Summary
Vi beskriver en fremgangsmåte for å oppnå effektiv immobilisering av BMP-2 på underlaget. Vår fremgangsmåte er basert på dannelsen av en selv-sammensatte monolaget for å oppnå kovalent binding av BMP-2 ved hjelp av de frie aminrester. Denne metoden er et nyttig verktøy for å studere signalering på cellemembranen.
Abstract
Benmorfogenetisk protein 2 (BMP-2) er en vekstfaktor innleiret i den ekstracellulære matriks av benvev. BMP-2 fungerer som trigger av mesenchymale celledifferensiering i osteoblaster, og dermed stimulerende healing og de novo beindannelse. Klinisk bruk av rekombinant humant BMP-2 (rhBMP-2) i forbindelse med stillaser har hevet de siste kontroverser, basert på presentasjonsform og hvor mye som skal leveres. Protokollen som er presentert her er en enkel og effektiv måte for å levere BMP-2 i in vitro studier av celler. Vi beskriver hvordan å danne en selv-sammensatte monosjikt som består av et heterobifunksjonelle linker, og viser den etterfølgende bindingstrinnet for å oppnå kovalent immobilisering av rhBMP-2. Med denne metode er det mulig å oppnå en vedvarende presentasjon av BMP-2 og samtidig opprettholde den biologiske aktivitet av proteinet. Faktisk er overflaten immobilisering av BMP-2 tillater målrettet undersøkelser ved å hindre uspesifikke annonserorption, samtidig som den reduserer mengden av vekstfaktor-og, spesielt, hindrer ukontrollert utslipp fra overflaten. Både kort-og langsiktige signalhendelser utløst av BMP-2 foregår når cellene blir utsatt for overflater presentere kovalent immobilisert rhBMP-2, noe som gjør denne tilnærmingen egnet for in vitro-studier på celle responser til BMP-2 stimulering.
Introduction
Benmorfogenetisk protein 2 (BMP-2) er et medlem av den transformerende vekstfaktor (TGF-β) familien, og fungerer som induser av de novo bendannelse samt regulator av flere vev under embryonal utvikling og voksen homeostasis 1-3. Hver monomer av det biologisk aktive homodimeric BMP-2 protein inneholder en "cystein knot" motiv, som er sterkt konservert i alle BMPs 4.. Seks av de syv cysteinrester danner intramolekylære disulfidbindinger som stabiliserer hver monomer, mens den syvende cystein er involvert i dimerisering, og danner et intermolekylær binding mellom de to monomere 5,6. Denne svært konservert cystein knute definerer den tredimensjonale struktur av BMP-2 protein og bestemmer dens unike egenskaper, slik som resistens mot varme, denatureringsmidler og sure pH 7-9. BMP-2 binder seg til serin / treonin kinase reseptorer, og dermed indusere signaltransduksjon
I bein, induserer BMP-2 differensiering av stamceller til osteoblaster, og dermed stimulere helbredelse og de novo dannelse av bein. For tiden, rekombinant uttrykte BMP-2 er brukt klinisk for å fremme helbredelsen av oppsprukne områder. En vanlig strategi i benvev teknikk er anvendelse av injiserbare vekstfaktorer, som er mindre invasiv forhold til lokale leveringssystemer. Imidlertid har in vivo studier og kliniske applikasjoner vist at den korte biologisk halveringstid, uspesifikk localization og hurtig lokal clearance av BMP-2 kan føre til flere lokale, ektopiske og systemiske problemer 15. Derfor, for å oppnå en effektiv presentasjon, innfangings-eller immobilisering av BMP-2 i eller på materialer som er nødvendig for den lokale og vedvarende tilførsel til målstedet. Vedvarende tilførsel kan oppnås med ikke-kovalente retensjon tilnærminger, for eksempel fysiske innesperring, adsorpsjon eller ion kompleks 16.. Imidlertid er det kjent at uspesifikk adsorpsjon av proteiner til overflater kan resulterer i denaturering av molekylene 17. For den kovalente binding av vekstfaktorer, har forskjellige typer av bærere blitt utviklet i løpet av det