Summary
Мы опишем метод достижения эффективной иммобилизации БМП-2 на поверхностях. Наш подход основан на формировании самостоятельного монослоем, чтобы достичь ковалентное связывание BMP-2 при помощи своих свободных остатков аминосоединений. Этот метод является полезным инструментом для изучения сигналов на клеточной мембране.
Abstract
Костного морфогенетического белка 2 (BMP-2) является фактором роста встроен в внеклеточного матрикса костной ткани. БМП-2 действует как триггер мезенхимальных дифференцировки клеток в остеобласты, стимулируя тем самым заживление и образование De Novo кости. Клиническое использование рекомбинантного человеческого БМП-2 (rhBMP-2) в сочетании с лесов вызвало недавние споры, в зависимости от режима представления и количество должны быть доставлены. Протокол, представленные здесь обеспечивает простой и эффективный способ доставки БМП-2 для исследований в пробирке на клетки. Мы опишем, как сформировать самоорганизующуюся монослой, состоящий из гетеробифункциональным линкера, и перейти на следующий обязательный шаг для получения ковалентной иммобилизации rhBMP-2. При таком подходе можно достичь устойчивого представление BMP-2 при сохранении биологической активности белка. В самом деле, поверхность иммобилизации BMP-2 позволяет целевых исследований по предотвращению неспецифических объявленияorption, в то время как уменьшение количества фактора роста и, прежде всего, препятствуя неконтролируемый выброс с поверхности. Оба краткосрочные и долгосрочные мероприятия сигнализацию, БМП-2 происходят, когда клетки подвергаются воздействию поверхностей, представляющих ковалентно иммобилизованного rhBMP-2, что делает этот подход подходит для исследований в пробирке на клеточный ответ на БМП-2 стимуляции.
Introduction
Кость морфогенетический белок 2 (БМП-2) является членом трансформирующий фактор роста (TGF-β) семьи и действует как индуктор образования процессов нового костного а также регулятора нескольких тканей во время эмбрионального развития и взрослого гомеостаза 1-3. Каждый мономер биологически активного гомодимерной БМП-2 белка содержит "цистеин узел" мотив, который высоко сохраняется во всех БМП 4. Шесть из семи остатков цистеина образуют внутримолекулярные дисульфидные связи, которые стабилизируют каждого мономера, тогда как седьмой цистеин участвует в димеризации, образуя межмолекулярное соединение между двух мономеров 5,6. Это высоко консервативны цистеин узел определяет трехмерную структуру белка BMP-2 и определяет его уникальные свойства, такие как устойчивость к высокой температуре, и денатурирующих кислом рН 7-9. BMP-2 связывается с серин / треонин киназа трансмембранных рецепторов, тем самым вызывая сигнальную трансдукцию
В кости, БМП-2 индуцирует дифференцировку мезенхимальных стволовых клеток в остеобласты, таким образом стимулируя заживление и De Novo формирование кости. В настоящее время, рекомбинантно экспрессировали BMP-2 применяется в клинике для повышения заживление трещиноватых сайтов. Общая стратегия в инженерии костной ткани является использование инъекций факторы роста, что является менее инвазивным по сравнению с местными систем доставки. Тем не менее, естественных условиях исследования в и клинические применения показали, что короткие биологического полураспада, неспецифическая осанонимизации и быстрый локальный оформление БМП-2 может привести к несколько местных, внематочной и системных проблем 15. Следовательно, чтобы получить эффективное представление, на захват или иммобилизацию BMP-2 в или на материалах необходимо для его местной и длительной доставки в сайте-мишени. Длительной доставки может быть достигнуто с нековалентных подходы удержания, такие как физический захват, адсорбции или ионного комплексообразования 16. Тем не менее, известно, что неспецифическое адсорбции протеинов на поверхности могут приводит к денатурации молекулы 17. Для ковалентного связывания факторов роста, различные типы опор были разработаны в течение последнего