Summary
Bu yüzeylerde BMP-2 etkin hareketsiz hale getirmeye yönelik bir metodu tarif etmektedir. Yaklaşımımız serbest amin kalıntısı ile BMP-2 bağlanması kovalent elde etmek için bir kendi kendine monte tek tabaka oluşumuna dayanır. Bu yöntem, hücre membranında sinyalini incelemek için yararlı bir araçtır.
Abstract
Kemik morfogenetik protein 2 (BMP-2), kemik dokusunun hücre dışı matris içinde gömülü bir büyüme faktörüdür. Bu şekilde iyileşme ve de novo kemik oluşumunu stimüle osteoblastlar içine mezenkimal hücre farklılaşmasının tetikleyici olarak BMP-2 davranır. Iskeleleri ile birlikte rekombinant insan BMP-2 (rhBMP-2) klinik kullanımı sunum moduna göre, son tartışmalar yükseltti ve miktarı teslim edilecek. Burada sunulan protokol hücreler üzerinde in vitro çalışmalar için BMP-2 sunmak için basit ve verimli bir yol sağlamaktadır. Bir heterobifonksiyonel bağlayıcının bir öz monte tek tabaka oluşturmak üzere nasıl tarif ve rhBMP-2 kovalent immobilizasyon elde etmek için daha sonraki bağlanma aşamasını göstermektedir. Bu yaklaşımla, bu proteinin biyolojik aktivitesini muhafaza ederken, BMP-2 sürekli bir sunum elde etmek mümkündür. Aslında, BMP-2 yüzey hareketsiz spesifik reklamlar önleyerek hedef inceleme sağlar:orption, büyüme faktörü miktarının azaltılması ve süre, en önemlisi de, yüzeyden kontrolsüz salınmasını engellemektedir. Hücreler, kovalent olarak hareketsizleştirilmiş rhBMP-2 sunulması yüzeylere maruz kaldıkları zaman, BMP-2 tetiklediği hem kısa hem de uzun süreli sinyal olaylarının BMP-2 ile uyarılması, hücre tepkileri ile ilgili in vitro çalışmalar için bu yaklaşım uygun hale yer alıyor.
Introduction
Kemik morfogenetik protein 2 (BMP-2), transforme edici büyüme faktörü (TGF-β) ailesi ve de novo kemik oluşumunun indükleyici hem de embriyonik gelişim ve yetişkin sırasında çeşitli dokuların düzenleyicisi olarak işlev görür 1-3 homeostasis bir üyesidir. Biyolojik olarak etkin olan homodimerik BMP-2 proteininin her bir monomer son derece tüm BMP 4 korunan bir "sistein düğüm" motifi içerir. Yedinci sistein iki monomer 5,6 arasında moleküller arası bir bağ oluşturan, dimerizasyon katılır ise yedi sistein kalıntılarının altı, her bir monomerin kararlı moleküller arası disülfid bağı oluşturur. Bu yüksek ölçüde korunmuş sistein düğüm BMP-2 proteininin üç boyutlu yapısını tanımlar ve bu ısı, denatüranlar ve asidik pH 7-9 karşı direnç gibi eşsiz özelliklerini belirler. BMP-2, böylece sinyal iletiminin uyarılması, serin / treonin kinaz zar reseptörlerine bağlanan
Kemik, BMP-2, böylece iyileşmesi ve kemik de novo oluşumunu teşvik edici, osteoblastlar içine mezenkimal kök hücrelerin farklılaşmasını indükler. Şu anda, rekombinant BMP-2 sitelerinin kırık iyileşmesini artırmak için klinik olarak uygulanır ifade edilmiştir. Kemik doku mühendisliğinde yaygın bir strateji, lokal verme sistemleri ile karşılaştırıldığında daha az invaziv bir enjekte edilebilir büyüme faktörleri, kullanılmasıdır. Bununla birlikte, in vivo çalışmalarda ve klinik uygulamalar göstermiştir ki, sahip olduğu kısa biyolojik yarı-ömür, spesifik olmayan locAdalet ve Hafıza ve BMP-2 hızlı lokal temizleme çeşitli lokal ve sistemik sorunlara ektopik 15 yol açabilir. Bu nedenle, etkili bir sunum, malzeme içinde veya üzerinde BMP-2'nin sürüklenmesini veya immobilizasyon elde etmek için, hedef bölgede, yerel ve sürekli uygulama için de gereklidir. Sürekli teslim gibi fiziksel olarak yakalanmalarında, adsorpsiyon ya da iyon kompleks 16 gibi kovalent olmayan bir tutma yaklaşımlar ile elde edilebilir. Bununla birlikte, bilinen bu moleküllerin 17 denatürasyonda yüzeylerine proteinlerin spesifik olmayan adsorpsiyon olabilir neden olur. Büyüme faktörlerinin bağlanması kovalent için, desteklerin