Summary
Wir beschreiben ein Verfahren zum Erreichen effizienten Immobilisierung von BMP-2 auf die Oberflächen. Unser Ansatz beruht auf der Bildung einer selbstorganisierten Monoschicht, um die kovalente Bindung des BMP-2 mit seinem freien Aminresten zu erreichen basiert. Dieses Verfahren ist ein nützliches Werkzeug, um Signalisierung auf der Zellmembran zu studieren.
Abstract
Morphogenetisches Knochenprotein 2 (BMP-2) ist ein Wachstumsfaktor in der extrazellulären Matrix von Knochengewebe eingebettet ist. BMP-2 fungiert als Auslöser von mesenchymalen Zelldifferenzierung zu Osteoblasten und stimulieren damit Heilung und de novo Knochenbildung. Der klinische Einsatz von rekombinanten humanen BMP-2 (rhBMP-2) in Verbindung mit den letzten Gerüsten hat Kontroversen angehoben, bezogen auf die Darstellungsweise und die Menge geliefert werden. Die hier vorgestellten Protokoll bietet eine einfache und effiziente Möglichkeit, BMP-2 in vitro-Untersuchungen an Zellen zu liefern. Wir beschreiben, wie eine selbstorganisierte Monoschicht, die aus einem heterobifunktionellen Linkers zu bilden, und zeigen die nachfolgende Bindungsschritt, um eine kovalente Immobilisierung von rhBMP-2 zu erhalten. Mit diesem Ansatz ist es möglich, eine anhaltende Präsentation von BMP-2 bei gleichzeitiger Beibehaltung der biologischen Aktivität des Proteins. In der Tat wird die Oberfläche Immobilisierung von BMP-2 können gezielte Untersuchungen durch Verhinderung unspezifischer AnzeigenDesorption, während die Verringerung der Menge an Wachstumsfaktor und, vor allem, behindern unkontrollierten Freisetzung von der Oberfläche. Beide kurz-und langfristigen Signalereignisse von BMP-2 ausgelöst stattfinden, wenn die Zellen auf Oberflächen präsentiert kovalent immobilisierten rhBMP-2 ausgesetzt, so dass dieser Ansatz geeignet für in-vitro-Studien an Zell-Antworten auf BMP-2 Stimulation.
Introduction
Morphogenetisches Knochenprotein 2 (BMP-2) ist ein Mitglied der transformierenden Wachstumsfaktor (TGF-β)-Familie und als Induktor der de novo Knochenbildung sowie Regulator mehreren Geweben während der embryonalen Entwicklung und Homöostase Erwachsenen 1-3. Jedes Monomer des biologisch aktiven homodimeren BMP-2-Protein enthält eine "Cystein-Knoten"-Motiv, das in allen hoch BMPs 4 konserviert ist. Sechs der sieben Cysteinreste eine intramolekulare Disulfidbindungen bilden, die jedes Monomer zu stabilisieren, während der siebte Cystein an der Dimerisierung beteiligt sind, die einen intermolekularen Bindung zwischen den beiden Monomeren 5,6. Diese hochkonservierten Cystein-Knoten definiert, die die dreidimensionale Struktur des BMP-2-Protein bestimmt und seine einzigartigen Eigenschaften, wie Beständigkeit gegen Hitze, Denaturierungsmittel und sauren pH 7-9. BMP-2-Bindung an Serin / Threonin-Kinase-Transmembran-Rezeptoren, wodurch die Signaltransduktion zu induzieren
In Knochen, BMP-2 induziert die Differenzierung von mesenchymalen Stammzellen zu Osteoblasten, wodurch die Stimulierung der Heilung und de novo-Knochenbildung. Derzeit rekombinant exprimierten BMP-2 ist klinisch angewendet, um die Heilung von gebrochenen Seiten zu verbessern. Eine übliche Strategie im Knochengewebe ist der Einsatz von injizierbaren Wachstumsfaktoren, die zum lokalen Abgabesystemen weniger invasiv ist. In vivo-Studien und klinische Anwendungen haben gezeigt, dass die kurze biologische Halbwertszeit, unspezifische locsierung und schnelle lokale Clearance von BMP-2 kann sich auf mehrere lokale und systemische Probleme Eileiter 15 führen. Daher ist notwendig für die örtliche verzögerte Abgabe an der Zielstelle, um eine effektive Präsentation, das Einschließen oder Immobilisierung von BMP-2 in oder an Materialien zu erhalten. Anhaltende Abgabe kann mit nicht-kovalente Retentions Ansätze wie physikalischen Einschluß, Adsorption oder Ionenkomplex 16 erreicht werden. Es ist jedoch bekannt, dass unspezifische Adsorption von Proteinen an Oberflächen können die Ergebnisse in eine