десятилетия. Использование бифункциональных молекул связующих, которые нацелены на аминокислоты или карбоксильные группы белка, например, является одним из видов подхода, который не обязательно требует модификации белка для достижения своей иммобилизации. В самом деле, в то время как модификация белок имеет то преимущество управлени ориентацией белка,введение искусственных пептидных областей, теги и сайт-специфических цепей может изменить биологическую активность факторов роста 17. Таким образом, чтобы обойти денатурации за счет взаимодействия с опорной материала, поверхности могут быть функциональными заранее, например, с самоорганизующейся монослоя (SAM) молекулы ссылки, за которой следует соединение требуемого коэффициента 18. Мы использовали подход SAM на основе ковалентно иммобилизации БМП-2 на поверхность путем охвата свои свободные остатки аминов и показали, что иммобилизованные белок сохраняет как свою краткосрочные и долгосрочные биологическую активность 19. Этот протокол обеспечивает простой и эффективный способ доставки BMP-2 в клетках для исследований в пробирке о механизмах, которые происходят на клеточной мембране и регулируют внутриклеточную передачу сигнала, ответственного за остеогенной сигнализации.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Синтез 11-Mercaptoundecanoyl-N-гидроксисукцинимида (NHS-MU)
- Добавляют по каплям раствор 500 мг N-гидроксисукцинимида и 30 мг 4 - (диметиламино) пиридина в 10 мл ацетона (PA) до 1 г 11-mercaptoundecanoic кислоты в 40 мл дихлорметана (Па) при комнатной температуре (RT).
- Реакционную смесь охлаждают до 0 ° С и добавляют по каплям 1,1 г N, N '-дициклогексилкарбодиимид в 10 мл дихлорметана (в атмосфере азота). Хранить реакцию при низкой температуре в течение 1 часа и затем перемешивали при КТ в течение ночи.
- Отфильтровывают осадок и высушить при пониженном давлении. Очищают продукт флэш-хроматографией с петролейным бензола и этилацетата (ПА) в соотношении 1:1.
2. Подготовка однородных слоев золота
- Чистые покровные стекла с точностью салфеток и обрабатывают ультразвуком их в течение 5 мин в растворе, содержащем смесь 1:1 этилацетата (ПА) и метанол (PA). Rinsе подложки с метанолом и высушить в токе азота.
- Поместите чистые субстраты в устройстве покрыти распылением. Вакуумировать камеру. Извлеките верхний слой оксида хрома от цели хрома путем распыления в течение 60 сек. Поместите образцы под металлической балки и пальто их с хромом слой 10 нм, с последующим покрытием слоем золота 40 нм.
3. Поверхность Иммобилизация БМП-2
- Растворить MU-NHS в N, N-dimethlyformamide (ДМФ) до конечной концентрации приблизительно 1 мМ и инкубируют золотых подложек в растворе MU-NHS при комнатной температуре в течение 4 часов в атмосфере азота.
- Разрушать ультразвуком поверхности в DMF в течение 2 мин, смойте DMF и метанола и высушить в токе азота.
- Подготовка исходного раствора rhBMP-2 в стерильной 4 мМ HCl с концентрацией 100 мкг / мл (магазин аликвотах при -80 ° С). Для рабочих разведений (3,5 мкг / мл), разбавляют маточного раствора в PBS / NaCl (PBS, содержащим 1 М NaCl) иdjust до рН 8,5 непосредственно перед использованием.
- Инкубировать поверхности функционализированные MU-NHS в рабочем растворе rhBMP-2 при 4 ° С в течение ночи. Удалить инкубационный супернатант. Соникатные поверхности в PBS / NaCl в течение 2 мин и промыть 3 раза стерильной PBS / NaCl.
4. Поверхность Характеристика
- Чтобы блокировать неспецифическую адсорбцию антител, инкубировать поверхности с 5% BSA (вес / объем) в PBS растворе в течение 1 ч при комнатной температуре с последующим инкубированием с анти-BMP-2 антитела (1:100 в 1% (вес / объем ) раствор BSA / PBS) в течение 1 часа при комнатной температуре. Промыть поверхности дважды PBS и ультразвуком в течение 30 сек.
- Инкубировать субстраты с HRP-конъюгированного вторичного антитела (1:1000 в 1% (вес / объем) раствора BSA / PBS) в течение 30 мин при комнатной температуре, а затем дважды промывали PBS.
