de Hsp90 (valores negativos para D + Hsp90 - D-Hsp90), que indica que estas regiones interactúan con Hsp90. La protección de TPR2A puede ser fácilmente racionalizado de la estructura cristalina de Sti1-TPR2A-TPR2b de complejo con un péptido que representa el C-terminal de MEEVD-con motivos de Hsp90 (Figura 5B). Tal protección clara en las interacciones proteína-proteína no siempre se observa. La protección en la Hsp90 en la presencia de Sti1 no es tan pronunciado y no como localizada como en Sti1 (Figuras 5C y 5D). Todos los péptidos muestran ligeramente mayor protección de la incorporación de deuterones en presencia de Sti1. Sti1 obviamente estabiliza Hsp90 a nivel mundial como ninguna región de la proteína muestra una mayor flexibilidad en presencia de Sti1. Nosotros sin embargo no podemos distinguir si esta incorporación reducida deuterón se origina de la interacción directa con Sti1 oa través de efectos alostéricos en la conformaciónHsp90. La información obtenida se reduce la interacción sitio putativo de unos péptidos (por ejemplo, péptido 43-62 de NBD). Experimentos adicionales tales como reticulación se utilizan comúnmente para confirmar los sitios de unión después de HX-MS 23. De la nota, la cobertura de secuencia de Hsp90 se reduce cuando se mide el complejo Hsp90-Sti1. Desde Sti1 se añadió en exceso de 3,5 veces la cantidad total teórico de péptidos en el análisis fue un poco de cuatro veces mayor que con solo Hsp90. Esto aumenta el riesgo de péptidos Sti1 eclipsando o superpuestas péptidos Hsp90 durante el análisis. Para optimizar para la cobertura de secuencia superior separación cromatográfica mejor parece ser el enfoque más prometedor.

Una posibilidad para estudiar la dinámica de las diferentes regiones de la proteína es el uso de etiquetado continuo HX-MS. Se trata de la incubación de la muestra de proteína equilibrada en D2O para diferentes períodos de tiempo y por lo tanto permite predicciones acerca de la estabilidad desegmentos de proteínas individuales. Figura 6 ilustra los espectros de péptido 43-62 de la NBD de Hsp90 en presencia y ausencia de un exceso de 3,5 veces de Sti1. Los tiempos de incubación fueron elegidos en una escala logarítmica (10 seg, 100 seg, y 1000 segundos) para obtener una buena cobertura a través de una ventana de tiempo de ancho. Los espectros de péptidos muestran una incorporación dependiente del tiempo de deuterio en la proteína que aumenta para los tiempos de incubación más largos. Para péptido 43-62 de cambio sigue el mecanismo de EX2 donde el k int << K CL. El grado de protección cambia a lo largo del tiempo de incubación, que muestra la mayor diferencia en el más corto tiempo de incubación y del tipo de cambio casi similar en el punto de tiempo más largo. Esto sugiere un menor grado de estabilización o una región de las interacciones dinámicas con disociación frecuente y reasociación. O bien la protección observada se debe a un tipo de cambio reducida general de protones amida en el péptido o el efecto se puede asignar a uno o dosprotones amida específicos que intercambian más lentamente en presencia de Sti1. En este caso, el último es mucho más probable como la estructura cristalina Hsp90 reveló esta región a ser un bucle expuesto en lugar de una estructura secundaria regular como α-hélices o β-hojas.

Es importante mencionar que el intercambio de nuevo no se ha restado de los datos muestran lo que implica que los efectos observados serán más pronunciados una vez normalizados al 100% de control.