farklı son on yıl içinde geliştirilmiştir. Örneğin, proteinin amino ya da karboksil grupları hedefleyen iki işlevli bağlama moleküllerinin kullanılması, zorunlu olarak hareketsiz hale elde etmek için protein modifikasyonu gerektirmeyen yaklaşımın bir türüdür. Aslında, ise protein modifikasyonu, protein yönünü kontrol etme avantajını sunmaktadıryapay etki, peptit etiketleri ve bölgeye özgü zincirlerinin giriş büyüme biyolojik aktivitesi 17 faktörleri değiştirebilir. Bu durumda, bağlı destek malzemesi ile etkileşim için denatürasyon aşmak için, yüzeyler istenilen faktörü 18 bağlanması ve ardından bir bağlayıcı molekülün bir kendi kendine monte tek tabaka (SAM) ile, örneğin, önceden işlevselleştirilebilir. Bu serbest amin kalıntıları hedefleyerek kovalent bir yüzey üzerine BMP-2 kılınması için bir SAM tabanlı bir yaklaşım kullandık ve hareketsizleştirilmiş protein kısa ve uzun süreli biyolojik aktiviteye 19 hem de muhafaza göstermiştir. Bu protokol, hücre membranında meydana gelir ve osteojenik sinyalizasyon sorumlu hücre içi sinyal düzenleyen mekanizmaları üzerinde in vitro çalışmalar için hücrelere BMP-2 sunmak için basit ve verimli bir yol sağlamaktadır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1.. 11-Mercaptoundecanoyl-N-hidroksisüksinimid ester (MU-NHS) sentezi
- Oda sıcaklığında (RT) 40 ml diklorometan (pa), 10 ml aseton (PA) (dimetilamino) piridin 1 g 11-mercaptoundecanoic asit - bir 500 mg N-hidroksisüksinimid çözeltisi ve 30 mg 4 damla damla ilave edildi.
- 0 ° C'ye soğutun ve reaksiyon, damla damla 1.1 g N, (azot atmosferi altında) 10 ml diklorometan içinde N '-disikloheksilkarbodiimid ekleyin. 1 saat boyunca düşük ısıda reaksiyonu Ol ve daha sonra gece boyunca oda sıcaklığında karıştırın.
- Çökeltiyi filtre edin ve indirgenmiş basınç altında kurutun. 1:1 'lik bir oranda petrol benzen ve etil asetat (pa) ile flaş kromatografisi ile ürünü saflaştırmak.
2. Homojen Altın Katmanlar hazırlanması
- Hassas mendil ile ve etil asetat (pa) ve metanol (pa) 1:1 'lik bir karışımını içeren bir çözelti içinde 5 dakika boyunca ses dalgalarına maruz bunları temiz cam lameller. Rinse, metanol ile alt-tabakalar ve azot akışı altında kurutulur.
- Püskürtmeli kaplama cihazı içinde temiz yüzeylerde yerleştirin. Odasını boşaltın. 60 saniye için püskürtme ile krom hedeften en üst krom oksit katmanı kaldırın. Metal kiriş ve bir 40 nm altın tabakası ile kaplanması, ardından bir 10 nm krom tabaka ile kaplama, onları altında numuneler.
3. BMP-2 yüzey immobilizasyonu
- Yaklaşık 1 mM'lik nihai bir konsantrasyona kadar N, MU-NHS, N-dimethlyformamide (DMF) içinde eritin ve azot atmosferi altında 4 saat boyunca oda sıcaklığında MU-NHS çözeltisi içinde altın substratlar inkübe edin.
- 2 dakika boyunca DMF içinde sonikasyon yüzeyler, DMF ve MeOH ile durulayın ve azot akışı altında kurutulur.
- 100 ug / ml (-80 ° C'de saklayın alikotları) 'lik bir konsantrasyonda steril 4 mM HCI rhBMP-2'ye ait bir stok çözelti hazırlayın. Çalışma seyreltileri (3.5 ug / ml) için, PBS / NaCl (PBS, 1 M NaCl ihtiva eden) ve bir de stok solüsyonu seyreltikkullanımdan hemen önce pH 8.5 'e djust.
- Gece boyunca 4 ° C'de rhBMP-2 çalışma çözeltisi içinde MU-NHS işlevselleştirilmiş yüzeyleri inkübe edin. Kuluçka Süpernatantı. Sonikasyon 2 dakika boyunca PBS / NaCI yüzeyler ve steril PBS / NaCI ile 3 kez yıkayın.
4. Yüzey Karakterizasyonu
- Antikorun spesifik olmayan bir şekilde emilmesi bloke etmek için,% 5 BSA ile inkübe yüzeyleri (w / v) bir anti-BMP-2 antikoru (1:100 içinde% 1 (ağırlık / hacim ile inkübasyon ve ardından oda sıcaklığında 1 saat için PBS solüsyonunda oda sıcaklığında 1 saat için) BSA / PBS çözeltisi). PBS ve 30 saniye süreyle sonikasyon ile iki kez yüzeyleri yıkayın.