- Используйте Ampliflu Red анализа для измерения ферментативной активности HRP при 570 нм с ридере.
5. Анализ биологической активности
- Семенной 1 х 10 5 мыши C2C12 миобласты на лунку в 6-и плТочные в ростовой среде, состоящие из DMEM с высоким содержанием глюкозы, содержащей пируват с добавлением 10% FBS, 1% пенициллина / стрептомицина и инкубируют их в течение 24 часов при 37 ° C / 5% CO 2.
- Голодать клетки в бессывороточной DMEM в течение 3-5 часов перед посевом на поверхностях, украшенный иммобилизованным БМП-2.
- Для исследования краткосрочного индукции сигнализации, замените носитель на 200 мкл свежей сыворотки DMEM и поместите иммобилизованные БМП-2 поверхности выше клеток. Поверхность должна быть обработаны с тонким наконечником пинцетом, чтобы не поцарапать.
- Удалить мягко поверхностей и аспирации среды с помощью пипетки, промыть клетки дважды PBS. Перейдите к анализу клеточных ответов.
- Для анализа долгосрочного биологической активности, пластинчатых клеток на поверхности и культура их при 37 ° C / 5% CO 2 в условиях низкой сыворотки (2% FBS) в течение шести дней.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
В нашей установке, золото был выбран в качестве наполнителя, так как это относится к биологически неспецифическую но химически перестраиваемый систему. Кроме того, применение самоорганизующихся монослоев влечет за собой множество преимуществ: ЗРК спонтанно адсорбировать через их «штаб-групп" на металлы и форм монослоев с нескольких дефектов, в то время как их функциональные концевые группы может быть изменен. Таким образом они создают платформу адаптировать свойства интерфейса в контролируемой, но очень адаптации образом 20.
Для иммобилизации БМП-2 на золотым покрытием поверхностей, мы использовали двухэтапный подход: 1) связывание компоновщик MU-NHS к слоем золота, а затем 2) взаимодействие линкер с белком (см. рисунок 1). Для доказательства связывания rhBMP-2, мы использовали иммуноферментный анализ. В этом анализе поверхности представления иммобилизованный rhBMP-2 инкубировали с BMP-2 специфического антитела и вторичного антитела, конъюгированного с HRP. Связывание последнего можно дetermined помощью Ampliflu Red решение. В присутствии пероксида водорода, HRP катализирует превращение бесцветного Ampliflu Red (10-ацетил-3 ,7-dihydroxyphenoxazine) в флуоресцентным соединением ресоруфина. Мы обнаружили поверхности иммобилизованный rhBMP-2 (ИМБП-2) до и после приближения прилипшие клетки сверху с функциональными поверхностей. Обратите внимание, что для обнаружения rhBMP с Ampliflu Красной анализа, образцы могут быть нескольких этапов инкубации и лечения. Таким образом, это не представляется возможным исследовать ту же поверхность до и после стимуляции клеток. Фиг.2А показывает успешное связывание rhBMP-2 на поверхность в конформации, признанной анти-BMP-2 IgG. Фиг.2В показано ИМБП- 2 поверхность, которая была использована, чтобы стимулировать клетки в течение 30 мин до иммуноанализа HRP. Даже после стимуляции клеток белок обнаружен на поверхности.
Сотовые ответы на поверхностях, представляющих иммобилизованного RHBMP-2 были оценены и по сравнению с эффектом необработанной золотых подложек (отрицательный контроль). Для того чтобы минимизировать влияние процесса адгезии по анализу краткосрочного сигнализации, специальная установка была разработана для стимуляции клеток. Здесь C2C12 клетки стимулировали в течение 30 мин по rhBMP-2 функционализированных поверхности приближается сверху. Мышь миобластов клеточная линия C2C12 является плюрипотентные мезенхимальные клеточной линией предшественников, который широко используется в качестве модельной системы для изучения ранней стадии остеогенной дифференцировки в процессе формирования костной ткани в мышечных тканях. В этой модели, BMP-2 ингибирует дифференцировку клеток в многоядерных мышечных трубок и вызывает остеобластов фенотипы 21. Активация Smad 1/5/8, которые ниже по течению корреспонденты сигнального пути BMP-2, анализируют с помощью вестерн-блоттинга. Как показано на фиг.3А, Smad фосфорилирование наблюдается после 30-минутной стимуляции ИМБП-2, в то время как не фосфорилирование Smad 1/5/8 не происходитв клетках подвергаются необработанных образцах золота. Этот результат показывает, что процесс иммобилизации не изменяет БМП-2 краткосрочный деятельность и запускает первые шаги в сигнализации Smad.
