Summary
我々は、表面上にBMP-2の効率的な固定化を達成するための方法を記載している。我々のアプローチは、その遊離アミン残基を介してBMP-2の共有結合を達成するために、自己組織化単分子膜の形成に基づく。この方法は、細胞膜でのシグナル伝達を研究するための便利なツールです。
Abstract
骨形成タンパク質2（BMP-2）は、骨組織の細胞外マトリックス中に埋め込まれた成長因子である。このようにして治癒およびデノボ骨形成を刺激する骨芽細胞への間葉系細胞の分化のトリガーとしてBMP-2作用する。足場と組み合わせた組換えヒトBMP-2（のrhBMP-2）の臨床使用は、プレゼンテーションモードに基づいて、最近の論争を調達していると量が送達される。ここで紹介するプロトコルは、細胞へのin vitroでの研究のために、BMP-2を実現するための簡単で効率的な方法を提供します。私たちは、ヘテロ二官能性リンカーからなる自己組織化単分子膜を形成する方法を説明し、のrhBMP-2の共有結合固定化を得るために、その後の結合工程を示す。このアプローチでは、タンパク質の生物学的活性を維持しながら、BMP-2の持続的な提示を実現することができる。実際には、BMP-2の表面固定化は、非特異的な広告を防ぐことによって、ターゲットを絞った調査を可能にするorption、成長因子の量を低減しつつ、最も顕著には、表面からの制御されない放出を阻害する。細胞は、共有結合で固定化したrhBMP-2を提示する表面に露出しているときにBMP-2によって引き起こさ両方短期および長期のシグナル伝達事象は、BMP-2刺激に対する細胞応答に関するin vitro研究のためのこのアプローチが適して、行われている。
Introduction
骨形成タンパク質2（BMP-2）は、 デノボ骨形成ならびに胚発生および成体のホメオスタシス1-3中のいくつかの組織の調節因子の誘導物質としてトランスフォーミング成長因子（TGF-β）ファミリーの作用のメンバーである。 生物学的に活性なホモ二量体のBMP-2タンパク質の各単量体は、非常にすべてのBMP 4に保存されている「システインノット」モチーフを、含まれています。第七のシステインは二つのモノマー5,6間の分子間結合を形成する、二量体化に関与しているのに対し、7個のシステイン残基の六つは、各単量体を安定化する分子内ジスルフィド結合を形成する。この高度に保存されたシステインノットは、BMP-2タンパク質の三次元構造を定義し、熱、変性剤及び酸性pH 7-9に対する抵抗としてのそのユニークな特性を決定する。 BMP-2は、それによってシグナル伝達を誘導する、セリン/スレオニンキナーゼ膜貫通受容体に結合する
骨形態では、BMP-2は、このように治癒および骨のデノボ形成を刺激、骨芽細胞への間葉系幹細胞の分化を誘導する。現在、組換え的にBMP-2は、骨折したサイトの治癒を促進するために臨床応用されている表現。骨組織工学における一般的な方法は、局所送達システムと比較して低侵襲性で注射可能な成長因子の使用である。しかしながら、 インビボ研究と臨床応用が示されているその短い生物学的半減期、非特異的locのalizationおよびBMP-2の迅速な局所的クリアランスは、いくつかの、地元の異所性および全身の問題15につながる可能性があります。従って、効果的なプレゼンテーションを得るために、材料内又は上にBMP-2の捕捉または固定化は、標的部位でのそのローカルおよび持続送達のために必要である。持続的な送達は、物理的捕捉、吸着またはイオン錯体16のような非共有結合性の保持の手法を用いて達成することができる。しかしながら、分子17の変性における表面へのタンパク質の非特異的吸着がよい結果が知られている。増殖因子の共有結合のために、支持体の種類は、過去10年間にわたって開発されてきた。例えば、タンパク質のアミノ基またはカルボキシル基を標的とする二官能性連結分子の使用は、必ずしも固定化を達成するために、タンパク質の修飾を必要としないアプローチの一種である。実際には、一方のタンパク質修飾は、タンパク質の配向を制御するという利点を提供人工的なドメイン、ペプチドタグおよび部位特異的鎖の導入は、成長の生物学的活性は、17因子変更することができる。従って、原因支持材料との相互作用のために変性を回避するために、表面が所望の因子18のカップリングに続いて、連結分子の自己組織化単分子膜（SAM）を用いて、例えば、予め官能化することができる。我々は、その遊離アミン残基を標的とすることによって共有結合的に表面にBMP-2を固定化するSAMベースのアプローチを使用して、固定化タンパク質がその短期および長期の生物学的活性の19の両方を保持することが示されている。このプロトコルは、細胞膜で発生し、骨形成シグナルを担当する細胞内シグナル伝達を調節するメカニズムに関するin vitro試験のための細胞にBMP-2を実現するための簡単で効率的な方法を提供します。