Figura 1
Figura 1. Configuración HPLC para HX-MS. a) Configuración típica de un HX-MS para este compromiso. Las diferentes áreas de colores representan secciones mantenidas a diferentes temperaturas. La muestra se inyecta en el bucle de muestra de la válvula de inyección (en modo de carga, cian) y después de conmutar la válvula en "modo de inyectar" (negro) bombea a travésla columna de la pepsina en la válvula de 6 puertos. La columna de pepsina se mantiene más o menos a 10 º C para mejorar la actividad enzimática de la pepsina. La válvula de 6 puertos tiene dos modos, el "Modo de carga / Desalación" y "Modo elución" (véase b). Después de la desalación de la muestra de los péptidos se separan cromatográficamente con un gradiente de acetonitrilo en una columna analítica de fase inversa. Los péptidos se pulverizaron en el espectrómetro de masas con una fuente ESI. B) Modos de la válvula de 6 puertos. Directamente después de HX la válvula de 6 puertos está en "Carga / Desalinización Posición" para atrapar a los péptidos pépticas en la columna de la captura. Esto se continúa hasta por tres minutos para eliminar cualquier sal o compuestos de los buffers de reacción que podrían interferir con la espectrometría de masas. Después de esto, los interruptores de las válvulas de 6 puertos en "modo de elución" poner la columna trampa cargado en el conducto entre la bomba de gradiente y la columna analítica. Los péptidos pépticas atrapados ahora eluyen de la trampa coluMN y se separan en un gradiente de 0,1% de ácido fórmico fórmico acid/0.1% en acetonitrilo.

Figura 2
Figura 2. El flujo esquema de un experimento HX. 1) proteína diana se purifica y se suministra en tampones estándar sin detergente. 2) La proteína se digiere enzimáticamente con pepsina y los péptidos pépticas se identifican y se caracteriza por espectrometría de masas en tándem (EM / EM). Sólo después de la obtención de secuencias, estado de carga y tiempo de retención de la mayor cantidad de péptidos posible HX-MS puede realizarse con éxito. 3) Las condiciones experimentales se establecieron tales como la incubación de la proteína bajo condiciones específicas (de adición de compuesto de ligando / química o cambio en la temperatura o el pH. 4) HX se lleva a cabo mediante la dilución de la muestra de 1:10 o mayor en D2O tampón . El O tampón D 2 debe ser idéntica a la muestra de amortiguación a AVOefectos de amortiguamiento de identificación. A continuación, la muestra se incuba con exactitud por un período de tiempo definido. 5) Después de la incubación se inactivó la reacción y se inyecta en el sistema de HPLC-MS. La muestra es escinde enzimáticamente y los péptidos pépticas resultantes se separan en un gradiente de disolvente orgánico y se inyecta en el espectrómetro de masas. 6) Análisis de los espectros de péptido obtenido. Los centroides de los espectros de péptido se comparan bajo diferentes condiciones de reacción. Esto se puede hacer manualmente con el software adecuado o automáticamente por un programa de análisis HX.

Figura 3
Figura 3. Mecanismo de intercambio de hidrógeno. La reacción de intercambio de hidrógeno puede ser catalizada por base o ácido y por lo tanto es dependiente con un tipo de cambio mínimo entre pH 2,5 y 3 en función de las cadenas laterales de los residuos que flanquean el enlace amida 6 de pH. Dudesalado anillo y separación cromatográfica de péptidos, que se realiza en H 2 O-que contiene disolventes, deuterones incorporados se intercambian de nuevo para los protones de acuerdo con el mismo mecanismo ("intercambio de vuelta"). Por lo tanto, la optimización del sistema de disolventes utilizados y es crucial para reducir la pérdida de deuterones incorporados.

Figura 4
Figura 4. Principio de HX-MS. La unión de un ligando a los resultados de proteínas en la protección de la columna vertebral amida hidrógenos en el sitio de unión del disolvente circundante. Esto disminuye las tasas de cambio de protones afectados y disminuye la incorporación de deuterones. Debido a la diferencia de peso entre protones y deuterones es 1 Da, péptidos derivados de esta región de la proteína se muestran una menor m / z en la espectrometría de masas. La comparación de los espectros de péptidos de los experimentosen ausencia y presencia de pareja de unión revelará un desplazamiento del centro de gravedad de los espectros para bajar valores de m / z (evento de protección). Las regiones que presentan una protección importante después de la adición de pareja de unión son posibles sitios de unión. Dependiendo de la secuencia de la cobertura y la disponibilidad de sitios de unión de péptidos solapados pueden ser reducido a unos pocos aminoácidos.