Denaturierung der Moleküle 17. Für die kovalente Bindung von Wachstumsfaktoren, wurden verschiedene Typen von Trägern in den letzten zehn Jahren entwickelt worden. Die Verwendung von bifunktionellen Verknüpfungsmoleküle, die Amino-oder Carboxylgruppen des Proteins beispiels Ziel ist eine Art von Ansatz, der nicht unbedingt erforderlich ist Proteinmodifikation seiner Immobilisierung zu erreichen. In der Tat bietet, während die Proteinmodifikation Vorteil der Steuerung Proteinorientierung,die Einführung der künstlichen Domänen-, Peptid-Tags und ortsspezifische Ketten verändern die biologische Aktivität von Wachstumsfaktoren 17. Somit, um die Denaturierung aufgrund der Wechselwirkung mit dem Trägermaterial zu umgehen, Oberflächen vorher funktionalisiert werden, beispielsweise mit einer selbstorganisierten Monoschicht (SAM) eines Verbindungsmoleküls, gefolgt von der Kopplung des gewünschten Faktor 18. Wir haben eine SAM-Ansatz, indem sie auf seiner freien Aminreste verwendet werden, um kovalent immobilisieren BMP-2 auf eine Oberfläche und haben gezeigt, dass das Protein immobilisiert sowohl die kurz-und langfristigen biologischen Aktivität 19 behält. Dieses Protokoll stellt eine einfache und effiziente Möglichkeit, BMP-2-Zellen für in vitro-Untersuchungen über die Mechanismen, die an der Zellmembran auf und regulieren intrazellulären Signalisierung für osteogene Signalisierung verantwortlich zu liefern.
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Protocol
1. Synthese von 11-Mercaptoundecanoyl-N-hydroxysuccinimidester (MU-NHS)
- (Dimethylamino) pyridin in 10 ml Aceton (pa) und 1 g 11-Mercaptoundecansäure in 40 ml Dichlormethan (Pa) bei Raumtemperatur (RT) - eine Lösung von 500 mg N-Hydroxysuccinimid und 30 mg 4 hinzuzufügen.
- Die Reaktion wird auf 0 ° C gekühlt und tropfenweise mit 1,1 g N, N '-Dicyclohexylcarbodiimid in 10 ml Dichlormethan (unter Stickstoffatmosphäre). Halten Sie die Reaktion bei niedriger Temperatur für 1 h und dann über Nacht bei RT rühren.
- Der Niederschlag abfiltriert und trocknet es im Vakuum. Reinige das Produkt durch Flash-Chromatographie mit Petrolether Benzol und Ethylacetat (PA) in einem Verhältnis von 1:1.
2. Herstellung von homogenen Gold-Schichten
- Saubere Deckgläser mit Präzision Tücher und beschallen sie für 5 Minuten in einer Lösung, die eine 1:1-Mischung von Ethylacetat (pa) und Methanol (pa). RinsE Substrate mit Methanol und Trocknen unter Stickstoffstrom.
- Legen Sie die sauberen Substrate in der Sputter-Beschichtungsvorrichtung. Kammer evakuieren. Entfernen der obersten Schicht aus Chromoxid Chromtargets durch Sputtern für 60 sek. Die Proben werden unter der Metallstrahl und überziehen sie mit einer 10 nm Chromschicht, gefolgt von der Beschichtung mit einer 40 nm dicken Goldschicht.
3. Oberflächen Immobilisierung von BMP-2
- Auflösen MU-NHS in N, N-dimethlyformamide (DMF) zu einer Endkonzentration von etwa 1 mM und Inkubation Goldsubstrate in der MU-NHS-Lösung bei RT für 4 h unter Stickstoffatmosphäre.
- Ultraschallbad Flächen in DMF für 2 Minuten gründlich mit DMF und MeOH und trocknen unter Stickstoffstrom.
- Bereiten Sie eine Stammlösung von rhBMP-2 in sterile 4 mM HCl mit einer Konzentration von 100 ug / ml (store-Aliquots bei -80 ° C). Für die Arbeit Verdünnungen (3,5 ug / ml), verdünnt das Stammlösung in PBS / NaCl (PBS mit 1 M NaCl) und eineP assen auf pH 8,5 unmittelbar vor der Verwendung.
- Inkubieren funktionalisierten Oberflächen MU-NHS in der rhBMP-2 Arbeitslösung bei 4 ° C über Nacht. Überstand entfernen Inkubation. Ultraschallbad Flächen in PBS / NaCl für 2 Minuten und waschen 3x mit sterilem PBS / NaCl.
4. Oberflächencharakterisierung
- Unspezifische Adsorption von Antikörpern zu blockieren, Inkubation Oberflächen mit einer 5% BSA (w / v) in PBS-Lösung für 1 h bei RT, gefolgt von einer Inkubation mit einem Anti-BMP-2-Antikörper (1:100 in 1% (w / v ) BSA / PBS-Lösung) für 1 h bei RT. Zweimal waschen mit PBS Flächen beschallen und für 30 Sekunden.