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Protocol
1。 11-Mercaptoundecanoyl-N-ヒドロキシスクシンイミドエステル（MU-NHS）の合成
- 室温（RT）で40 mlのジクロロメタン（PA）中の10 mlのアセトン（PA）（ジメチルアミノ）ピリジン1gの11 -メルカプトウンデカン酸- 500mgのN-ヒドロキシスクシンイミドの溶液及び30mgの4滴ずつ加える。
- 0℃に反応液を冷却し、（窒素雰囲気下）ジクロロメタン10mlを滴下1.1グラムN、N ' -ジシクロヘキシルカルボジイミドを加える。 1時間低温で反応を維持し、次いで室温で一晩撹拌する。
- 沈殿物を濾過し、減圧下で乾燥させます。 1:1の割合で石油ベンゼン、酢酸エチル（PA）を用いるフラッシュクロマトグラフィーによって生成物を精製する。
2。均質な金層の作製
- 精密ワイプとし、酢酸エチル（PA）およびメタノール（PA）の1:1混合物を含有する溶液中で5分間超音波処理して清浄なガラスカバースリップ。 RinsE基質メタノールで、窒素気流下で乾燥させます。
- スパッタコーティング装置ではクリーンな基板を配置します。チャンバを排気。 60秒間スパッタ法により、クロムターゲットから最上部のクロム酸化物層を除去。金属線と40 nmの金の層を塗布し、その後10nmのクロム層でコートして下にサンプルを置きます。
3。 BMP-2の表面固定化
- 約1mMの最終濃度までNにおけるMU-NHS、N-dimethlyformamide（DMF）に溶解し、窒素雰囲気下で4時間RTにてMU-NHS溶液中に金基板をインキュベートする。
- 2分間DMF中で超音波処理表面は、DMF、MeOHで洗浄し、窒素気流下で乾燥させます。
- 100μg/ mlの（-80℃で保存アリコート）の濃度で滅菌した4 mMのHCl中のrhBMP-2のストック溶液を準備します。ワーキング希釈液（3.5μg/ ml）をするために、PBS / NaClを（PBSで1 M NaClを含む）と、中のストック溶液を希釈使用直前にpH8.5にdjust。
- 一晩4℃でのrhBMP-2作業溶液中にMU-NHS官能表面をインキュベートする。インキュベーション上清を取り除きます。超音波処理は、2分間、PBS / NaCl中に表面および滅菌PBS / NaClで3回洗う。
4。表面特性化
- 抗体の非特異的吸着をブロックするために、抗BMP-2抗体（1:100、1％（重量/体積とのインキュベーション、続いてRTで1時間PBS溶液中の5％BSA（w / v）ので表面をインキュベートするRTで1時間）BSA / PBS溶液）。 PBSおよび30秒間の超音波処理で二回表面を洗浄します。
- 次いで、PBSで二回洗浄し、RTで30分間HRP結合二次抗体（1:1,000、1％（w / v）のBSA / PBS溶液）で基質をインキュベートする。
- プレートリーダーを用いて570nmでのHRP酵素活性を測定するためにAmplifluレッドアッセイを使用する。
5。生物学的活性の解析
- シード1×10 6ウェルPLにおけるウェルあたり5マウスC2C12筋芽細胞10％FBS、1％ペニシリン/ストレプトマイシンおよび37℃/ 5％CO 2で24時間、それらをインキュベートを補充したピルビン酸塩を含有する高グルコースDMEMからなる増殖培地中でのATE。
- 固定化されたBMP-2で飾られた表面に播種する前3-5時間無血清DMEMで細胞を餓死。
- 短期的なシグナル誘導の調査のために、200μlの新鮮な無血清DMEMで培地を交換し、細胞上に固定化BMP-2の表面に配置します。表面は傷を避けるために、先端の細いピンセットで処理する必要があります。
- 優しく表面を削除し、ピペットで培地を吸引、PBSで2回細胞を洗浄。細胞応答の分析に進みます。
- 長期の生物学的活性の分析のため、細胞をプレート低血清条件（2％FBS）で表面及び37℃/ 5％CO 2で培養して上に6日間。