siste tiåret. Bruken av bifunksjonelle linking molekyler som mål amino-eller karboksyl-grupper på proteinet for eksempel, er en type tilnærming som ikke nødvendigvis krever protein modifikasjon for å oppnå dens immobilisering. Faktisk, mens protein modifikasjon har den fordelen av å kontrollere protein orientering,innføring av kunstige domener, peptid koder og stedsspesifikke kjedene kan endre den biologiske aktiviteten av vekstfaktorer 17. Derfor, for å omgå denaturering som følge av interaksjon med det støttende materialet, flater kan funksjonalisert på forhånd, for eksempel med en selv-sammensatte monosjikt (SAM) med en bindingsmolekyl, etterfulgt av kobling av den ønskede faktor 18.. Vi har brukt en SAM-basert tilnærming til kovalent immobilisere BMP-2 på en overflate ved å målrette sine frie aminrester og har vist at det immobiliserte protein beholder både sin korte-og langsiktige biologisk aktivitet 19. Denne protokollen er en enkel og effektiv måte for å levere BMP-2 til celler for in vitro studier av de mekanismer som forekommer på cellemembranen og regulerer intracellulære signale ansvarlig for osteogen signalering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
En. Syntese av 11-Mercaptoundecanoyl-N-hydroksysuksinimid-ester (MU-NHS)
- Tilsett dråpevis en løsning av 500 mg N-hydroksysuccinimid og 30 mg 4 - (dimetylamino) pyridin i 10 ml aceton (pa) til 1 g 11-mercaptoundecanoic syre i 40 ml diklormetan (pa) ved romtemperatur (RT).
- Avkjøl reaksjonsblandingen til 0 ° C og tilsett dråpevis 1,1 g N, N '-dicykloheksylkarbodiimid i 10 ml diklormetan (under nitrogenatmosfære). Hold reaksjonen ved lav temperatur i 1 time og deretter omrørt ved RT over natten.
- Filtrer bunnfallet og tørk den under redusert trykk. Rens produktet ved flash-kromatografi med petroleum benzen og etylacetat (pa) i et forhold på 1:1.
2. Utarbeidelse av homogene Gull Layers
- Rent glass dekkglass med presisjon kluter og sonicate dem i 5 min i en oppløsning inneholdende en 01:01 blanding av etylacetat (pa) og metanol (pa). Rinse substrater med metanol og tørk under nitrogenstrøm.
- Plasser de rene substrater i frese-legningsinnretning. Evakuer kammeret. Fjern det øverste kromoksid laget fra krom målet ved katodeforstøvning i 60 sek. Plasser prøvene under metallbjelken og belegge dem med en 10 nm krom lag, etterfulgt av belegning med en 40 nm gull-laget.
Tre. Overflate Immobilisering av BMP-2
- Oppløs MU-NHS i N, N-dimethlyformamide (DMF) til en endelig konsentrasjon på omtrent 1 mM og inkuberes gull substrater i MU-NHS-løsning ved RT i 4 timer under nitrogenatmosfære.
- Sonicate flater i DMF i 2 min, skylles med DMF og MeOH og tørk under en nitrogenstrøm.
- Tilbered en stamløsning av rhBMP-2 i sterile 4 mM HCl med en konsentrasjon på 100 mikrogram / ml (store alikvoter ved -80 ° C). For virke fortynninger (3,5 pg / ml), fortynne stamløsning i PBS / NaCl (PBS inneholdende 1 M NaCl) og endjust til pH 8,5 umiddelbart før bruk.
- Inkuber flater funksjon MU-NHS i den rhBMP-2-arbeidsløsning ved 4 ° C over natten. Fjern inkubasjon supernatant. Sonicate flater i PBS / NaCl i 2 min og vaske 3x med sterile PBS / NaCl.
4. Overflate Karakterisering
- For å blokkere uspesifikk adsorpsjon av antistoff, inkuberes flater med en 5% BSA (w / v) i PBS-løsning i 1 time ved RT, fulgt av inkubasjon med anti-BMP-2-antistoff (1:100 i 1% (w / v ) BSA / PBS-oppløsning) i 1 time ved RT. Vask to ganger med PBS flater og sonicate i 30 sek.
- Inkuber substrater med HRP-konjugert sekundært antistoff (1:1.000 i 1% (w / v) BSA / PBS-løsning) i 30 minutter ved RT, og deretter vaskes to ganger med PBS.
- Bruk Ampliflu Red assay for å måle HRP enzymatisk aktivitet ved 570 nm med en plate-leser.