- Substrate inkubieren mit HRP-konjugierten sekundären Antikörper (1:1000 in 1% (w / v) BSA / PBS-Lösung) für 30 min bei RT, dann zweimal mit PBS waschen.
- Verwenden Ampliflu Red Assay HRP enzymatische Aktivität messen bei 570 nm mit einem Plattenlesegerät.
5. Analyse der biologischen Aktivität
- Seed 1 x 10 5 Maus C2C12 Myoblasten pro Well in 6-Well-plAtes in Wachstumsmedium, bestehend aus DMEM high glucose Pyruvat mit 10% FBS, 1% Penicillin / Streptomycin und inkubieren für 24 h bei 37 ° C / 5% CO 2 enthält, ergänzt.
- Hungern Zellen in Serum-freien DMEM für 3-5 Stunden vor auf die mit immobilisiertem BMP-2 verziert Oberflächen Aussaat.
- Für die Untersuchung der kurzfristigen Signal Induktion, ersetzen Sie das Medium durch 200 ul frisches Serum-freien DMEM und legen Sie die immobilisierten BMP-2-Flächen über den Zellen. Die Oberfläche sollte mit feiner Spitze Pinzette gehandhabt werden, um Kratzer zu vermeiden.
- Oberflächen sanft entfernen und saugen das Medium mit einer Pipette, waschen Sie die Zellen zweimal mit PBS. Gehen Sie zur Analyse von Zell-Antworten.
- Für die Analyse der Langzeit biologische Aktivität, Platte Zellen auf Oberflächen-und Kultur sie bei 37 ° C / 5% CO 2 in niedrigen Serumbedingungen (2% FBS) für sechs Tage.
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Representative Results
In unserem Aufbau wurde Gold als Hilfsstoff gewählt, da es eine biologisch unspezifische aber chemisch abstimmbaren System. Darüber hinaus ist die Anwendung von selbstorganisierenden Monoschichten bringt viele Vorteile: SAMs adsorbieren spontan über ihre "head-Gruppen" auf Metalle und Form Monoschichten mit wenigen Fehlern, während ihre funktionellen Endgruppen kann weiter modifiziert werden. Somit stellen sie eine Plattform, um die Eigenschaften der Oberfläche in einer kontrollierten Art und Weise aber sehr anpassungs 20 anzupassen.
Zur Immobilisierung von BMP-2 auf die mit Gold beschichteten Oberflächen, verwendeten wir ein zweistufiges Verfahren: 1) die Verbindung des MU-NHS Linker an die Goldschicht, und 2) Umsetzen der Linker mit dem Protein (siehe Abbildung 1). Um die Bindung des rhBMP-2 zu beweisen, haben wir ein Enzym-Immunoassay. In diesem Assay-Oberflächen präsentieren immobilisierten rhBMP-2 wurden mit einem BMP-2-spezifischen Antikörper und einem sekundären Antikörper, der mit HRP konjugiert. Die Bindung des letzteren kann d werdenetermined mit einem Ampliflu Red-Lösung. In Gegenwart von Wasserstoffperoxid, katalysiert HRP die Umwandlung des farblosen Ampliflu Red (10-Acetyl-3 ,7-dihydroxyphenoxazin) in der fluoreszierenden Verbindung Resorufin. Wir haben festgestellt Oberfläche immobilisierten rhBMP-2 (IBMP-2) vor und nach der Annäherung adhärenten Zellen von oben mit funktionalisierten Oberflächen. Bitte beachten Sie, dass für den Nachweis von rhBMP mit der Ampliflu Red Assay werden die Proben unter mehrere Inkubationsschritte und Behandlungen. Daher ist es nicht möglich, die gleiche Oberfläche vor und nach der Zellstimulation. 2A zeigt die erfolgreiche Bindung von rhBMP-2 auf die Oberfläche in einer Konformation des Anti-BMP-2-IgG erkannt untersuchen. 2B zeigt eine IBMP- 2 Oberfläche, die verwendet wurde, um die Zellen für 30 min vor der HRP-Immunoassay stimulieren. Selbst nach der Zellstimulation wird das Protein auf der Oberfläche nachgewiesen.