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Representative Results
それは生物学的に不特定の化学的な調整可能なシステムを提供していますので、我々のセットアップでは、金を賦形剤として選ばれた。さらに、自己組織化単分子膜の適用は、多くの利点を伴う。それらの官能末端基をさらに修正することができながら、SAMは自然に、金属や欠陥の少ないフォーム単層上での「ヘッドグループ」を経由して吸着する。こうして彼らは、制御された、まだ適応性の高い方法で20で、インターフェイスの特性を調整するためのプラットフォームを提供します。
金でコーティングされた表面上のBMP-2の固定化のために、我々は、2段階のアプローチを使用した：1）タンパク質（ 図1参照）とリンカーとを反応さ）の金層にMU-NHSリンカーと結合して、[2。のrhBMP-2の結合を証明するために、我々は、酵素免疫測定法を使用した。このアッセイにおいて、固定化されたrhBMP-2を提示する表面は、BMP-2特異的抗体およびHRPとコンジュゲート二次抗体と共にインキュベートした。後者の結合は、Dが可能Amplifluレッド溶液を使用してetermined。過酸化水素の存在下で、HRPは、蛍光化合物レゾルフィンに無色Ampliflu赤（10 - アセチル-3,7 - ジヒドロキシフェノキサジン）への変換を触媒する。我々は前に官能化表面上から接着細胞に近づいた後のrhBMP-2（IBMP-2）固定化された表面を検出しました。 AmplifluレッドアッセイとのrhBMPを検出するために、サンプルは、いくつかのインキュベーションステップや治療の対象となりますのでご注意ください。したがって、細胞刺激の前後で同一面を調査することは不可能である。 図2Aは、抗BMP-2 IgGによって認識立体配座で表面へのrhBMP-2の正常な結合を示している。 図2Bは IBMPを示す従来HRPイムノアッセイに30分間細胞を刺激するために使用された2面。偶数細胞刺激後のタンパク質を表面上で検出される。
固定化されたRHを提示する表面への細胞応答BMP-2を評価し、無処理の金基板（陰性対照）の効果と比較した。短期のシグナル伝達の分析上の接着プロセスの影響を最小限にするために、特別なセットアップは、細胞刺激のために開発された。ここで、C2C12細胞を、頂部から接近のrhBMP-2の官能化表面により30分間刺激した。マウス筋芽細胞株C2C12が広く筋肉組織における骨形成の間の骨形成分化の初期段階を研究するためのモデル系として使用される多能性間葉系前駆細胞株である。このモデルでは、BMP-2は多核筋管への細胞の分化を阻害し、骨芽細胞の表現型を誘導する21。 BMP-2シグナル伝達経路の下流にあるレポーターのSmad 1/5/8の活性化は、ウェスタンブロッティングにより分析する。 図3Aに示すように、1/5/8のSmadのリン酸化が全く起こらないものの、Smadのリン酸化は、IBMP-2による30分間の刺激の後に観察される細胞内の未処理の金サンプルに暴露した。この結果は、固定化方法は、BMP-2、短期的活性を変化させたSmadシグナル伝達の初期段階をトリガしないことを示している。
IBMP-2は長期の骨形成分化に影響を与えるかどうかを決定するために、アルカリホスファターゼ（ALP）の発現レベルは、骨形成マーカーは、比色アッセイによって調べた。 C2C12細胞のALP活性は、無地金（対照）およびIBMP-2表面上で6日間細胞をインキュベートした後に測定した。 IBMP-2表面上で培養された細胞の溶解物中のALP活性は、対照（ 図3B）と比較して有意に高い吸収性を示しています。この結果は、IBMP-2はC2C12細胞における骨形成マーカーのALPの発現を誘導することが明らかになった。この細胞株は、それによって筋管を形成し、特徴的なタンパク質を発現する筋原性、低血清条件下でコンフルエントに達する時に分化することが知られている。しかしながら、BMP-2による処置は、シフトを引き起こすしたがって、筋管の形成を抑制し、骨芽への筋芽細胞から分化経路、。筋形成にIBMP-2の効果を調べるために、C2C12細胞を、金（対照）または官能表面および分化（低血清）の条件下で培養された上に直接播種した。 6日後、ミオシン重鎖（MHC）の染色を行った。 図3Cに示すように、C2C12細胞を、IBMP-2の存在下ではなく、金基板上のMHC陽性筋管を形成することができない。