Для определения, влияет ли ИМБП-2 долгосрочную остеогенной дифференцировки, уровень экспрессии щелочной фосфатазы (ALP), остеогенной маркер, была исследована с помощью колориметрического анализа. ALP активность С2С12 клеток измеряли после инкубации клеток в течение 6 дней на обычной золота (контроль) и ИМБП-2 поверхностей. ALP активность в лизатах клеток, культивируемых на ИМБП-2 поверхностей показывает значительно более высокую абсорбцию по сравнению с контролем (фиг. 3B). Этот результат показывает, что ИМБП-2 индуцирует экспрессию маркера остеогенной ALP в С2С12 клеток. Эта клеточная линия, как известно, дифференцировать по достижении слияния в условиях низкой сыворотки, тем самым формируя мышечных трубок и выражая характерные миогенные белки. Однако лечение с BMP-2 вызывает сдвигдифференциация путь от myoblastic чтобы остеобластов, поэтому подавляя образование мышечных трубок. Для изучения влияния ИМБП-2 на миогенеза, C2C12 клетки высевают непосредственно на золотой (контроль) или функционализованных поверхностей и культивируют в дифференциации условий (низкая сыворотка). Через 6 дней проводили окрашивание тяжелой цепи миозина (МНС). Как показано на рисунке 3C, C2C12 клетки не образуют МНС положительные мышечных трубок в присутствии ИМБП-2, но не на золотых подложек.
Рисунок 1. Схема процесса иммобилизации rhBMP-2 на поверхности золота. Покровные стекла покрывают слоем золота, а затем инкубировали с гетеробифункциональным линкер (MU-NHS), что приводит к NHS-функционализированного самоорганизующейся монослоя (SAM). Первичные амины из BMP-2 реагируют с линкером что приводит к совместновалентно иммобилизованных белков на подложке. Нажмите здесь, чтобы увеличить рисунок .
Рисунок 2. Поверхностно-связанный rhBMP-2 могут быть обнаружены путем ферментативного иммуноанализа до (А), так и после (B) стимуляции клеток эксперименты. Иммобилизованные rhBMP-2 оценивали количественно с помощью Ampliflu Red колориметрического анализа. Поглощение измер ют при 570 нм и данные были нормализованы для управления (не обработанных поверхностей золото) значения. Планки погрешностей представляют стандартное отклонение от среднего значения п> 3.
Рисунок 3. Прикол rhBMP-2 остается биологически активными и вызывает краткосрочные,а также долгосрочные сигнализации событий. (А) C2C12 клетки стимулировали в течение 30 мин под воздействием поверхности золота (контроль) и поверхностей с ковалентно иммобилизованным rhBMP-2 (ИМБП-2) приближается сверху. После лизиса клеток образцы иммуноблоттинг для p-Smad1/5/8 и β-актина. (B) Ферментативная активность щелочной фосфатазы (ALP) указывает остеогенной дифференцировки клеток С2С12 и измеряли из клеточных лизатов после 6-дневного инкубирования период на контроль или ИМБП-2 поверхности, соответственно. ALP активность измеряли в виде оптической плотности при 405 нм. На гистограмме показана Данные, полученные после реакции 60-мин. Столбики ошибок указывают стандартное отклонение, n = 3, * р <0,01. (C) C2C12 клетки высевали на указанных поверхностей и культивировали в течение 6 дней при условиях низкой сыворотки, чтобы позволить миогенез. Изображения показывают миозина тяжелой цепи (МНС) окрашивания многоядерные мышечные трубки (зеленый) и DAPI ядер окрашивание (синий). Изображение увеличение 20x.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
В этом протоколе мы описывают получение поверхностей с функционализированных биоактивного rhBMP-2. Этот подход включает в себя два этапа: 1) начальное формирование самостоятельной сборки монослоя (SAM) бифункционального линкера на поверхности золота, 2) ковалентной иммобилизации белка rhBMP-2. В предыдущей работе, мы подтверждено эффективное связывание бифункционального линкера и фактора роста, и показали, что поверхность с иммобилизованным rhBMP-2 сохраняет свою биологическую активность 19. Биологическая активность факторов роста, представленных в иммобилизованной форме также было показано в других исследованиях, что указывает на высвобождение белков и их последующее интернализации не являются существенными для стимуляции клеток 24,25. В самом деле, ковалентной иммобилизации факторов роста позволяет устойчивый стимуляции клеток-мишеней при сохранении эффективной дозы из-за повышенной степени заполнения различных типов рецепторов на клеточной мембране 22,23,26-28.