5. Analyse av biologisk aktivitet
- Seed 1 x 10 5 muse C2C12 myoblasts per brønn i 6-brønn plates i vekstmedium, bestående av en høy glukose DMEM inneholdende pyruvat supplert med 10% FBS, 1% penicillin / streptomycin og inkubere dem i 24 timer ved 37 ° C / 5% CO2.
- Sulte cellene i serum-fri DMEM i 3-5 timer før såing på overflatene dekorert med immobilisert BMP-2.
- For etterforskningen av kortsiktig signale induksjon, erstatte det mediet 200 mL frisk serum-free DMEM og plassere immobilisert BMP-2 overflater over cellene. Overflaten skal håndteres med fin spiss pinsett for å unngå riper.
- Fjern forsiktig overflater og aspirer mediet med en pipette, vaske cellene to ganger med PBS. Fortsett til analyse av celle responser.
- For analyse av langvarig biologisk aktivitet, plate-celler på overflater og kulturen dem ved 37 ° C / 5% CO2 i lave serumforhold (2% FBS) i seks dager.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I vårt oppsett, ble gull valgt som hjelpestoff siden det gir en biologisk uspesifikke, men kjemisk tunbare system. Videre innebærer bruk av selv-montering monolayers mange fordeler: Sams spontant adsorberes via sine "head-grupper" på metaller og skjema monolayers med noen defekter, mens deres funksjonelle endegrupper kan endres ytterligere. Således gir de en plattform for å skreddersy egenskapene til grenseflaten på en styrt måte, men svært tilpasningsdyktig 20..
For immobilisering av BMP-2 på gull-belagte overflater, har vi brukt et to-trinns metode: 1) binding av MU-NHS linkeren til gullsjikt, og deretter 2) omsetning av linkeren med protein (se figur 1). For å bevise det binding av rhBMP-2, brukte vi et enzym immunoassay. I dette assay, flater presentere immobilisert rhBMP-2 ble inkubert med et BMP-2 spesifikt antistoff og et sekundært antistoff konjugert med HRP. Bindingen av sistnevnte kan determined bruker en Ampliflu Red løsning. I nærvær av hydrogen-peroksyd, katalyserer HRP omdannelsen av det fargeløse Ampliflu Red (10-acetyl-3 ,7-dihydroxyphenoxazine) i den fluorescerende forbindelse resorufin. Vi har oppdaget at overflate immobilisert rhBMP-2 (IBMP-2) før og etter nærmer adherente celler ovenfra med functionalized overflater. Vær oppmerksom på at for påvisning av rhBMP med Ampliflu Red analysen, prøvene er underlagt flere ruge trinn og behandlinger. Derfor er det ikke mulig å undersøke den samme overflaten før og etter cellestimulering. Figur 2A viser den vellykkede binding av rhBMP-2 opp til overflaten i en konformasjon gjenkjent av anti-BMP-2 IgG. Figur 2B viser en IBMP- 2. overflate som ble brukt til å stimulere cellene i 30 minutter forut for HRP immunoassay. Selv etter cellestimulering proteinet blir detektert på overflaten.
Celle responser til overflater presentere immobilisert rhBMP-2 ble vurdert og sammenlignet med virkningen av ikke-behandlede gull substrater (negativ kontroll). For å minimalisere påvirkning av adhesjon prosessen på analyse av den kortsiktige signalering, ble en spesiell konfigurasjon er utviklet for cellestimulering. Her ble C2C12-celler stimulert i 30 minutter med rhBMP-2 functionalized overflater som nærmer seg fra toppen. Musen myoblast cellelinje C2C12 er en pluripotent mesenchymale forløper cellelinje, som er mye brukt som modellsystem for å studere den tidlige fasen av osteogent differensiering under beindannelse i musklene. I denne modellen, hemmer BMP-2 differensiering av celler i multinucleated myotubes og induserer osteoblast fenotyper 21. Aktiveringen av Smad 1/5/8, som er nedstrøms reportere av BMP-2 signalveien, blir analysert ved western blotting. Som vist i figur 3A, er Smad fosforylering observert etter 30-minutters stimulering av IBMP-2, mens ingen fosforylering av Smad 1/5/8 oppståri celler eksponert for gull ubehandlede prøver. Dette resultatet indikerer at immobilisering prosessen endrer ikke BMP-2 kortsiktig aktivitet og utløser tidlige trinn i Smad signalering.