- Daha sonra PBS ile iki kere yıkayın, oda sıcaklığında 30 dakika için HRP ile konjüge edilmiş sekonder antikor (1:1000 içinde% 1 (w / v) BSA / PBS çözeltisi) ile alt-tabakaların inkübe edin.
- Bir levha okuyucu ile 570 nm de HRP enzimatik aktivitesinin ölçülmesi için Ampliflu kırmızı deneyi kullanarak.
5. Biyolojik Aktivite Analizi
- 6-çukurlu pl içinde göz başına 1 x 10 tohum 5 fare C2C12 miyoblastlardır% 10 FBS,% 1 penisilin / streptomisin ve 37 ° C /% 5 CO2 seviyesinde 24 saat boyunca inkübe ile takviye piruvat içeren yüksek glukoz DMEM oluşan büyüme ortamı içinde Ateş,.
- Hareketsiz BMP-2 dekore yüzeylere tohumlanmasından önce 3-5 saat boyunca serumsuz DMEM hücreleri açlıktan.
- Kısa süreli sinyal indüksiyon araştırılması için, 200 ul taze serum içermeyen DMEM ile orta yerine ve hücreler üzerinde hareketsizleştirilmiş BMP-2 yüzeyleri yerleştirin. Yüzeyi çizmemek için ince uçlu cımbız ile ele alınmalıdır.
- Yumuşak yüzeyleri çıkarın ve bir pipet ile ortam aspire, PBS ile iki kez hücreleri yıkayın. Hücre yanıtlarının analizi geçin.
- Uzun süreli biyolojik aktivite, levha hücrelerin analizi için üzerine, altı gün boyunca düşük serum koşullarına (% 2 FBS) içinde 37 ° C /% 5 CO2 ile yüzeyler ve kültür onları.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bir biyolojik belirsiz fakat kimyasal akort sistemi sağlar beri bizim kurulum, altın yardımcı madde olarak seçildi. Dahası, kendi kendine bir araya tek katmanlarının uygulanması pek çok avantaj içerir: bunların fonksiyonel uç-gruplar ayrıca modifiye edilebilir ise SAMs kendiliğinden, metaller ve az kusurları ile bir şekilde tek tabakaları üzerinde kendi "baş grupları" ile adsorbe. Böylece kontrollü ama son derece uyarlanabilir şekilde 20 arabirimi özelliklerini uyarlamak için bir platform sağlar.
Gold kaplı yüzeylerde BMP-2 hareketsizleştirilmesi için, iki aşamalı bir yaklaşım kullanılır: 1) 2)) Şekil 1 (protein ile reaksiyona sokulması daha sonra bağlayıcı bir altın tabakası için MU-NHS bağlayıcı bağlama, vb. RhBMP-2'nin bağlanma kanıtlamak için, bir enzim immünolojik kullanılır. Bu deneyde, rhBMP-2, BMP-2 spesifik antikor ve HRP ile konjüge edilmiş ikincil antikor ile inkübe edilmiştir hareketsiz sunulması yüzeyleri. Ikincisinin bağlanma d edilebilirBir Ampliflu Red çözeltisi kullanılarak etermined. Hidrojen peroksit varlığında, HRP floresan bileşiği, resorufine içine renksiz Ampliflu Red (10-asetil-3 ,7-dihydroxyphenoxazine) dönüşümünü katalize eder. Bu hareketsiz kılınmış yüzeye tespit rhBMP-2 (iBMP-2) önce ve işlevselleştirilmiş yüzeyler ile üstten yapışık hücreler yaklaşan sonra. Ampliflu Kırmızı deneyi ile rhBMP tespiti için, numuneler çeşitli İnkübasyon ve tedavilere tabi olduğunu lütfen unutmayın. Bu nedenle, bu. Şekil 2A, anti-BMP-2 IgG tarafından tanınan bir konformasyonda yüzeyine rhBMP-2'nin başarılı bir bağlanma gösterir önce ve hücre uyarma işleminden sonra aynı yüzeyini incelemek için uygun değildir. Şekil 2B, bir iBMP- önce HRP bağışıklık tahlili ile 30 dakika boyunca hücrelerini uyarmak için kullanılan 2 yüzeyi. Hatta cep uyarılmasından sonra protein yüzeyi üzerinde tespit edilir.