Для подготовки поверхностей, представляющих иммобилизованного rhBMP-2, следует проявлять осторожность, в обработке поверхностей в течение всей процедуры и в приготовлении раствора rhBMP-2. Стеклянные покровные должна быть чистой и сухой, и никаких признаков дефекта или примесей не должно быть видно. Царапины на поверхность с помощью пинцета и пипеток следует избегать. Для функционализации поверхности с помощью шага rhBMP-2, важно использовать без носителя рекомбинантного белка, то есть без добавления бычьего сывороточного альбумина в препарате, чтобы избежать нежелательного иммобилизацию носителя на поверхности. RhBMP-2 на складе (100 мкг / мл) растворяют в 4 мМ HCl. Когда поверхности инкубируют с раствором rhBMP-2, рН должен быть отрегулирован в нейтральное положение для небольшого щелочном рН для повышения реакцию с аминогруппой белка с группой NHS поверхностного связанного линкера. Если рН слишком низкий, группа NHS могут быть гидролизованы прежде чем он может реагировать умч аминогруппы белка. Мы используем PBS, содержащим 1 М NaCl 29 и добавить rhBMP-2 со склада, а затем отрегулировать рН с КОН (10 мм).
С помощью этого протокола мы добились успешного иммобилизации биологически активных rhBMP-2 на поверхностях, потому что: 1) мы создали двухэтапный подход; 2) мы использовали соответствующий линкер получить расстояние от поверхности и связать белок без серьезных помех на его взаимодействие с рецептором. Амин-реактивного алкантиол, 11-mercaptoundecanoyl-N-гидроксисукцинимида (MU-NHS), был привязан к золотой подложке на первом этапе. Как алкантиолов самостоятельно собираться на металлы, как золото, образуя высоко упорядоченную монослоя, они облегчают оформление поверхностей с различными молекулами линкерных 30-32. SAM защищает биомолекулы от прямого контакта с твердой поверхностью, тем самым сводя к минимуму риск денатурации 32. Кроме того, длина линкера также определяет Reactivity из SAM. В NHS группы линкеров, состоящих из, по меньшей мере одиннадцати атомов углерода, как MU-NHS, более доступны, в результате чего повышается иммобилизации белка по сравнению с обязательными к более коротким линкеров 34. Иммобилизация rhBMP-2 происходит через смещением группы NHS по остатков лизина белка 34. Принимая во внимание лишь пространственное среды, реакционную поверхностных иммобилизованным NHS групп, скорее всего происходит на гибких N-концевых остатков 35. Однако, как показано на других лигандов, длина и гибкость линкера может позволить взаимодействие с иным пространственно затрудненные участки связывания, тем самым компенсируя неблагоприятной ориентации 36,37. В неопубликованной работе мы сравнили один шаг со стратегией иммобилизации двухступенчатой. Сравнение между использованием раствора, содержащего белка и линкеров, и последовательный поверхность связывания линкера и белком, показал, что только двашаг стратегия привела к биологически активным лиганда иммобилизации. Это может быть связано с экранирующим действием SAM, что затрудняет денатурации белка, которые могли бы иметь место на золото. Кроме того, поскольку линкер уже прикреплен к поверхности, кросс-соединение между белками через концевых групп линкера и их инактивации в результате обойти 38.