Zell-Reaktionen auf Oberflächen immobilisiert präsentiert rhBMP-2 wurden untersucht und mit der Wirkung von nicht-behandelten Goldsubstrate (Negativkontrolle). Um den Einfluss der Klebevorgang auf der Analyse der kurzfristigen Signalisierung zu minimieren, wurde ein spezieller Aufbau zur Zellstimulation entwickelt. Hier wurden C2C12-Zellen für 30 min mit rhBMP-2 funktionalisierten Oberflächen nähert sich von oben angeregt. Die Maus-Myoblasten-Zelllinie C2C12 ist ein pluripotenten mesenchymalen Vorläuferzelllinie, die weithin als Modellsystem verwendet wird, das Frühstadium der osteogenen Differenzierung während der Knochenbildung in Muskelgewebe zu studieren. In diesem Modell, BMP-2 hemmt die Differenzierung von Zellen in kernigen Myotuben und Osteoblasten induziert Phänotypen 21. Die Aktivierung des Smad 1/5/8, der stromabwärts Reporter des BMP-2-Signalwegs sind, wird durch Western-Blotting analysiert. Wie in 3A gezeigt, ist Smad-Phosphorylierung nach 30 min Stimulation durch IBMP-2 beobachtet, während keine Phosphorylierung der Smad 1/5/8 auftrittin Zellen mit unbehandelten Goldproben ausgesetzt. Dieses Ergebnis zeigt, dass der Prozess nicht Immobilisierung von BMP-2 Kurzzeit-Tätigkeit zu verändern und löst frühen Schritte in Smad-Signalisierung.
Zu bestimmen, ob IBMP-2 wirkt langfristig osteogene Differenzierung, das Expressionsniveau der alkalischen Phosphatase (ALP), einem osteogenen Marker wurde durch einen kolorimetrischen Test untersucht. ALP-Aktivität von C2C12-Zellen wurde nach Inkubation der Zellen für 6 Tage auf Normal Gold (Kontrolle) und IBMP-2 Oberflächen gemessen. ALP-Aktivität in Lysaten von Zellen auf Oberflächen IBMP-2 kultiviert zeigt eine deutlich höhere Absorption im Vergleich zur Kontrolle (Fig. 3B). Dieses Ergebnis zeigt, dass IBMP-2 induziert die Expression des osteogenen Marker ALP in C2C12-Zellen. Diese Zelllinie ist bekannt, dass bei Erreichen der Konfluenz unter niedrigen Serum-Zustand zu unterscheiden, wodurch Myotuben bilden und mit dem Ausdruck myogenic charakteristischen Proteinen. Die Behandlung mit BMP-2 bewirkt eine Verschiebungdie Differenzierung Weg von myoblastischer auf osteoblastische, also die Unterdrückung der Bildung von Myotuben. Um die Wirkung der IBMP-2 auf myogenesis zu untersuchen, wurden C2C12 Zellen direkt auf Gold (Kontrolle) oder funktionalisierten Oberflächen und unter Differenzierung (niedrige Serum) Bedingungen kultiviert plattiert. Nach 6 Tagen wurde Färbung von Myosin schwere Kette (MHC) durchgeführt. Wie in 3C gezeigt, C2C12-Zellen nicht an MHC-positive Myotuben in Gegenwart von IBMP-2 zu bilden, aber nicht auf Goldsubstraten.
Fig. 1 ist. Schema der Immobilisierungsverfahren von rhBMP-2 auf Goldoberflächen. Glasdeckgläser sind mit einer Goldschicht überzogen und anschließend mit einem heterobifunktionellen Linker (MU-NHS), was zu einem NHS-funktionalisierten selbstorganisierten Monoschicht (SAM) inkubiert. Primären Aminen der BMP-2 reagieren mit dem Linker führt zur Zusammenarbeitkovalent immobilisierten Proteins auf dem Substrat. Klicken Sie hier, um eine größere Abbildung anzuzeigen .
2. Oberflächengebundenen rhBMP-2 kann durch enzymatischen Immunoassay vor (A) und nach (B) Zellstimulationsexperimente. Immobilisierte rhBMP-2 wurde unter Verwendung Ampliflu Red kolorimetrischen Assay quantitativ erfaßt werden. Die Absorption wurde bei 570 nm gemessen und die Daten wurden normalisiert, um zu steuern (nicht behandelten Goldoberflächen) Werte. Fehlerbalken stellen die Standardabweichung vom Mittelwert n> 3.
3. Immobilisierten rhBMP-2 bleibt biologisch aktiv und induziert kurzfristige alssowie Langzeitsignalereignisse. (A) C2C12-Zellen wurden für 30 Minuten durch die Einwirkung von Goldoberflächen (Kontrolle) und Oberflächen mit kovalent immobilisierten rhBMP-2 (IBMP-2) nähert sich von oben angeregt. Nach Zelllyse wurden die Proben p-Smad1/5/8 und β-Actin-immuno-geblottet. (B) Die enzymatische Aktivität der alkalischen Phosphatase (ALP) zeigt die osteogene Differenzierung von C2C12 Zellen und wurde aus Zell-Lysaten nach einer 6-tägigen Inkubation gemessen Zeitraum auf der Steuer oder IBMP-2-Oberflächen auf. ALP-Aktivität wurde als Absorption bei 405 nm gemessen. Bar Graph zeigt nach 60 min Reaktions erfassten Daten. Die Fehlerbalken zeigen die Standardabweichung, n = 3, * p <0,01. (C) C2C12 Zellen wurden auf Flächen angegeben und kultiviert für 6 Tage unter niedrigen Serum-Bedingungen ausgesät myogenesis zu ermöglichen. Bilder zeigen Myosin schwere Kette (MHC)-Färbung von vielkernigen Myotuben (grün) und DAPI-Färbung Kerne (blau). Bildvergrößerung 20x.