La figura 5
Figura 5. Interacción de Hsp90 y Sti1. una diferencia parcela de incorporación deuterón en Sti1 en presencia de pareja de unión Hsp90 menos incorporación deuterón en Sti1 en ausencia de Hsp90 (Datos de 23.) b, la representación de dibujos animados de un fragmento de Sti1 comprende TPR2A y TPR2b (AP código 3UQ3) en complejo con un péptido, que representa el extremo C-terminal de MEEVD-motivo de la Hsp90. La caricatura es de color AccorDing para el número de protones amida protegida de la incorporación de deuterones como se indica. c, Diferencia parcela de Hsp90 en presencia de pareja de unión Sti1. Incorporación deuterón observada en Hsp90 después de 10 min de preincubación con 3.5x exceso Sti1 a 30 ° C y 30 seg; HX a la misma temperatura. El experimento se llevó a cabo por triplicado y se muestra el error estándar de la media para cada péptido. Valores negativos globales denotan incorporación reducida de deuterones y por lo tanto una mayor estabilidad global de Hsp90 en presencia de Sti1. Volver intercambio no fue considerado en este experimento. D, la representación de la historieta de la levadura Hsp90 (AP código 2CG9) de color de acuerdo al número de protones amida protegidos de incorporación deuterón como se indica en b. Haga clic aquí para ver más grande la figura .

Figura 6. Evolución temporal de la incorporación de deuterones en levadura Hsp90 en ausencia y presencia de Sti1. a, sin procesar espectros péptido del péptido 43-62 del dominio de unión a nucleótidos de Hsp90 después del intercambio el hidrógeno etiquetado continuo. 20 M Hsp90 se incubaron con 70 M Sti1 durante 10 min a 30 ° C para alcanzar el equilibrio y D 2 O etiquetado se realizó a 30 ° C durante 10 seg, 100 seg, y 1000 seg. Marcadores en forma de puntos rojas indican los centroides calculados para cada péptido. B, cinética de intercambio de péptido 43-62 en presencia y ausencia de 3.5x exceso de Sti1. Intercambio de espalda no se consideró en este experimento.

La figura 7
Figura 7. Ejemplos de espectros de péptidos con distribut bimodalde iones. una, Deuterón incorporación en E. coli Hsp90 en ausencia y en presencia de ATP (datos tomados de 22 supl. Figura 3). Espectros de péptido residuos 192-206 se muestra antes de la incubación en D 2 O (0% D), después de 30 segundos, 5 min, 10 min y 30 min de incubación en D 2 O, y el control del 100% (100% D) . En la ausencia de ATP (ATP) se observa un comportamiento de cambio EX2 típica. En presencia de ATP (ATP +) una protección fuerte se observó en 30 segundos y en 5 min y 10 min distribuciones bimodales de los picos isotópicos, indicando dos poblaciones de proteínas, una población similar a la del estado ATP unido y un segundo similar al el estado sin nucleótidos. En 30 min se observó ninguna diferencia entre ausencia y presencia de ATP. La distribución bimodal es muy probablemente causado por la hidrólisis de ATP y la transición a través del Estado sin nucleótidos con una mayor flexibilidad en este segmento de la proteína. Estos espectros se asemejan a unas clásicas regi cambio EX1mí. b, distribución bimodal de los picos isotópicos en experimentos HX pulso de etiquetado. E. coli Hsp90 se incubó en ausencia de ATP o en la presencia de ATP para 10-300 seg y posteriormente Pulse-etiquetado durante 10 segundos en D2O como se indica (datos tomados de 22 Figura 4A). Las distribuciones bimodales indican de nuevo dos poblaciones coexistentes de moléculas, un intercambio más rápidamente los protones amida de deuterones que el otro. ATP induce una transición lenta desde el más rápido intercambio en la conformación intercambio más lento.