図1。金表面上のrhBMP-2の固定化方法のスキーム。ガラスカバースリップを金層で被覆され、その後、NHS官能化自己組織化単分子膜（SAM）で得られたヘテロ二官能性リンカー（MU-NHS）と共にインキュベートした。 BMP-2の第一級アミンは、COにつながるのリンカーと反応valently基板上にタンパク質を固定化した。 大きな画像を見るにはここをクリックしてください 。
図2。表面に結合したrhBMP-2（A）の前、ならびに（B）細胞刺激実験の後、酵素免疫測定法によって検出することができる。固定化のrhBMP-2 Ampliflu赤の比色アッセイを用いて定量した。吸収は570nmで測定し、データを（金表面無処理）値を制御するために正規化した。エラーバーは、平均のn> 3の標準偏差を表す。
図3。固定化されたrhBMP-2は、生物学的に活性なままであるとして、短期を誘導する並びに長期のシグナル伝達事象は、（A）C2C12細胞は、共有結合で固定化したrhBMP-2（IBMP-2）の上部から接近すると、金表面（対照）および表面への曝露によって30分間刺激した。細胞溶解後、試料をp-Smad1/5/8及びβ-アクチンについて免疫ブロットした。（B）アルカリホスファターゼ（ALP）の酵素活性は、C2C12細胞の骨形成分化を示し、6日間のインキュベーション後の細胞溶解物から測定したコントロールまたはIBMP-2表面上の期間であった。 ALP活性は、405nmでの吸光度として測定した。棒グラフは60分間の反応後に得られたデータを示しています。エラーバーは、0.01 *はp <、標準偏差を示す、n = 3である。（C）C2C12細胞は、筋形成を可能にするために、低血清条件下で6日間培養し、指示面上に播種した。画像はミオシン重鎖多核の筋管の体（MHC）染色（緑）およびDAPI核染色（青）を示す。画像倍率20倍。
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Discussion
このプロトコルでは、生物活性のrhBMP-2で官能化表面の調製が記載されている。 ;のrhBMP-2タンパク質の2）の共有結合固定金表面上の二官能性リンカーの自己集合単分子層（SAM）の1）初期形成：このアプローチは、2つのステップを含む。以前の研究では、二官能性リンカーおよび成長因子の有効な結合を検証し、表面固定化のrhBMP-2は、その生物学的活性19を維持することを実証した。固定化された形で提示成長因子の生物活性はまた、タンパク質の放出およびそれらのその後の内在化は、細胞刺激24,25に必須でないことを示す、他の研究で示されている。細胞膜22,2であるため、異なるタイプの受容体の増強された占有率の有効投与量を維持しながら、実際には、成長因子の共有結合固定化は、標的細胞の持続的な刺激を可能にする3,26-28。
固定化されたrhBMP-2、気を提示する表面の調製のために全体の手順を通して表面の処理にとのrhBMP-2溶液を製造する際に注意が必要です。カバーガラスは、清潔で乾燥しなければならず、欠陥や不純物の兆候は見えないはずです。ピンセットやピペットで表面に傷を付けすることは避けるべきである。のrhBMP-2を用いた表面機能化工程のためには、担体表面上の望ましくない固定化を避けるために、製剤中の添加ウシ血清アルブミンなしで担体を含まない組換えタンパク質、 すなわち、を使用することが必須である。のrhBMP-2株（100μg/ mlの）を、4mMのHClに溶解される。表面はのrhBMP-2溶液とインキュベートされる場合、pHは、表面結合リンカーのNHS基とタンパク質のアミノ基との反応を増強するためにわずかにアルカリ性のpHを中性に調整されるべきである。 pHが低すぎる場合は、ウィット反応することができる前に、NHS基が加水分解されるかもしれない時間、タンパク質のアミノ基。当社は、1MのNaCl 29を含むPBSを使用して、在庫からのrhBMP-2を追加し、KOH（10 mM）を用いてpHを調整してください。