For å avgjøre om IBMP-2 påvirker langsiktig osteogent differensiering, uttrykket nivået av alkalisk fosfatase (ALP), en osteogenic markør, ble undersøkt av en kolo analysen. ALP aktivitet av C2C12-celler ble målt etter inkubering av cellene i 6 dager på vanlig gull (kontroll) og IBMP-2 flater. ALP aktivitet i lysater av celler dyrket på IBMP-2 flater viser en betydelig høyere absorpsjon i forhold til kontrollen (fig. 3B). Dette resultatet viser at IBMP-2 induserer uttrykk for osteogenisk markør ALP i C2C12 celler. Denne cellelinjen er kjent for å differensiere ved oppnådd konfluens under lavt serum-stand, for derved å danne myotubes og uttrykke karakteristiske myogeniske proteiner. Men behandling med BMP-2 fører til et skifte idifferensiering veien fra myoblastic til osteoblastiske derfor undertrykke dannelsen av myotubes. For å undersøke effekten av IBMP-2 på myogenese, ble C2C12 celler belagt direkte på gull (kontroll) eller functionalized overflater og kultivert i henhold differensiering (lav serum) forhold. Etter 6 dager ble farging av myosin tung kjede (MHC) utføres. Som vist i figur 3C, C2C12-celler mislykkes i å danne MHC positive myotubes i nærvær av IBMP-2, men ikke på gull substrater.
Figur 1. Reaksjonsskjema for immobilisering prosessen med rhBMP-2 på gull overflater. Glass dekkglass er belagt med et gullsjikt, og deretter inkubert med et heterobifunksjonelle linker (MU-NHS) som resulterer i en NHS-funksjonalisert selv-montert monosjikt (SAM). Primære aminer med BMP-2 reagere med linkeren som fører til covalently immobilisert protein på underlaget. Klikk her for å se større figur .
Figur 2. Overflate-bundet rhBMP-2 kan påvises ved enzymatisk-immunologisk måling før (A), så vel som etter (B) eksperimenter cellestimulering. Immobilisert rhBMP-2 ble kvantifisert ved hjelp av Ampliflu Red kolorimetrisk assay. Absorpsjonen ble målt ved 570 nm, og data ble normalisert til kontroll (ikke-behandlede gull overflater) verdier. Feil søylene representerer standardavvik fra gjennomsnittet n> 3.
Figur 3. Immobilisert rhBMP-2 forblir biologisk aktive og induserer kortsiktig somsamt langtidssignaleringshendelser. (A) C2C12-celler ble stimulert i 30 minutter ved eksponering mot gull overflater (kontroll) og med overflater som er kovalent immobilisert rhBMP-2 (IBMP-2) nærmer seg fra toppen. Etter at cellelyse ble prøver immunoblotted for p-Smad1/5/8 og β-aktin. (B) Den enzymatiske aktivitet av alkalisk fosfatase (ALP) indikerer osteogen differensiering av C2C12-celler, og ble målt fra cellelysater etter en 6-dagers inkubasjon periode på kontrollen eller IBMP-2 flater, henholdsvis. ALP-aktivitet ble målt som absorbans ved 405 nm. Søylediagrammet viser data innhentet etter en 60-min reaksjon. Det feilfelt indikerer standardavvik, n = 3, * p <0,01. (C) C2C12-celler ble utsådd på angitte overflater og dyrket i 6 dager ved lave serumforhold for å tillate myogenese. Bildene viser myosin tung kjede (MHC) farging av multinucleated myotubes (grønn) og DAPI atomkjerner flekker (blå). Bilde forstørrelse 20x.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I denne protokollen beskriver vi forberedelse av overflater funksjon med bioaktive rhBMP-2. Denne fremgangsmåten omfatter to trinn: 1) den initielle dannelse av et selv-sammensetting av monolaget (SAM) med en bifunksjonell linker på gulloverflaten, 2) kovalente immobilisering av rhBMP-2-protein. I tidligere arbeid har vi bekreftet den effektive binding av den bifunksjonelle linker og vekstfaktor, og viste at overflate-immobilisert rhBMP-2 opprettholder sin biologiske aktivitet 19. Den bioaktivitet av vekstfaktorer som presenteres i en immobilisert form er også vist i andre studier indikerer at frigjøring av proteinene og deres påfølgende internalisering er ikke avgjørende for cellestimulering 24,25. Faktisk tillater den kovalente immobilisering av vekstfaktorer vedvarende stimulering av målcellene og samtidig opprettholde en effektiv dosering på grunn av forbedrede belegg på forskjellige typer av reseptorer i cellemembranen 22,23,26-28.