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Discussion
In diesem Protokoll beschreiben wir die Herstellung von Oberflächen mit bioaktiven rhBMP-2 funktionalisiert ist. Dieser Ansatz weist zwei Schritte auf: 1) die anfängliche Bildung einer selbstorganisierenden Monoschicht (SAM) eines bifunktionellen Linkers an der Goldoberfläche, 2) kovalente Immobilisierung von rhBMP-2-Proteins. In früheren Arbeiten, validiert man die effektive Bindung des bifunktionellen Linker und dem Wachstumsfaktor, und zeigten, dass auf der Oberfläche immobilisierten rhBMP-2 behält seine biologische Aktivität 19. Die Bioaktivität von Wachstumsfaktoren in einer immobilisierten Form vorgelegt wurde auch in anderen Studien gezeigt worden, daß die Freisetzung der Proteine und deren anschließende Internalisierung nicht wesentlich sind für die Zellstimulation 24,25. In der Tat ist die kovalente Immobilisierung von Wachstumsfaktoren kann die anhaltende Stimulation der Zielzellen, während eine wirksame Dosierung wegen der verbesserten Auslastung der verschiedenen Typen von Rezeptoren an der Zellmembran 22,23,26-28.
Zur Herstellung von Oberflächen immobilisiert präsentiert rhBMP-2, es sollte bei der Handhabung der Oberflächen während des gesamten Verfahrens und bei der Herstellung des rhBMP-2-Lösung aufgenommen werden. Die Deckgläser sollten sauber und trocken sein und keine Anzeichen von Mangel oder Verunreinigungen sichtbar sein soll. Kratzer auf der Oberfläche mit einer Pinzette und Pipetten zu vermeiden. Für die Funktionalisierung der Oberfläche Schritt mit rhBMP-2 ist es wichtig, eine trägerfreie rekombinante Protein, dh ohne Zugabe von Rinderserumalbumin bei der Herstellung zu verwenden, um unerwünschte Immobilisierung des Trägers auf der Oberfläche zu vermeiden. Das rhBMP-2 stock (100 ug / ml) in 4 mM HCl gelöst. Bei Oberflächen mit dem rhBMP-2-Lösung inkubiert, sollte der pH-Wert neutral bis leicht alkalischen pH-Wert eingestellt werden, um die Reaktion der Aminogruppe des Proteins mit der NHS-Gruppe des oberflächengebundenen Linker verbessern. Wenn der pH zu niedrig ist, kann der NHS-Gruppe hydrolysiert wird, bevor es nämlich zu reagierenh die Aminogruppen des Proteins. Wir verwenden PBS mit 1 M NaCl 29 und fügen rhBMP-2 von Lager und dann den pH-Wert mit KOH (10 mM).
Mit diesem Protokoll konnten wir die erfolgreiche Immobilisierung von bioaktiven rhBMP-2 auf Oberflächen, weil: 1) Wir haben eine Zwei-Schritt-Ansatz, 2) verwendeten wir einen geeigneten Linker Abstand von der Oberfläche zu erhalten und um das Protein ohne größere Störungen auf ihrer binden Wechselwirkung mit dem Rezeptor. Die aminreaktiven Alkanthiol, 11-mercaptoundecanoyl-N-hydroxysuccinimidester (NHS-MU) wurde im ersten Schritt auf die Goldsubstrat gebunden. Als Alkanthiole Selbstorganisation von Metallen wie Gold, bilden eine hoch geordnete Monoschicht, erleichtern sie die Dekoration von Oberflächen mit einer Vielzahl von Linkermolekülen 30-32. Die SAM abschirmt Biomoleküle vom direkten Kontakt mit Festkörperoberfläche, wodurch das Risiko der Denaturierung 32 minimiert wird. Ferner ist die Länge des Linkers bestimmt auch die REActivity der SAM. Die NHS-Gruppen der Linker aus mindestens elf Kohlenstoffatomen, wie die MU-NHS, sind erreichbar, was zu einer erhöhten Protein Immobilisierung im Vergleich zur Bindung an kürzeren Linker 34. Die Immobilisierung von rhBMP-2 erfolgt durch die Verschiebung der NHS-Gruppe durch Lysinreste des Proteins 34. Berücksichtigung lediglich der sterischen Umgebung, die Reaktion der Oberfläche immobilisierten NHS-Gruppen am ehesten an den flexiblen N-terminalen Reste 35 erfolgt. Jedoch, wie für andere Liganden dargestellt, die Länge und die Flexibilität des Linkers kann die Interaktion mit ansonsten sterisch gehinderten Bindungsstellen zu ermöglichen, dadurch zu kompensieren ungünstigen Orientierung 36,37. In unveröffentlichte Arbeit haben wir die einstufige mit einem zweistufigen Immobilisierungsstrategie verglichen. Der Vergleich zwischen der Verwendung einer Lösung sowohl Protein und Linker, und die sequentielle Oberflächenbindung des Linkers und dem Protein enthält, zeigte, dass nur die zweiSchritt-Strategie führte zu bioaktiven Liganden-Immobilisierung. Dies könnte auf eine Abschirmwirkung des SAM, die Denaturierung von Proteinen, die ansonsten auf Gold stattfinden könnte behindert sein. Da der Linker ist bereits an der Oberfläche verankert, Vernetzung zwischen Proteinen durch die Endgruppen des Linkers und die daraus resultierenden Inaktivierung umgangen 38.