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Discussion

La unión de una pareja de interacción de una proteína inevitablemente provoca cambios en la accesibilidad de disolvente en el sitio de unión. Además, muchas proteínas sufren cambios conformacionales a vinculantes dinámicos, que afectan a otras regiones de la interfaz de unión real. HX-MS es un método robusto para monitorear estos cambios y es incluso capaz de revelar los cambios conformacionales en proteínas en escalas de tiempo que otros métodos no pueden cubrir.

Para llevar a cabo con éxito HX-MS tres puntos son fundamentales: 1) una configuración óptima del sistema, 2) la ejecución precisa de procesamiento de la muestra y 3) el análisis de datos cuidadoso al asignar espectros péptido e interpretar los resultados.

La configuración del sistema

Desde la espectrometría de masas se utiliza para la detección de la incorporación de deuterones a los péptidos, las mismas precauciones con respecto a la preparación de la muestra se aplican para HX-MS. Los detergentes, sales y otros compuestos que interfieren con Sho espectrometría de masasuld evitarse o eliminarse antes del análisis. Mientras HX-MS permite el análisis de grandes complejos de proteínas, la mayor complejidad exige una mayor calidad de la separación de péptidos y espectrometría de masas. Optimización de las condiciones cromatográficas es clave para la obtención de datos de buena calidad. Esto implica la elección de los disolventes orgánicos de alta calidad, el material de fase inversa, así como la optimización de los gradientes y disolventes. El lavado de las columnas con disolventes orgánicos puede hacerse entre los experimentos y durante la noche para reducir la señal de fondo. Métodos de espectrometría de masas deberán ser optimizados para la detección de péptidos pépticas (entre 300-1,200 m / z). Espectrómetros de masas de alta resolución facilitan enormemente el análisis de datos, porque los picos isotópicos grupos que se superponen parcialmente procedentes de diferentes péptidos se pueden distinguir.

El procesamiento de las muestras es crucial para HX-MS. Por lo general, nuestros tampones y las muestras se centrifugan durante 10 min a 13.000 rpm (microcentrífuga) para eliminar los agregados y particulos. Además, varios filtros en línea se pueden instalar en el sistema de HPLC para evitar la obstrucción de las columnas. Desviaciones menores en D 2 O los tiempos de incubación pueden tener grandes efectos. Para las regiones de proteínas muy flexibles una diferencia de sólo unos segundos puede hacer la diferencia entre la no incorporación deuterón en absoluto y completo deuteración. Dado que la dinámica de proteínas, así como el tipo de cambio intrínseca son una función de la temperatura, la incubación de la muestra y tampones están estrechamente temperatura controlada. Es ventajoso repetir siempre la secuencia exacta de pasos para cada experimento. Si se ejecuta correctamente el error entre dos experimentos será relativamente pequeño. Hoy en día, los sistemas automatizados para HX-MS están disponibles comercialmente y reducir los retos de procesamiento de la muestra.