For utarbeidelse av overflater presentere immobilisert rhBMP-2, forsiktighet bør utvises ved håndtering av overflater gjennom hele prosedyren og i utarbeidelsen av rhBMP-2-løsning. Glassdekk bør være ren og tørr, og ingen tegn til feil eller urenheter skal være synlig. Skrape overflaten med pinsett og pipetter bør unngås. For overflatefunksjonalisering trinn ved hjelp av rhBMP-2, er det viktig å bruke en bærer-fri rekombinant protein, det vil si uten tilsetning av bovint serumalbumin i preparatet, for å unngå uønsket immobilisering av bæreren på overflaten. Den rhBMP-2 lager (100 ug / ml) ble oppløst i 4 mM HCl. Når overflatene inkuberes med rhBMP-2-løsning, bør pH justeres til nøytral til svakt alkalisk pH for å forbedre reaksjonen til amino-gruppen av proteinet med NHS-gruppen av overflate-bundet linker. Dersom pH er for lav, kan NHS-gruppen hydrolyseres før den kan reagere with aminogruppene i proteinet. Vi bruker PBS som inneholder 1 M NaCl 29 og legge rhBMP-2 fra lager og deretter justere pH med KOH (10 mm).
Med denne protokoll har vi oppnådd en vellykket immobilisering av bioaktive rhBMP-2-on overflater fordi: 1) det etablert en to-trinns metode, 2) vi brukte en passende linker for å oppnå avstanden fra overflaten, og til å binde proteinet uten store forstyrrelser på dens interaksjon med reseptoren. Den amin-reaktive alkanethiol, 11-mercaptoundecanoyl-N-hydroksysuksinimid-ester (MU-NHS), ble bundet til gullet substratet i det første trinn. Som alkanethiols selv montere på metaller som gull, som danner et sterkt organisert monolag, forenkle de dekorasjon av overflater med forskjellige linkermolekyler 30-32. SAM skjold biomolekyler fra direkte kontakt med fast overflate, og dermed minimere risikoen for denaturering 32. Videre er lengden av linkeren bestemmer også reactivity av SAM. De NHS grupper av linkere som består av minst elleve karbonatomer, som MU-NHS, er mer tilgjengelige, noe som resulterer i økt protein immobilisering i forhold til bindingen til kortere linkere 34. Den immobilisering av rhBMP-2 skjer ved forskyvning av NHS-gruppen av lysin-rester av proteinet 34.. Tatt i betraktning kun den steriske miljø, mest sannsynlig foregår reaksjonen av overflate immobilisert NHS grupper sted ved de fleksible N-terminale rester 35. Imidlertid, slik det er vist for andre ligander, kan lengden og fleksibiliteten til linkeren aktiverer interaksjon med annet sterisk hindret bindingsseter, noe som kompenserer for ugunstig retning 36,37. I upublisert arbeid sammenlignet vi den ett-trinns med en to-trinns immobilisering strategi. Sammenligningen mellom å bruke en oppløsning som inneholder både protein-og linkere, og den sekvensielle overflatebindingen av linkeren og protein, viste at bare to-trinns strategi resulterte i bioaktive ligand immobilisering. Dette kan være på grunn av en avskjermende virkning av SAM, som hindrer protein-denaturering som ellers kunne finne sted på gull. Videre, ettersom linkeren allerede er forankret til overflaten, blir kryss-kopling mellom proteiner gjennom endegrupper av linkeren og deres resulterende inaktive omgått 38..