Für die Versuche mit Zellen, die mit der Oberfläche immobilisierten rhBMP-2 stimuliert wird, ist es wichtig, vorher zu bestimmen, dass keine Myotuben C2C12 in der Kulturflasche, bevor sie auf das Substrat Impfen bilden. Daher müssen auf subkonfluenten Zellen in Kultur gehalten werden. Die Charge von fetalem Kälberserum für die Kultivierung und für die Experimente verwendet wurde, um getestet, um sicherzustellen, dass keine osteogene Stimuli vorhanden sind. Dies wird durch Verwendung des Quantikine Assay zum Nachweis von Knochen-morphogenetischen Proteinen und durch Testen der Zellen für osteogene Differenzierungsmarker durchgeführt, z. B. Alkal ine Phosphatase Ausdruck. Bei der Handhabung der Substrate für die Stimulation von der Spitze der Kulturen, ist es wieder wichtig, keine Kratzer mit der Pinzette zu vermeiden. Die Trocknung der Kultur und Quetschen der Zellen sollte in jedem Fall vermieden werden, da sonst Verzerrungen Zelle und der Tod wird sich negativ auf die Antwort auf BMP-2 Stimulation. Wir empfehlen Pipettieren etwa 100 ul DMEM in jede Vertiefung einer Platte mit 6 Vertiefungen, wo die Zellen vor dem Aufbringen des Substrats auf die Zellen kultiviert werden. Die Zellen sollten unter dem Mikroskop beobachtet, um sicherzustellen, daß keine morphologischen Veränderungen werden durch das Vorhandensein der Flächen auf der Oberseite der Kulturen ausgelöst werden. Schließlich, wenn das Entfernen der Substrate, eine Seite wird sorgfältig mit der Pinzette angehoben, und das Substrat wird vorsichtig abgezogen. Eine sofortige Überprüfung für jeden Zellschäden mit einer Hellfeld-Mikroskop durchgeführt werden soll, sowie ein Check der Substrate, um festzustellen, ob Zell Anbindehaltung oder größeren Verunreinigungen vorhanden sind.
_content "> Abschließend bietet die vorgestellte Zwei-Schritt-Verfahren ein nützliches Werkzeug, um rhBMP-2 über seine Aminreste auf Substraten zu immobilisieren, um ihre Auswirkungen auf die Zellreaktionen zu studieren. Die beschriebene Strategie vereint viele Vorteile. Auf der einen Seite ist es nicht BMP-2 beschränkt, sondern es kann auch zu anderen Wachstumsfaktoren der BMP-Familie angewandt werden, da sie eine stark konservierte Aminosäurestruktur präsentieren. Auf der anderen Seite, durch unspezifische Adsorption zu verhindern, ist dieser Ansatz ermöglicht eine gezielte Untersuchung von BMP-2 , während die Verringerung der Menge an Wachstumsfaktor und, vor allem, behindern unkontrollierten Freisetzung von der Oberfläche.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Autoren haben nichts zu offenbaren.