1）私たちは2段階のアプローチを確立した。2）私たちは、表面からの距離を取得するために適当なリンカーを使用し、その上で、主要な干渉せずにタンパク質を結合するには、次のようにあるため、このプロトコルでは、我々は表面上の生物活性のrhBMP-2を正常に固定化を達成受容体との相互作用。アミン反応性アルカンチオール、11 - mercaptoundecanoyl-N-ヒドロキシスクシンイミドエステル（MU-NHS）、第一工程で金基板につながれた。アルカンチオール自己組織化する高度に秩序化単分子膜を形成し、金のような金属上で、彼らはリンカー分子30〜32の様々な表面の装飾を容易にします。 SAMは、それによって、変性32のリスクを最小限に抑え、固体表面との直接接触から生体分子を遮蔽する。さらに、リンカーの長さもREAを決定SAMのctivity。少なくとも11個の炭素原子からなるリンカーのNHS基は、MU-NHSのように、短いリンカー34への結合と比較して増加したタンパク質固定化をもたらす、よりアクセス可能である。のrhBMP-2の固定化は、タンパク質34のリジン残基によりNHS基の置換を介して起こる。単に立体環境を考慮した、表面固定NHS基の反応は、ほとんど柔軟N-末端残基35で行われる。他のリガンドのために示されているようしかし、長さとリンカーの柔軟性は、このように不利な方向36,37の補償、そうでない立体的結合部位妨げとの相互作用を可能にするかもしれません。未発表の研究では、二段階固定化戦略にワンステップを比較した。 、タンパク質およびリンカーの両方を含有する溶液を用いて、逐次表面はリンカーとタンパク質の結合との間の比較は、2つだけあることを示したステップ戦略は、生物活性リガンド固定化をもたらした。これは、他に金に起こり得るタンパク質の変性を妨げ、SAMの遮蔽効果によるものである可能性があります。リンカーは、すでに表面に固定されているので、リンカとその結果の不活性化の末端基を通してタンパク質間の架橋は、38を回避している。
表面固定のrhBMP-2で刺激された細胞を用いた実験のために、C2C12基板上にそれらを播種する前に、培養フラスコ中の筋管を形成しなかったことを事前に決定することが重要である。したがって、細胞は、培養でサブコンフルエントに維持されなければならない。培養のために実験のために使用さウシ胎児血清のバッチは、骨形成の刺激が存在しないことを確実にするために試験されなければならない。これは、 例えば alkal、骨形成タンパク質の検出のためのQuantikineアッセイを使用し、骨形成分化マーカーについて細胞を試験することにより行われる INEホスファターゼ式。文化の上からの刺激のための基板を取り扱うときは、ピンセットで傷を避けるために、再び重要です。細胞の培養や絞りの乾燥は、そうでない場合、セルの歪みや死にマイナスのBMP-2刺激に対する応答に影響を与える、どのような場合でも避けるべきである。我々は、細胞が細胞上に基板を適用する前に、培養される6ウェルプレートの各ウェルにピペッティングをDMEMを約100μLをお勧めします。細胞は形態学的変化は文化の上に表面の存在によってトリガーされていないことを保証するために、顕微鏡下で観察する必要があります。基板を除去する際に最後に、片側を慎重にピンセットで持ち上げられ、基板を穏やかに剥離する。明視野顕微鏡を用いて、任意の細胞損傷のための即時のチェックが行わ、ならびに任意の細胞テザーまたは主要な不純物が存在するかどうかを決定するために、基板の検査すべきである。
_content」は>結論として、提示の二段階の方法は、細胞応答への影響を研究するために、そのアミン残基を介して基板上へのrhBMP-2を固定するための有用なツールを提供する。記載戦略は多くの利点を組み合わせる。一方、そうでないBMP-2に限定されるものではなく、それらが高度に保存されたアミノ酸構造を提示するので、それはまた、BMPファミリーの他の増殖因子にも適用することができる。一方、非特異的吸着を防止することによって、このアプローチはBMP-2の標的の調査を可能にする成長因子の量を低減しつつ、最も顕著には、表面からの制御されない放出を阻害する。Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
著者らは、開示することは何もありません。
Acknowledgments
我々は彼の親切なサポートのために教授JPスパッツ（生物物理化学、ハイデルベルク大学、新素材やバイオシステムズの専攻、知能システムのためのマックスプランク研究所、シュツットガルト）に感謝。マックスプランク研究機構とドイツ学術振興（EAC-AへのDFG SFB/TR79。）からの財政支援も大幅に認められている。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| N-hydroxysuccinimide | Sigma-Aldrich | 130672 | |
| 4-(dimethylamino)pyridin | Sigma-Aldrich | 522805 | |