For de eksperimenter med celler stimulert med overflate immobilisert rhBMP-2, er det avgjørende å fastslå på forhånd at C2C12 ikke danner myotubes i kultur kolbe før såing dem på underlaget. Derfor celler må holdes subconfluent i kultur. Det parti av føtalt bovint serum som brukes for dyrking og for eksperimentene og må derfor kontrolleres for å sikre at ingen osteogene stimuli er til stede. Dette utføres ved hjelp av Quantikine assay for påvisning av ben-morfogenetiske proteiner, og ved å teste celler for osteogene differensieringsmarkører, for eksempel alkalimetall ine fosfatase uttrykk. Ved håndtering av substratene for stimuleringen fra toppen av kulturer, er det igjen viktig å unngå eventuelle riper med pinsett. Tørking av kulturen og klemming av cellene bør unngås i alle tilfelle, også celle forvrengning og død vil negativt påvirke responsen til BMP-2-stimulering. Det anbefales å pipettere omtrent 100 ul av DMEM i hver brønn av en 6-brønns plate hvor cellene dyrkes før påføring av substratet på cellene. Celler bør observeres under mikroskop for å sikre at ingen morfologiske endringer utløses ved nærværet av overflatene på toppen av kulturene. Til slutt, ved fjerning av substratene, ene side er nøye løftes med pinsett og substratet blir forsiktig skallet av. En umiddelbar sjekk for en hvilken som helst celleskader til et lyst felt mikroskop bør utføres, i tillegg til en kontroll av substratene for å fastslå om noen celle stagene eller større urenheter er til stede.
_content "> Som konklusjon, gir det presentert to-trinns prosedyre et nyttig verktøy for å immobilisere rhBMP-2 på underlag via sine aminrester for å studere dens innvirkning på cellulære responser. Den beskrevne strategi kombinerer mange fordeler. På den ene siden, er det ikke begrenset til BMP-2, men den kan også anvendes for andre vekstfaktorer i BMP-familien, siden de utgjøre en svært konservert aminosyre-struktur. På den annen side, ved å forhindre uspesifikk adsorpsjon, denne tilnærmingen muliggjør målrettet undersøkelse av BMP-2 , samtidig som den reduserer mengden av vekstfaktor-og, spesielt, hindrer ukontrollert utslipp fra overflaten.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noe å avsløre.
Acknowledgments
Vi takker professor JP Spatz (Institutt for Biofysikalsk kjemi, Universitetet i Heidelberg og Institutt for nye materialer og Biosystems, Max Planck Institute for Intelligent Systems, Stuttgart) for hans type støtte. Den økonomiske støtten fra Max-Planck-Gesellschaft og Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG SFB/TR79 til EAC-A.) Er også i stor grad erkjent.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| N-hydroxysuccinimide | Sigma-Aldrich | 130672 | |
| 4-(dimethylamino)pyridin | Sigma-Aldrich | 522805 | |
| Acetone | AppliChem | A2282 | |
| 11-mercaptoundecanoic acid | Sigma-Aldrich | 674427 | |
| Dichlormethane | Merck | 106050 | |
| N,N'-dicyclohexylcarbodiimide | Sigma-Aldrich | D80002 | |
| Petroleum benzene | Merck | ||
| Glass coverslips | Carl Roth | M 875 | |
| Ethylacetate | AppliChem | A3550 | |
| Methanol | Carl Roth | 4627 | |
| N,N-dimethylformamide | Carl Roth | T921 | |
| rhBMP-2 | R&D Systems | 355-BM | Carrier-free; expressed in E.coli |
| PBS | PAA | H15-002 | |
| NaCl | Carl Roth | HN00.2 | |
| Poly(dimethyl siloxane) (PDMS) | Dow Corning | ||
| Sylgard 184 silicone elastomer kit | Dow Corning | ||
| Anti-rhBMP-2 | Sigma | B9553 | |
| Goat anti-mouse IgG-HRP | Santa Cruz | sc-2005 | Secondary antibody |
| Ampliflu Red assay | Sigma | 90101 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) (1x), liquid | Gibco | 41966 | High glucose |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma | F7524 | Sterile filtered, cell culture tested |
| Pen/Strep | Gibco | 15140 | |
| Trypsin 0.05% (1x) with EDTA 4Na | Gibco | 25300 | |
| Glycine (0.1 M) | Riedel-de Haën | 33226 | |
| IGEPAL CA-630 (1%) | Sigma | I8896 | Lysis buffer (ALP assay)19 |
| Magnesium chloride (MgCl2)(1 mM) | Carl Roth | HNO3.2 | |
| Zinc chloride (ZnCl2) (1 mM) | Carl Roth | 3533.1 | |
| p-nitrophenylphosphate (pNPP) | Sigma | S0942 | Phosphatase substrate |
| Anti-mysin heavy chain (MHC) | Developmental Studies Hybridoma Bank, University of Iowa | MF20 | Monoclonal antibody |
| Alexa Fluor 488 Goat anti-mouse IgG | Invitrogen | A11001 | |
| DAPI | Sigma | D9542 | |
| Equipment | |||
| Ultrsonic bath (Sonorex Super RK 102H), Frequency 35 kHz | BANDELIN electronic GmbH Co. KG | ||
| MED 020 Sputtercoating system | BAL-TEC AG | Coating conditions Cr: 120 mA, 1.3 x 10-2 mbar, 30 sec Au: 60 mA, 5.0 x 10-2 mbar, 45 sec |
|
| Tecan Infinite M200 Plate reader | Tecan | ||
References
- Helm, G., Andersson, D., et al. Summary statement: Bone morphogenetic proteins: Basic science. Spine. 27 (16S), S9 (2002).