Acknowledgments
Wir danken Prof. JP Spatz (Institut für Biophysikalische Chemie, Universität Heidelberg und der Abteilung Neue Materialien und Biosysteme, Max-Planck-Institut für Intelligente Systeme, Stuttgart) für die freundliche Unterstützung. Die finanzielle Unterstützung von der Max-Planck-Gesellschaft und der Deutschen Forschungsgemeinschaft (DFG SFB/TR79 EAC-A.) Sind ebenfalls sehr anerkannt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| N-hydroxysuccinimide | Sigma-Aldrich | 130672 | |
| 4-(dimethylamino)pyridin | Sigma-Aldrich | 522805 | |
| Acetone | AppliChem | A2282 | |
| 11-mercaptoundecanoic acid | Sigma-Aldrich | 674427 | |
| Dichlormethane | Merck | 106050 | |
| N,N'-dicyclohexylcarbodiimide | Sigma-Aldrich | D80002 | |
| Petroleum benzene | Merck | ||
| Glass coverslips | Carl Roth | M 875 | |
| Ethylacetate | AppliChem | A3550 | |
| Methanol | Carl Roth | 4627 | |
| N,N-dimethylformamide | Carl Roth | T921 | |
| rhBMP-2 | R&D Systems | 355-BM | Carrier-free; expressed in E.coli |
| PBS | PAA | H15-002 | |
| NaCl | Carl Roth | HN00.2 | |
| Poly(dimethyl siloxane) (PDMS) | Dow Corning | ||
| Sylgard 184 silicone elastomer kit | Dow Corning | ||
| Anti-rhBMP-2 | Sigma | B9553 | |
| Goat anti-mouse IgG-HRP | Santa Cruz | sc-2005 | Secondary antibody |
| Ampliflu Red assay | Sigma | 90101 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) (1x), liquid | Gibco | 41966 | High glucose |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma | F7524 | Sterile filtered, cell culture tested |
| Pen/Strep | Gibco | 15140 | |
| Trypsin 0.05% (1x) with EDTA 4Na | Gibco | 25300 | |
| Glycine (0.1 M) | Riedel-de Haën | 33226 | |
| IGEPAL CA-630 (1%) | Sigma | I8896 | Lysis buffer (ALP assay)19 |
| Magnesium chloride (MgCl2)(1 mM) | Carl Roth | HNO3.2 | |
| Zinc chloride (ZnCl2) (1 mM) | Carl Roth | 3533.1 | |
| p-nitrophenylphosphate (pNPP) | Sigma | S0942 | Phosphatase substrate |
| Anti-mysin heavy chain (MHC) | Developmental Studies Hybridoma Bank, University of Iowa | MF20 | Monoclonal antibody |
| Alexa Fluor 488 Goat anti-mouse IgG | Invitrogen | A11001 | |
| DAPI | Sigma | D9542 | |
| Equipment | |||
| Ultrsonic bath (Sonorex Super RK 102H), Frequency 35 kHz | BANDELIN electronic GmbH Co. KG | ||
| MED 020 Sputtercoating system | BAL-TEC AG | Coating conditions Cr: 120 mA, 1.3 x 10-2 mbar, 30 sec Au: 60 mA, 5.0 x 10-2 mbar, 45 sec |
|
| Tecan Infinite M200 Plate reader | Tecan | ||
References
- Helm, G., Andersson, D., et al. Summary statement: Bone morphogenetic proteins: Basic science. Spine. 27 (16S), S9 (2002).
- Hogan, B. Bone morphogenetic proteins: multifunctional regulators of vertebrate development. Genes Dev. 10 (13), 1580-1594 (1996).
- Reddi, A. BMPs: from bone morphogenetic proteins to body morphogenetic proteins. Cytokine Growth Factor Rev. 16, 249-250 (2005).
- Rengachary, S. Bone morphogenetic proteins: basic concepts. Neurosurg Focus. 13 (6), 1-6 (2002).
- Schlunegger, M., Grütter, M. An unusual feature revealed by the crystal structure at 2.2 Å; resolution of human transforming growth factor-β2. Nature. 358, 430-434 (1992).
- Scheufler, C., Sebald, W., Hülsmeyer, M. Crystal structure of human bone morphogenetic protein-2 at 2.7 Å resolution. J. Mol. Biol. 287 (1), 103-115 (1999).
- Nimni, M. Polypeptide growth factors: targeted delivery systems. Biomaterials. 18 (18), 1201-1225 (1997).
- Wozney, J., Rosen, V. Bone morphogenetic protein and bone morphogenetic protein gene family in bone formation and repair. Clin. Orthop. Related Res. 346, 26 (1998).
- Rosen, V. BMP and BMP inhibitors in bone. Annals of the New York Academy of Sciences. 1068, 19-25 (2006).
- Kirsch, T., Sebald, W., Dreyer, M. K. Crystal structure of the BMP-2-BRIA ectodomain complex. Nat. Struct. Biol. 7 (6), 492-496 (2000).
- Keller, S., Nickel, J., et al. Molecular recognition of BMP-2 and BMP receptor IA. Nat. Struct. Mol. Biol. 11 (5), 481-488 (2004).
- Miyazono, K., Maeda, S., Imamura, T. BMP receptor signaling: transcriptional targets, regulation of signals, and signaling cross-talk. Cytokine Growth Factor Rev. 16 (3), 251-263 (2005).
- Nohe, A., Hassel, S., et al. The mode of bone morphogenetic protein (BMP) receptor oligomerization determines different BMP-2 signaling pathways. J. Biol. Chem. 277 (7), 5330-5338 (2002).
- Sieber, C., Kopf, J., et al. Recent advances in BMP receptor signaling. Cytokine Growth Factor Rev. 20 (5-6), 343-355 (2009).
- Carragee, E. J., Hurwitz, E. L., Weiner, B. K. A critical review of recombinant human bone morphogenetic protein-2 trials in spinal surgery: emerging safety concerns and lessons learned. Spine J. 11, 471-491 (2011).