Для экспериментов с клетками, которые стимулируются поверхности с иммобилизованным rhBMP-2, он имеет решающее значение для определения заранее, что C2C12 не образуют мышечные трубки в колбу культуры перед посевом их на подложку. Таким образом, клетки должны быть субконфлюентные в культуре. Партия фетальной бычьей сыворотки, используемой для культивирования и для экспериментов должен быть протестирован, чтобы гарантировать, что ни остеогенных стимулы нет. Это выполняется с помощью анализа Quantikine для обнаружения костных морфогенетических белков и путем тестирования остеогенных клеток для маркеров дифференцировки, например Alkal НИС фосфатазы выражение. При работе с субстратами для стимуляции из верхней части культур, это снова важно, чтобы избежать царапин с помощью пинцета. Сушка культуры и сжатия клеток следует избегать в любом случае, в противном случае искажения клеток и смерть негативно влияет на ответ на БМП-2 стимуляции. Мы рекомендуем пипетки приблизительно 100 мкл DMEM в каждую лунку 6-луночного планшета, где клетки культивируют перед нанесением на подложку клеток. Клетки должны быть соблюдены под микроскопом, чтобы гарантировать, что ни морфологические изменения не вызваны наличием поверхностей на верхней части культур. Наконец, при удалении подложки, на одной стороне тщательно сняты с помощью пинцета и субстрат осторожно снимают. Непосредственной проверкой для любого повреждения клеток с ярким поле микроскопа должно быть исполнено, а в качестве проверки подложек чтобы определить, если любые сотовые привязи или крупных механических примесей.
_content "> В заключение представлены двухэтапной процедуры является полезным инструментом, чтобы обездвижить rhBMP-2 на подложки с помощью его остатков аминов, чтобы изучить его влияние на клеточных реакций. Описанная стратегия сочетает в себе множество преимуществ. С одной стороны, это не ограничивается BMP-2, но он может быть также применен к другим факторам роста семейства ВМР, поскольку они представляют собой весьма консервативную аминокислотную структуру. С другой стороны, путем предотвращения неспецифической адсорбции, такой подход позволяет целевой исследование BMP-2 , в то время как уменьшение количества фактора роста и, прежде всего, препятствуя неконтролируемый выброс с поверхности.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего раскрывать.
Acknowledgments
Мы благодарим профессора JP Spatz (Департамент биофизической химии, Университет Гейдельберга и Департамент новых материалов и биосистем, Института Макса Планка по интеллектуальным системам, Stuttgart) за его любезное поддержки. Финансовая поддержка от Макса Планка-Gesellschaft и Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG SFB/TR79 для ВАС-А.), Также значительно признал.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| N-hydroxysuccinimide | Sigma-Aldrich | 130672 | |
| 4-(dimethylamino)pyridin | Sigma-Aldrich | 522805 | |
| Acetone | AppliChem | A2282 | |
| 11-mercaptoundecanoic acid | Sigma-Aldrich | 674427 | |
| Dichlormethane | Merck | 106050 | |
| N,N'-dicyclohexylcarbodiimide | Sigma-Aldrich | D80002 | |
| Petroleum benzene | Merck | ||
| Glass coverslips | Carl Roth | M 875 | |
| Ethylacetate | AppliChem | A3550 | |
| Methanol | Carl Roth | 4627 | |
| N,N-dimethylformamide | Carl Roth | T921 | |
| rhBMP-2 | R&D Systems | 355-BM | Carrier-free; expressed in E.coli |
| PBS | PAA | H15-002 | |
| NaCl | Carl Roth | HN00.2 | |
| Poly(dimethyl siloxane) (PDMS) | Dow Corning | ||
| Sylgard 184 silicone elastomer kit | Dow Corning | ||