- Hogan, B. Bone morphogenetic proteins: multifunctional regulators of vertebrate development. Genes Dev. 10 (13), 1580-1594 (1996).
- Reddi, A. BMPs: from bone morphogenetic proteins to body morphogenetic proteins. Cytokine Growth Factor Rev. 16, 249-250 (2005).
- Rengachary, S. Bone morphogenetic proteins: basic concepts. Neurosurg Focus. 13 (6), 1-6 (2002).
- Schlunegger, M., Grütter, M. An unusual feature revealed by the crystal structure at 2.2 Å; resolution of human transforming growth factor-β2. Nature. 358, 430-434 (1992).
- Scheufler, C., Sebald, W., Hülsmeyer, M. Crystal structure of human bone morphogenetic protein-2 at 2.7 Å resolution. J. Mol. Biol. 287 (1), 103-115 (1999).
- Nimni, M. Polypeptide growth factors: targeted delivery systems. Biomaterials. 18 (18), 1201-1225 (1997).
- Wozney, J., Rosen, V. Bone morphogenetic protein and bone morphogenetic protein gene family in bone formation and repair. Clin. Orthop. Related Res. 346, 26 (1998).
- Rosen, V. BMP and BMP inhibitors in bone. Annals of the New York Academy of Sciences. 1068, 19-25 (2006).
- Kirsch, T., Sebald, W., Dreyer, M. K. Crystal structure of the BMP-2-BRIA ectodomain complex. Nat. Struct. Biol. 7 (6), 492-496 (2000).
- Keller, S., Nickel, J., et al. Molecular recognition of BMP-2 and BMP receptor IA. Nat. Struct. Mol. Biol. 11 (5), 481-488 (2004).
- Miyazono, K., Maeda, S., Imamura, T. BMP receptor signaling: transcriptional targets, regulation of signals, and signaling cross-talk. Cytokine Growth Factor Rev. 16 (3), 251-263 (2005).
- Nohe, A., Hassel, S., et al. The mode of bone morphogenetic protein (BMP) receptor oligomerization determines different BMP-2 signaling pathways. J. Biol. Chem. 277 (7), 5330-5338 (2002).
- Sieber, C., Kopf, J., et al. Recent advances in BMP receptor signaling. Cytokine Growth Factor Rev. 20 (5-6), 343-355 (2009).
- Carragee, E. J., Hurwitz, E. L., Weiner, B. K. A critical review of recombinant human bone morphogenetic protein-2 trials in spinal surgery: emerging safety concerns and lessons learned. Spine J. 11, 471-491 (2011).
- Luginbuehl, V., Meinel, L., et al. Localized delivery of growth factors for bone repair. Eur. J. Pharm. Biopharm. 58 (2), 197-208 (2004).
- Nakaji-Hirabayashi, T., Kato, K., et al. Oriented immobilization of epidermal growth factor onto culture substrates for the selective expansion of neural stem cells. Biomaterials. 28 (24), 3517-3529 (2007).
- Gonçalves, R., Martins, M., et al. Bioactivity of immobilized EGF on self-assembled monolayers: Optimization of the immobilization process. J. Biomed. Mater. Res. Part A. 94A. 2 (2), 576-585 (2010).