- Luginbuehl, V., Meinel, L., et al. Localized delivery of growth factors for bone repair. Eur. J. Pharm. Biopharm. 58 (2), 197-208 (2004).
- Nakaji-Hirabayashi, T., Kato, K., et al. Oriented immobilization of epidermal growth factor onto culture substrates for the selective expansion of neural stem cells. Biomaterials. 28 (24), 3517-3529 (2007).
- Gonçalves, R., Martins, M., et al. Bioactivity of immobilized EGF on self-assembled monolayers: Optimization of the immobilization process. J. Biomed. Mater. Res. Part A. 94A. 2 (2), 576-585 (2010).
- Pohl, T. L. M., Boergermann, J. H., et al. Surface immobilization of bone morphogenetic protein 2 via a self-assembled monolayer formation induces cell differentiation. Acta Biomater. 8 (2), 772-780 (2012).
- Love, J., Estroff, L., et al. Self-assembled monolayers of thiolates on metals as a form of nanotechnology. Chem. Rev. 105 (4), 1103-1169 (2005).
- Katagiri, T., Yamaguchi, A., et al. Bone morphogenetic protein-2 converts the differentiation pathway of C2C12 myoblasts into the osteoblast lineage. J. Cell Biol. 127 (6), 1755-1766 (1994).
- Whitaker, M. J., Quirk, R. A., et al. Growth factor release from tissue engineering scaffolds. J. Pharm. Pharmacol. 53 (11), 1427-1437 (2001).
- Uludag, H., D'Augusta, D., et al. Implantation of recombinant human bone morphogenetic proteins with biomaterial carriers: a correlation between protein pharmacokinetics and osteoinduction in the rat ectopic model. J. Biomed. Mater. Res. 50 (2), 227-238 (2000).
- Kashiwagi, K., Tsuji, T., et al. Directional BMP-2 for functionalization of titanium surfaces. Biomaterials. 30 (6), 1166-1175 (2008).
- Karageorgiou, V., Meinel, V. L., et al. Bone morphogenetic protein-2 decorated silk fibroin films induce osteogenic differentiation of human bone marrow stromal cells. J. Biomed. Mater. Res. 71 (3), 528-573 (2004).
- Rose, F. R. A. J., Hou, Q., et al. Delivery systems for bone growth factors - the new players in skeletal regeneration. J. Pharm. Pharmacol. 56 (4), 415-427 (2004).
- Masters, K. S. Covalent growth factor immobilization strategies for tissue repair and regeneration. Macromol. Biosci. 11 (9), 1149-1163 (2011).
- Crouzier, T., Fourel, L., et al. Presentation of BMP-2 from a soft biopolymeric film unveils its activity on cell adhesion and migration. Adv. Mater. 23 (12), H111-H118 (2011).
- Ruppert, R., Hoffmann, E., et al. Human bone morphogenetic protein 2 contains a heparin-binding site which modifies its biological activity. European Journal of Biochemistry. 237 (1), 295-302 (1996).
- Love, J., Estroff, L., et al. Self-assembled monolayers of thiolates on metals as a form of nanotechnology. Chem. Rev. 105 (4), 1103-1169 (2005).
- Kato, K., Sato, H., Iwata, H. Immobilization of histidine-tagged recombinant proteins onto micropatterned surfaces for cell-based functional assays. Langmuir. 21 (16), 7071-7075 (2005).
- Martins, M., Curtin, S., et al. Molecularly designed surfaces for blood deheparinization using an immobilized heparin-binding peptide. J. Biomed. Mater. Res. 88 (1), 162-173 (2009).
- Limbut, W., Kanatharana, P., et al. A comparative study of capacitive immunosensors based on self-assembled monolayers formed from thiourea, thioctic acid, and 3- mercaptopropionic acid. Biosens. Bioelectron. 22 (2), 233-240 (2006).
- Patel, N., Davies, M., et al. Immobilization of protein molecules onto homogeneous and mixed carboxylate-terminated self-assembled monolayers. Langmuir. 13 (24), 6485-6490 (1997).
- Hu, J., Duppatla, V., et al. Site-specific PEGylation of bone morphogenetic protein-2 cysteine analogues. Bioconjug. Chem. 21 (10), 1762-1772 (2010).
- Hersel, U., Dahmen, C., Kessler, H. RGD modified polymers: biomaterials for stimulated cell adhesion and beyond. Biomaterials. 24 (24), 4385-4415 (2003).
- Cao, T., Wang, A., et al. Investigation of spacer length effect on immobilized Escherichia coli pili-antibody molecular recognition by AFM. Biotechnol. Bioeng. 98 (6), 1109-1122 (2007).
- Puleo, D., Kissling, R., Sheu, M. A technique to immobilize bioactive proteins, including bone morphogenetic protein-4 (BMP-4), on titanium alloy. Biomaterials. 23 (9), 2079-2087 (2002).