Análisis de los datos

El paso más crítico en HX-MS es el análisis de los datos, en particular la asignación de los espectros de péptidos y determinación de los niveles de deuteración. Thsalida E de HX-MS es un perfil de elución del gradiente cromatográfico que contiene un gran número de espectros de péptido. La tarea operadores es asignar estos espectros a los péptidos identificados por MS / MS en el paso 6) del protocolo. Esto puede ser un poco difícil, ya que los espectros se puede cambiar de manera significativa hacia una mayor m / z después de HX. También el solapamiento parcial de los espectros puede complicar la asignación de los péptidos. En este caso el uso de espectrómetros de masas de alta resolución con alta precisión la masa da sus frutos, ya que a menudo pueden resolver péptidos superpuestos. Las diferencias en la incorporación deuterón se calculan sobre la base de los centroides de los espectros de péptidos. Los centroides se pueden determinar: 1) manualmente mediante el marcado de cada pico isotópica de un espectro de péptido y transferir sus valores de intensidad y m / z en un programa de hoja de cálculo (por ejemplo, Excel, Microsoft) y calculando el centroide o 2) con software diseñado para asignar los picos isotópicos que pertenece a un péptido identificado y para calcular lacentroides automáticamente (por ejemplo HDExaminer, Sierra Analytics o HeXicon 24,25).

Optimización de HX-MS

Si el número de péptidos evaluables es demasiado bajo, hay varias otras posibilidades para optimizar el experimento: 1) la optimización de la cromatografía (disolventes, longitud / forma de gradiente, el uso de material de fase inversa diferente) o 2) cambiando la escisión enzimática de la proteína (proteasa alternativa, más largo / más corto tiempo de incubación con pepsina, la adición de agentes desnaturalizantes a la memoria intermedia de enfriamiento rápido). Ambos parámetros cambian el comportamiento de elución de péptidos ya que o bien alteran la piscina péptido en sí o separación por HPLC. Ambos enfoques de optimización vienen en el precio de la necesidad de recaracterizar péptidos. Otras proteasas se producen diferentes péptidos que tienen que ser identificado por MS / MS y caracterizado como se describe en el paso 6.6). Cambio de las condiciones de cromatografía no alterará el péptido piscina pero la retención de times de los péptidos individuales. Los tiempos de retención y luego tienen que ser redeterminación como en el paso 6.5). Cabe mencionar que los tiempos de retención más altos siempre disminuirán la cantidad de marcador detectable como la espalda de cambio aumenta a tiempos de retención más largos. La normalización de los datos en el control del 100% es la mejor manera de lidiar con el cambio de vuelta. Intercambio de alto conduce a una pérdida de deuterones incorporados y por lo tanto la señal. Es muy recomendable para reducir la cantidad de monedas de nuevo a un mínimo. Cabe señalar que las diferentes configuraciones de HX-MS tendrán tasas divergentes de intercambio de nuevo, en función del hardware, la composición de los tampones y disolventes utilizados y el tipo de gradientes que se utilizan 26.

Interpretación de los Datos

Cuando se analizan los datos, la distribución de la intensidad de los picos isotópicos necesita ser evaluada cuidadosamente, ya que puede dar indicaciones para el mecanismo de intercambio. Para los péptidos con una masa inferiorde 2.000 Da las intensidades de los picos isotópicos de la muestra unexchanged es generalmente asimétrica con intensidades más altas para la monoisotope o el primer pico de isótopos superior. Para el régimen de cambio EX2 esta distribución de intensidad asimétrica convierte gaussiano con el aumento de tiempo en D2O e incrementando cambio a mayor m / Z y la anchura del aumento de clúster isotópica en alrededor de 50% (Figura 7). Como se mencionó en la introducción EX2 se observa más comúnmente en HX-MS bajo condiciones nativas y la velocidad observada de cambio es proporcional a la constante de equilibrio K despliegue u y, por tanto, a la estabilidad termodinámica de la proteína. En contraste, para el régimen cambiario EX1 se observó la distribución anchura de las isotópicas aumenta significativamente en racimo y distribuciones de intensidad bimodales o multimodales (ver Figura 7) 25,27. Distribuciones bimodales de isótopos siempre indican dos o más especies diferentes de moléculasen el análisis, que son potencialmente interesantes. Sin embargo, hay dos tipos de trampas. En primer lugar, el grupo de isótopos puede estar compuesto de picos procedentes de dos péptidos diferentes. Por lo tanto, es obligatorio para comprobar los espectros de la muestra unexchanged para péptidos con similares m / z y carga idéntica. Tales péptidos generalmente difieren ligeramente en el tiempo de retención y la distribución de intensidad de los picos isotópicos varía con el tiempo de elución. En los espectrómetros de masas de alta resolución, picos isotópicos que no pertenecen a la misma péptido también pueden ser distinguidos por los decimales de los valores de m / z. En segundo lugar, el arrastre de una ejecución previa de HPLC-MS se observa 28. Tal prórroga aparece especies como nonexchanged y puede ser eliminado por blanco carreras de gradiente de HPLC entre ejecuciones de análisis. Hay muchas razones para régimen cambiario EX1 aparente. 1) En los experimentos de HX en la presencia de desnaturalizantes EX1 es observado con frecuencia 29. 2) loc espontáneo o inducido, reversible o irreversibleo global al desarrollo de proteínas provoca EX1 comportamiento 7,30,31. 3) las transiciones conformacionales que son lentos en comparación con HX causado por el volumen de negocios por ejemplo, sustrato, la hidrólisis de ATP provoca distribuciones bimodales de isótopos que se asemejan régimen cambiario EX1 (Figura 7) 22. 4) transiciones conformacionales inducidos por ligando lentos en los experimentos de pulso-etiquetado también presentan una firma-EX1 como (Figura 7b) 22.