| Acetone | AppliChem | A2282 | |
| 11-mercaptoundecanoic acid | Sigma-Aldrich | 674427 | |
| Dichlormethane | Merck | 106050 | |
| N,N'-dicyclohexylcarbodiimide | Sigma-Aldrich | D80002 | |
| Petroleum benzene | Merck | ||
| Glass coverslips | Carl Roth | M 875 | |
| Ethylacetate | AppliChem | A3550 | |
| Methanol | Carl Roth | 4627 | |
| N,N-dimethylformamide | Carl Roth | T921 | |
| rhBMP-2 | R&D Systems | 355-BM | Carrier-free; expressed in E.coli |
| PBS | PAA | H15-002 | |
| NaCl | Carl Roth | HN00.2 | |
| Poly(dimethyl siloxane) (PDMS) | Dow Corning | ||
| Sylgard 184 silicone elastomer kit | Dow Corning | ||
| Anti-rhBMP-2 | Sigma | B9553 | |
| Goat anti-mouse IgG-HRP | Santa Cruz | sc-2005 | Secondary antibody |
| Ampliflu Red assay | Sigma | 90101 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) (1x), liquid | Gibco | 41966 | High glucose |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma | F7524 | Sterile filtered, cell culture tested |
| Pen/Strep | Gibco | 15140 | |
| Trypsin 0.05% (1x) with EDTA 4Na | Gibco | 25300 | |
| Glycine (0.1 M) | Riedel-de Haën | 33226 | |
| IGEPAL CA-630 (1%) | Sigma | I8896 | Lysis buffer (ALP assay)19 |
| Magnesium chloride (MgCl2)(1 mM) | Carl Roth | HNO3.2 | |
| Zinc chloride (ZnCl2) (1 mM) | Carl Roth | 3533.1 | |
| p-nitrophenylphosphate (pNPP) | Sigma | S0942 | Phosphatase substrate |
| Anti-mysin heavy chain (MHC) | Developmental Studies Hybridoma Bank, University of Iowa | MF20 | Monoclonal antibody |
| Alexa Fluor 488 Goat anti-mouse IgG | Invitrogen | A11001 | |
| DAPI | Sigma | D9542 | |
| Equipment | |||
| Ultrsonic bath (Sonorex Super RK 102H), Frequency 35 kHz | BANDELIN electronic GmbH Co. KG | ||
| MED 020 Sputtercoating system | BAL-TEC AG | Coating conditions Cr: 120 mA, 1.3 x 10-2 mbar, 30 sec Au: 60 mA, 5.0 x 10-2 mbar, 45 sec |
|
| Tecan Infinite M200 Plate reader | Tecan | ||
References
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