Hareketsiz rh sunulması yüzeylere hücre yanıtlarıBMP-2 değerlendirilir ve tedavi edilmemiş altın alt-tabakalar (negatif kontrol) etkisi ile karşılaştırılmıştır. Kısa süreli sinyal analizine yapışma sürecinin etkisini en aza indirmek amacıyla, özel bir set up-hücresi uyarımı için geliştirilmiştir. Burada, C2C12 hücreler üst yaklaşan rhBMP-2 fonksiyonalize yüzey ile 30 dakika süreyle stimüle edildi. Fare miyoblast hücre hattı, C2C12 yaygın kas dokuları, kemik oluşumu sırasında, osteojenik farklılaşma erken evre çalışmak için bir model sistem olarak kullanılan bir pluripotent mezenkimal öncü hücre hattıdır. Bu modelde, BMP-2 myotubes çok çekirdekli hücrelerin farklılaşmasını engellemektedir ve osteoblast 21 fenotip neden olur. BMP-2 sinyal yolunun alt muhabir olan Smad 1/5/8 aktivasyonu, western lekeleme ile analiz edilir. Şekil 3A'da gösterildiği gibi, SMAD 1/5/8 hiçbir fosforilasyon meydana gelir iken, Smad fosforilasyon, iBMP-2 ile 30 dakika uyarma işleminden sonra görülmektedirhücrelerinde işlenmemiş altın örnekleri maruz bırakılmıştır. Bu sonuç immobilizasyon işlemi BMP-2 kısa vadeli etkinliğini değiştirebilir ve Smad sinyalizasyon erken adımları tetikler olmadığını gösterir.
IBMP-2 uzun süreli osteojenik farklılaşmasını etkileyen olup olmadığını belirlemek için, alkalin fosfataz (ALP) ekspresyon seviyesi, bir osteojenik işaretleyici, bir kolorimetrik deney ile araştırılmıştır. C2C12 hücre ALP aktivitesi düz altın (kontrol) ve iBMP-2 yüzeylerde 6 gün için inkübe edildikten sonra hücreler ölçüldü. IBMP-2 yüzeyler üzerinde kültürlenmiştir hücre lizatlarında ALP aktivitesi kontrol (Şekil 3B) ile karşılaştırıldığında önemli ölçüde daha yüksek emme gösterir. Bu sonuç, iBMP-2 C2C12 hücrelerinde osteojenik işaretleyici ALP ekspresyonunu uyardığını ortaya koymaktadır. Bu hücre hattı, böylece miyotüplerinin biçimlendirilmiş ve karakteristik miyojenik proteinleri ifade eden, düşük serum koşul altında ulaşan konfluansa üzerine ayırt bilinmektedir. Bununla birlikte, BMP-2 ile muamele bir kaymaya nedenBu nedenle miyotüplerinin oluşumunu bastırmak osteoblastik miyoblastik arasındaki farklılaşma yolu. Miyogenesis on iBMP-2 etkisini incelemek için hücreler, C2C12 altın (kontrol) ya da fonksiyonalize yüzeyleri ve farklılaşması (düşük serum) koşullar altında kültüre doğrudan ekildi. 6 gün sonra, miyozin ağır zincir (MHC) ve boyama uygulandı. Şekil 3C'de gösterildiği gibi, hücreler, C2C12 iBMP-2'nin varlığında, MHC pozitif miyotüplerinin oluşturulması için başarısız değil, altın yüzeylerde.
Şekil 1. Altın yüzeyler üzerine rhBMP-2'nin hareketsizleştirme işlemi şeması. Cam lameller bir altın tabakası ile kaplanmış ve daha sonra a-NHS fonksiyonalize kendinden düzenlenen tek tabaka (SAM) ile sonuçlanan bir heterobifonksiyonel bağlayıcı (MU-NHS) ile inkübe edilir. BMP-2, birincil aminler, co açan bağlayıcı ile tepkimeyetabaka üzerinde valently hareketsiz protein. büyük rakam görmek için buraya tıklayın .
Şekil 2. RhBMP-2 (A) 'daha önce enzimatik immüno tespit hem de (B) hücre uyarma deneyleri. Hareketsizleştirilmiş rhBMP-2 Ampliflu Red kolorimetrik deneyi kullanılarak nicelleştirilmiştir sonra olabilir Yüzeye bağlı. Absorpsiyon 570 nm'de ölçüldü ve veriler (altın yüzeyleri olmayan muamele) değerlerini kontrol etmek için normalize edildi. Hata çubukları, ortalamanın n> 3, standart sapmayı temsil ederler.