La interpretación de los datos obtenidos es finalmente lo que hace HX-MS de una técnica tan difícil, pero también de gran alcance. Se requiere un amplio conocimiento de la dinámica de proteínas para llegar hasta el final de los patrones de protección / desprotección observados a un modelo mecanicista de la dinámica de las proteínas. No obstante, la producción de alta calidad de los datos HX-MS se pueden hacer dentro de relativamente poco tiempo y es altamente reproducible. La interpretación de los datos se beneficia claramente de cualquier información adicional sobre la estructura de la proteína de invertirigated. Por otro lado, HX-MS puede indicar qué partes de una proteína son flexibles, que puede tener que ser eliminado para facilitar la cristalización para la determinación estructural.

HX-MS es un método que se beneficia en gran medida por las innovaciones en la espectrometría de masas y cromatografía. Un avance reciente en HX-MS es el uso de nanodiscos de lípidos para el análisis de proteínas de membrana que amplía aún más el uso de esta técnica 32. También el uso de disociación transferencia de electrones (ETD) y captura de electrones de disociación (ECD) muestran un fuerte potencial para HX-MS a medida que aumenta la resolución de deuterones incorporado al nivel de aminoácidos individuales 11,12 33.

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Disclosures

No tenemos nada que revelar.

Acknowledgments

Damos las gracias a M. Boysen para comentarios sobre el manuscrito. Este proyecto fue financiado por la Deutsche Forschungsgemeinschaft (SFB638 y MA 1278/4-1 a MPM, y Cluster de Excelencia: CellNetworks EXC 81/1). MPM es investigador del Cluster de Excelencia: CellNetworks.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
maXis QTOF Bruker
nanoAcquity UPLC Waters Corp.
Shimadzu 10AD-VP Shimadzu
6-port Valve EPC6W with microelectric actuator Valco #EPC6W
Injection valve (manual) Rheodyne #7725
Poros AL20 media Applied Biosystems #1-6029-06
Poros R2 Applied Biosystems #1-1118-02
Pepsin Sigma #P6887 use fresh pepsin
Microbore (1 mm) IDEX #C-128
Microbore (2 mm) IDEX #C-130B
Acquity UPLC BEH C8 Column Waters Corp. #186002876
Thermomixer Eppendorf #5355000.011
Tubing (various diameters) IDEX
Fittings IDEX #PK-110 with PK-100

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References

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Hentze, N., Mayer, M. P. Analyzing Protein Dynamics Using Hydrogen Exchange Mass Spectrometry. J. Vis. Exp. (81), e50839, doi:10.3791/50839 (2013).

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