- Pohl, T. L. M., Boergermann, J. H., et al. Surface immobilization of bone morphogenetic protein 2 via a self-assembled monolayer formation induces cell differentiation. Acta Biomater. 8 (2), 772-780 (2012).
- Love, J., Estroff, L., et al. Self-assembled monolayers of thiolates on metals as a form of nanotechnology. Chem. Rev. 105 (4), 1103-1169 (2005).
- Katagiri, T., Yamaguchi, A., et al. Bone morphogenetic protein-2 converts the differentiation pathway of C2C12 myoblasts into the osteoblast lineage. J. Cell Biol. 127 (6), 1755-1766 (1994).
- Whitaker, M. J., Quirk, R. A., et al. Growth factor release from tissue engineering scaffolds. J. Pharm. Pharmacol. 53 (11), 1427-1437 (2001).
- Uludag, H., D'Augusta, D., et al. Implantation of recombinant human bone morphogenetic proteins with biomaterial carriers: a correlation between protein pharmacokinetics and osteoinduction in the rat ectopic model. J. Biomed. Mater. Res. 50 (2), 227-238 (2000).
- Kashiwagi, K., Tsuji, T., et al. Directional BMP-2 for functionalization of titanium surfaces. Biomaterials. 30 (6), 1166-1175 (2008).
- Karageorgiou, V., Meinel, V. L., et al. Bone morphogenetic protein-2 decorated silk fibroin films induce osteogenic differentiation of human bone marrow stromal cells. J. Biomed. Mater. Res. 71 (3), 528-573 (2004).
- Rose, F. R. A. J., Hou, Q., et al. Delivery systems for bone growth factors - the new players in skeletal regeneration. J. Pharm. Pharmacol. 56 (4), 415-427 (2004).
- Masters, K. S. Covalent growth factor immobilization strategies for tissue repair and regeneration. Macromol. Biosci. 11 (9), 1149-1163 (2011).
- Crouzier, T., Fourel, L., et al. Presentation of BMP-2 from a soft biopolymeric film unveils its activity on cell adhesion and migration. Adv. Mater. 23 (12), H111-H118 (2011).
- Ruppert, R., Hoffmann, E., et al. Human bone morphogenetic protein 2 contains a heparin-binding site which modifies its biological activity. European Journal of Biochemistry. 237 (1), 295-302 (1996).
- Love, J., Estroff, L., et al. Self-assembled monolayers of thiolates on metals as a form of nanotechnology. Chem. Rev. 105 (4), 1103-1169 (2005).
- Kato, K., Sato, H., Iwata, H. Immobilization of histidine-tagged recombinant proteins onto micropatterned surfaces for cell-based functional assays. Langmuir. 21 (16), 7071-7075 (2005).
- Martins, M., Curtin, S., et al. Molecularly designed surfaces for blood deheparinization using an immobilized heparin-binding peptide. J. Biomed. Mater. Res. 88 (1), 162-173 (2009).
- Limbut, W., Kanatharana, P., et al. A comparative study of capacitive immunosensors based on self-assembled monolayers formed from thiourea, thioctic acid, and 3- mercaptopropionic acid. Biosens. Bioelectron. 22 (2), 233-240 (2006).
- Patel, N., Davies, M., et al. Immobilization of protein molecules onto homogeneous and mixed carboxylate-terminated self-assembled monolayers. Langmuir. 13 (24), 6485-6490 (1997).
- Hu, J., Duppatla, V., et al. Site-specific PEGylation of bone morphogenetic protein-2 cysteine analogues. Bioconjug. Chem. 21 (10), 1762-1772 (2010).
- Hersel, U., Dahmen, C., Kessler, H. RGD modified polymers: biomaterials for stimulated cell adhesion and beyond. Biomaterials. 24 (24), 4385-4415 (2003).
- Cao, T., Wang, A., et al. Investigation of spacer length effect on immobilized Escherichia coli pili-antibody molecular recognition by AFM. Biotechnol. Bioeng. 98 (6), 1109-1122 (2007).
- Puleo, D., Kissling, R., Sheu, M. A technique to immobilize bioactive proteins, including bone morphogenetic protein-4 (BMP-4), on titanium alloy. Biomaterials. 23 (9), 2079-2087 (2002).