Şekil 3,. İmmobilize rhBMP-2 biyolojik olarak aktif kalır ve kısa vadeli olarak indükleryanı sıra uzun süreli sinyal olayları. (A), kovalent olarak hareketsizleştirilmiş hücreler C2C12 rhBMP-2 (iBMP-2) üstten yaklaşan altın yüzeyleri (kontrol) ve yüzeylere maruz bırakılarak 30 dakika boyunca uyarıldı. Hücre parçalama sonra örnekler p-Smad1/5/8 ve β-aktin için imüno edilmiştir. (B) alkali fosfataz enzimatik aktivitesi (ALP) C2C12 hücrelerin osteojenik farklılaşmasını gösteren ve 6 günlük bir inkübasyondan sonra hücre lizatları ölçülmüştür kontrol veya sırasıyla iBMP-2 yüzeylerde dönem. ALP aktivitesi 405 nm'de absorbans ölçüldü. Çubuk grafik gösterileri 60 dakika reaksiyondan sonra elde edilen veriler. Hata çubukları 0.01. (C) C2C12 hücreleri Miyogenesis izin vermek için, düşük serum koşullar altında 6 gün boyunca belirtilen yüzey ve kültüre üzerinde tohumlandı * p <, standart sapma gösterir, n = 3. Görüntüler miyozin ağır zinciri çekirdekli miyotüplerinin (MHC) boyama (yeşil) ve DAPI çekirdekleri boyanma (mavi) gösterebilir. Görüntü büyütme 20x.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu protokolde, biyoaktif rhBMP-2 ile fonksiyonelleştirilmiş yüzeylerin hazırlanmasını tarif etmektedir. , RhBMP-2 protein 2) kovalent immobilizasyon altın yüzeyi üzerinde bir çift fonksiyonlu bağlayıcı, kendi kendine bir araya tek tabaka (SAM) 1) başlangıç sistemi: Bu yaklaşım, iki adım içermektedir. Önceki çalışmada, iki fonksiyonlu linker ile büyüme faktörü bağlayıcı etkili doğrulanmış ve yüzey hareketsizleştirilmiş rhBMP-2 biyolojik aktivitesini muhafaza 19 olduğunu gösterdi. Immobilize bir formda sunulmaktadır büyüme faktörlerinin biyo-etkinliği, aynı zamanda, proteinlerin serbest bırakılması ve daha sonraki hücre içselleştirme 24,25 uyarılması için gerekli değildir belirten diğer çalışmalarda gösterilmiştir. Hücre zarı reseptörlerinin 22,2 at için farklı türde gelişmiş doluluk oranının etkin bir dozunu muhafaza ederken Aslında, büyüme faktörlerinin kovalent immobilizasyon hedef hücrelerin sürekli uyarılmasını sağlar:3,26-28.
Hareketsiz rhBMP-2, bakım sunma yüzeylerin hazırlanması için bütün işlem boyunca yüzeyleri işleme ve rhBMP-2 solüsyonunun hazırlanmasında alınmalıdır. Cam lamelleri, temiz ve kuru olmalı ve kusur veya yabancı maddelerin hiçbir belirti görünür olmalıdır. Cımbız ve pipet ile yüzeyi çizilmeye kaçınılmalıdır. RhBMP-2 kullanılarak yüzey fonksiyonlandırmalar adım için, bu yüzey üzerindeki taşıyıcının istenmeyen immobilizasyon önlemek için, hazırlanmasında ilave sığır serum albümini olmayan bir taşıyıcı madde içermeyen rekombinant proteini örneğin, kullanmak için gereklidir. RhBMP-2 stok (100 ug / ml) 4 mM HCI içinde çözülmüştür. Yüzeyler rhBMP-2 çözeltisi ile inkübe edilir, pH yüzey-bağlı bağlayıcı NHS grubu ile proteinin amino grubunun reaksiyonu geliştirmek için hafif alkali pH nötr için ayarlanmalıdır. PH değeri çok düşükse bu wit tepki önce, NHS grubunun hidroliz olabilirProteinin h amino grupları. Biz, 1 M NaCl içeren PBS ile 29 kullanımı ve stoktan rhBMP-2 ekleyin ve sonra KOH (10 mM) ile pH ayarlamak.
Çünkü bu protokol ile biz yüzeylerde biyoaktif rhBMP-2'nin başarılı immobilizasyonunu Hedefler: 1) Biz iki aşamalı bir yaklaşım kurmuştur; 2) biz yüzeyden mesafeyi elde etmek ve üzerinde büyük müdahaleler olmadan protein bağlamak için uygun bir bağlayıcı kullanılır onun reseptörü ile etkileşimi. Amin reaktif alkantiyol 11-mercaptoundecanoyl-N-hidroksisüksinimid ester (MU-NHS), birinci aşamada altın substrata yere bağlanır. Alkanetiollerin gibi bir çok sipariş tek tabaka oluşturan, altın gibi metaller üzerinde kendini toplayabilir, bunlar bağlayıcı moleküllerin çeşitli 30-32 ile yüzeylerin dekorasyon kolaylaştırmak. SAM böylece denatürasyon 32 riskini en aza indirerek, katı yüzeyi ile doğrudan temas biyomolekülleri kalkanlar. Ayrıca, bağlayıcının uzunluğu ayrıca rea belirlerSAM ctivity. MU-NHS gibi en az on karbon atomu içeren bağlayıcıların NHS grupları, daha kısa bağlayıcılar 34 bağlanma ile karşılaştırıldığında artmış bir protein immobilizasyonu ile sonuçlanan, daha erişilebilir. RhBMP-2'nin hareketsiz proteinin 34 lizin artıkları ile NHS grubunun yer değiştirmesi ile meydana gelir. Sadece sterik ortamı göz önüne alındığında, yüzey-hareketsizleştirilmiş NHS grupların reaksiyon olasılıkla esnek N-terminal kalıntılarını 35 yer alır. Diğer ligandlar için gösterildiği gibi, ancak, uzunluk ve bağlayıcının esnekliği bu şekilde olumsuz yönde 36,37 telafi, aksi takdirde, sterik olarak engellenmiş bağlanma yerleri ile etkileşim mümkün kılabilir. Yayınlanmamış çalışmalarında bir iki aşamalı bir hareketsiz stratejisi ile, bir-adım karşılaştırdık. Protein ve bağlayıcılar ve bağlayıcı ve proteinin bağlanmasını sıralı yüzey hem de ihtiva eden bir çözelti kullanılarak arasındaki karşılaştırma, göstermiştir ki, sadece ikiaşamalı bir strateji biyoaktif ligand immobilizasyon ile sonuçlanmıştır. Bu, aksi takdirde altın yer alabilir protein denatürasyonu engel SAM bir koruyucu etkisi, bağlı olabilir. Bağlayıcı zaten yüzeye demirlenir Bundan başka, bağlayıcı ve elde edilen etkisizleştirme uç grupları ile protein arasındaki çapraz bağlantı 38 etrafından edilir.
Yüzey-hareketsizleştirilmiş rhBMP-2 ile uyarılan hücreler ile deneyler için, C2C12 alt-tabaka üzerine onları tohumlanmasından önce kültür şişesi içinde miyotüplerinin oluşturmayan ki önceden belirlemek için çok önemlidir. Bu yüzden, hücreler, kültür içinde alt tutulması gerekir. Kültür için ve deneylerde kullanılan fetal sığır serumunun seri no osteojenik uyarı mevcut olduğundan emin olmak için test edilmesi gerekir. Bu, kemik morfojenik proteinlerin tespiti için Quantikine deneyi kullanarak ve osteojenik farklılaşma işaretlerinin için hücreleri test gerçekleştirilir, örneğin, alkal ine fosfataz ifade. Kültürlerin üst uyarılması için alt tabakaların işleme, bu cımbız ile herhangi bir çizik önlemek için yine önem taşımaktadır. Hücrelerin kültürü ve sıkma kurutulması başka türlü hücre bozulması ve ölümü olumsuz BMP-2 uyarılmaya verilen yanıtı etkiler, her durumda kaçınılmalıdır. Bu hücreler, hücreler üzerine alt tabakanın uygulamadan önce kültürlenir, 6 oyuklu plakanın her oyuğuna pipetle DMEM yaklaşık 100 ul önerilir. Hücreler herhangi bir morfolojik değişiklikler kültürlerin üst yüzeylerinin varlığı ile tetiklenen sağlamak için mikroskop altında dikkat edilmelidir. Tabakaları çıkarırken, son olarak, bir tarafı dikkatlice cımbız ile kaldırılır ve yüzey hafifçe sıyrılır. Parlak bir alan mikroskobu ile herhangi bir hücre hasar için hemen bir çek de herhangi bir hücre iplerini ya da büyük kirlilikler mevcut olup olmadığını belirlemek için yüzeylerde çek olarak yapılmalıdır.
_content "> Sonuç olarak, sunulan, iki aşamalı bir prosedür hücresel tepkiler üzerindeki etkisini incelemek için bu amin kalıntısı ile alt-tabakalar üzerine rhBMP-2 immobilize etmek için faydalı bir araç sağlar. tarif stratejisi birçok avantajlar sağlar. Bir yandan, bu değil BMP-2, ancak sınırlı bir yüksek ölçüde korunmuş bir amino asit yapısı sergilediklerinden, aynı zamanda, BMP ailenin diğer büyüme faktörleri uygulanabilir. Öte yandan, spesifik olmayan adsorpsiyon önleyerek, bu yaklaşım, BMP-2 araştırılması hedeflenmiş sağlar büyüme faktörünün miktarını azaltarak ve süre, en önemlisi de, yüzeyden kontrolsüz salınmasını engellemektedir.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.
Acknowledgments
Biz onun tür destek için Prof JP Spatz (Biyofizik Kimya Bölümü, Heidelberg Üniversitesi ve Yeni Malzemeler Biyosistem Bölümü, Akıllı Sistemler Max Planck Enstitüsü, Stuttgart) teşekkür ederim. Max-Planck-Gesellschaft ve Deutsche Forschungsgemeinschaft (EAC-A DFG SFB/TR79.) Gelen mali destek de büyük ölçüde kabul edilmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| N-hydroxysuccinimide | Sigma-Aldrich | 130672 | |
| 4-(dimethylamino)pyridin | Sigma-Aldrich | 522805 | |
| Acetone | AppliChem | A2282 | |
| 11-mercaptoundecanoic acid | Sigma-Aldrich | 674427 | |
| Dichlormethane | Merck | 106050 | |
| N,N'-dicyclohexylcarbodiimide | Sigma-Aldrich | D80002 | |
| Petroleum benzene | Merck | ||
| Glass coverslips | Carl Roth | M 875 | |
| Ethylacetate | AppliChem | A3550 | |
| Methanol | Carl Roth | 4627 | |
| N,N-dimethylformamide | Carl Roth | T921 | |
| rhBMP-2 | R&D Systems | 355-BM | Carrier-free; expressed in E.coli |
| PBS | PAA | H15-002 | |
| NaCl | Carl Roth | HN00.2 | |
| Poly(dimethyl siloxane) (PDMS) | Dow Corning | ||
| Sylgard 184 silicone elastomer kit | Dow Corning | ||
| Anti-rhBMP-2 | Sigma | B9553 | |
| Goat anti-mouse IgG-HRP | Santa Cruz | sc-2005 | Secondary antibody |
| Ampliflu Red assay | Sigma | 90101 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) (1x), liquid | Gibco | 41966 | High glucose |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma | F7524 | Sterile filtered, cell culture tested |
| Pen/Strep | Gibco | 15140 | |
| Trypsin 0.05% (1x) with EDTA 4Na | Gibco | 25300 | |
| Glycine (0.1 M) | Riedel-de Haën | 33226 | |
| IGEPAL CA-630 (1%) | Sigma | I8896 | Lysis buffer (ALP assay)19 |
| Magnesium chloride (MgCl2)(1 mM) | Carl Roth | HNO3.2 | |
| Zinc chloride (ZnCl2) (1 mM) | Carl Roth | 3533.1 | |
| p-nitrophenylphosphate (pNPP) | Sigma | S0942 | Phosphatase substrate |
| Anti-mysin heavy chain (MHC) | Developmental Studies Hybridoma Bank, University of Iowa | MF20 | Monoclonal antibody |
| Alexa Fluor 488 Goat anti-mouse IgG | Invitrogen | A11001 | |
| DAPI | Sigma | D9542 | |
| Equipment | |||
| Ultrsonic bath (Sonorex Super RK 102H), Frequency 35 kHz | BANDELIN electronic GmbH Co. KG | ||
| MED 020 Sputtercoating system | BAL-TEC AG | Coating conditions Cr: 120 mA, 1.3 x 10-2 mbar, 30 sec Au: 60 mA, 5.0 x 10-2 mbar, 45 sec |
|
| Tecan Infinite M200 Plate reader | Tecan | ||
References
- Helm, G., Andersson, D., et al. Summary statement: Bone morphogenetic proteins: Basic science. Spine. 27 (16S), S9 (2002).
- Hogan, B. Bone morphogenetic proteins: multifunctional regulators of vertebrate development. Genes Dev. 10 (13), 1580-1594 (1996).
- Reddi, A. BMPs: from bone morphogenetic proteins to body morphogenetic proteins. Cytokine Growth Factor Rev. 16, 249-250 (2005).
- Rengachary, S. Bone morphogenetic proteins: basic concepts. Neurosurg Focus. 13 (6), 1-6 (2002).
- Schlunegger, M., Grütter, M. An unusual feature revealed by the crystal structure at 2.2 Å; resolution of human transforming growth factor-β2. Nature. 358, 430-434 (1992).
- Scheufler, C., Sebald, W., Hülsmeyer, M. Crystal structure of human bone morphogenetic protein-2 at 2.7 Å resolution. J. Mol. Biol. 287 (1), 103-115 (1999).
- Nimni, M. Polypeptide growth factors: targeted delivery systems. Biomaterials. 18 (18), 1201-1225 (1997).
- Wozney, J., Rosen, V. Bone morphogenetic protein and bone morphogenetic protein gene family in bone formation and repair. Clin. Orthop. Related Res. 346, 26 (1998).
- Rosen, V. BMP and BMP inhibitors in bone. Annals of the New York Academy of Sciences. 1068, 19-25 (2006).
- Kirsch, T., Sebald, W., Dreyer, M. K. Crystal structure of the BMP-2-BRIA ectodomain complex. Nat. Struct. Biol. 7 (6), 492-496 (2000).
- Keller, S., Nickel, J., et al. Molecular recognition of BMP-2 and BMP receptor IA. Nat. Struct. Mol. Biol. 11 (5), 481-488 (2004).
- Miyazono, K., Maeda, S., Imamura, T. BMP receptor signaling: transcriptional targets, regulation of signals, and signaling cross-talk. Cytokine Growth Factor Rev. 16 (3), 251-263 (2005).
- Nohe, A., Hassel, S., et al. The mode of bone morphogenetic protein (BMP) receptor oligomerization determines different BMP-2 signaling pathways. J. Biol. Chem. 277 (7), 5330-5338 (2002).
- Sieber, C., Kopf, J., et al. Recent advances in BMP receptor signaling. Cytokine Growth Factor Rev. 20 (5-6), 343-355 (2009).
- Carragee, E. J., Hurwitz, E. L., Weiner, B. K. A critical review of recombinant human bone morphogenetic protein-2 trials in spinal surgery: emerging safety concerns and lessons learned. Spine J. 11, 471-491 (2011).
- Luginbuehl, V., Meinel, L., et al. Localized delivery of growth factors for bone repair. Eur. J. Pharm. Biopharm. 58 (2), 197-208 (2004).
- Nakaji-Hirabayashi, T., Kato, K., et al. Oriented immobilization of epidermal growth factor onto culture substrates for the selective expansion of neural stem cells. Biomaterials. 28 (24), 3517-3529 (2007).
- Gonçalves, R., Martins, M., et al. Bioactivity of immobilized EGF on self-assembled monolayers: Optimization of the immobilization process. J. Biomed. Mater. Res. Part A. 94A. 2 (2), 576-585 (2010).
- Pohl, T. L. M., Boergermann, J. H., et al. Surface immobilization of bone morphogenetic protein 2 via a self-assembled monolayer formation induces cell differentiation. Acta Biomater. 8 (2), 772-780 (2012).
- Love, J., Estroff, L., et al. Self-assembled monolayers of thiolates on metals as a form of nanotechnology. Chem. Rev. 105 (4), 1103-1169 (2005).
- Katagiri, T., Yamaguchi, A., et al. Bone morphogenetic protein-2 converts the differentiation pathway of C2C12 myoblasts into the osteoblast lineage. J. Cell Biol. 127 (6), 1755-1766 (1994).
- Whitaker, M. J., Quirk, R. A., et al. Growth factor release from tissue engineering scaffolds. J. Pharm. Pharmacol. 53 (11), 1427-1437 (2001).
- Uludag, H., D'Augusta, D., et al. Implantation of recombinant human bone morphogenetic proteins with biomaterial carriers: a correlation between protein pharmacokinetics and osteoinduction in the rat ectopic model. J. Biomed. Mater. Res. 50 (2), 227-238 (2000).
- Kashiwagi, K., Tsuji, T., et al. Directional BMP-2 for functionalization of titanium surfaces. Biomaterials. 30 (6), 1166-1175 (2008).
- Karageorgiou, V., Meinel, V. L., et al. Bone morphogenetic protein-2 decorated silk fibroin films induce osteogenic differentiation of human bone marrow stromal cells. J. Biomed. Mater. Res. 71 (3), 528-573 (2004).
- Rose, F. R. A. J., Hou, Q., et al. Delivery systems for bone growth factors - the new players in skeletal regeneration. J. Pharm. Pharmacol. 56 (4), 415-427 (2004).
- Masters, K. S. Covalent growth factor immobilization strategies for tissue repair and regeneration. Macromol. Biosci. 11 (9), 1149-1163 (2011).
- Crouzier, T., Fourel, L., et al. Presentation of BMP-2 from a soft biopolymeric film unveils its activity on cell adhesion and migration. Adv. Mater. 23 (12), H111-H118 (2011).
- Ruppert, R., Hoffmann, E., et al. Human bone morphogenetic protein 2 contains a heparin-binding site which modifies its biological activity. European Journal of Biochemistry. 237 (1), 295-302 (1996).
- Love, J., Estroff, L., et al. Self-assembled monolayers of thiolates on metals as a form of nanotechnology. Chem. Rev. 105 (4), 1103-1169 (2005).
- Kato, K., Sato, H., Iwata, H. Immobilization of histidine-tagged recombinant proteins onto micropatterned surfaces for cell-based functional assays. Langmuir. 21 (16), 7071-7075 (2005).
- Martins, M., Curtin, S., et al. Molecularly designed surfaces for blood deheparinization using an immobilized heparin-binding peptide. J. Biomed. Mater. Res. 88 (1), 162-173 (2009).
- Limbut, W., Kanatharana, P., et al. A comparative study of capacitive immunosensors based on self-assembled monolayers formed from thiourea, thioctic acid, and 3- mercaptopropionic acid. Biosens. Bioelectron. 22 (2), 233-240 (2006).
- Patel, N., Davies, M., et al. Immobilization of protein molecules onto homogeneous and mixed carboxylate-terminated self-assembled monolayers. Langmuir. 13 (24), 6485-6490 (1997).
- Hu, J., Duppatla, V., et al. Site-specific PEGylation of bone morphogenetic protein-2 cysteine analogues. Bioconjug. Chem. 21 (10), 1762-1772 (2010).
- Hersel, U., Dahmen, C., Kessler, H. RGD modified polymers: biomaterials for stimulated cell adhesion and beyond. Biomaterials. 24 (24), 4385-4415 (2003).
- Cao, T., Wang, A., et al. Investigation of spacer length effect on immobilized Escherichia coli pili-antibody molecular recognition by AFM. Biotechnol. Bioeng. 98 (6), 1109-1122 (2007).
- Puleo, D., Kissling, R., Sheu, M. A technique to immobilize bioactive proteins, including bone morphogenetic protein-4 (BMP-4), on titanium alloy. Biomaterials. 23 (9), 2079-2087 (2002).