| Anti-rhBMP-2 | Sigma | B9553 | |
| Goat anti-mouse IgG-HRP | Santa Cruz | sc-2005 | Secondary antibody |
| Ampliflu Red assay | Sigma | 90101 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) (1x), liquid | Gibco | 41966 | High glucose |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma | F7524 | Sterile filtered, cell culture tested |
| Pen/Strep | Gibco | 15140 | |
| Trypsin 0.05% (1x) with EDTA 4Na | Gibco | 25300 | |
| Glycine (0.1 M) | Riedel-de Haën | 33226 | |
| IGEPAL CA-630 (1%) | Sigma | I8896 | Lysis buffer (ALP assay)19 |
| Magnesium chloride (MgCl2)(1 mM) | Carl Roth | HNO3.2 | |
| Zinc chloride (ZnCl2) (1 mM) | Carl Roth | 3533.1 | |
| p-nitrophenylphosphate (pNPP) | Sigma | S0942 | Phosphatase substrate |
| Anti-mysin heavy chain (MHC) | Developmental Studies Hybridoma Bank, University of Iowa | MF20 | Monoclonal antibody |
| Alexa Fluor 488 Goat anti-mouse IgG | Invitrogen | A11001 | |
| DAPI | Sigma | D9542 | |
| Equipment | |||
| Ultrsonic bath (Sonorex Super RK 102H), Frequency 35 kHz | BANDELIN electronic GmbH Co. KG | ||
| MED 020 Sputtercoating system | BAL-TEC AG | Coating conditions Cr: 120 mA, 1.3 x 10-2 mbar, 30 sec Au: 60 mA, 5.0 x 10-2 mbar, 45 sec |
|
| Tecan Infinite M200 Plate reader | Tecan | ||
References
- Helm, G., Andersson, D., et al. Summary statement: Bone morphogenetic proteins: Basic science. Spine. 27 (16S), S9 (2002).
- Hogan, B. Bone morphogenetic proteins: multifunctional regulators of vertebrate development. Genes Dev. 10 (13), 1580-1594 (1996).
- Reddi, A. BMPs: from bone morphogenetic proteins to body morphogenetic proteins. Cytokine Growth Factor Rev. 16, 249-250 (2005).
- Rengachary, S. Bone morphogenetic proteins: basic concepts. Neurosurg Focus. 13 (6), 1-6 (2002).
- Schlunegger, M., Grütter, M. An unusual feature revealed by the crystal structure at 2.2 Å; resolution of human transforming growth factor-β2. Nature. 358, 430-434 (1992).
- Scheufler, C., Sebald, W., Hülsmeyer, M. Crystal structure of human bone morphogenetic protein-2 at 2.7 Å resolution. J. Mol. Biol. 287 (1), 103-115 (1999).
- Nimni, M. Polypeptide growth factors: targeted delivery systems. Biomaterials. 18 (18), 1201-1225 (1997).
- Wozney, J., Rosen, V. Bone morphogenetic protein and bone morphogenetic protein gene family in bone formation and repair. Clin. Orthop. Related Res. 346, 26 (1998).
- Rosen, V. BMP and BMP inhibitors in bone. Annals of the New York Academy of Sciences. 1068, 19-25 (2006).
- Kirsch, T., Sebald, W., Dreyer, M. K. Crystal structure of the BMP-2-BRIA ectodomain complex. Nat. Struct. Biol. 7 (6), 492-496 (2000).
- Keller, S., Nickel, J., et al. Molecular recognition of BMP-2 and BMP receptor IA. Nat. Struct. Mol. Biol. 11 (5), 481-488 (2004).
- Miyazono, K., Maeda, S., Imamura, T. BMP receptor signaling: transcriptional targets, regulation of signals, and signaling cross-talk. Cytokine Growth Factor Rev. 16 (3), 251-263 (2005).
- Nohe, A., Hassel, S., et al. The mode of bone morphogenetic protein (BMP) receptor oligomerization determines different BMP-2 signaling pathways. J. Biol. Chem. 277 (7), 5330-5338 (2002).
- Sieber, C., Kopf, J., et al. Recent advances in BMP receptor signaling. Cytokine Growth Factor Rev. 20 (5-6), 343-355 (2009).
- Carragee, E. J., Hurwitz, E. L., Weiner, B. K. A critical review of recombinant human bone morphogenetic protein-2 trials in spinal surgery: emerging safety concerns and lessons learned. Spine J. 11, 471-491 (2011).
- Luginbuehl, V., Meinel, L., et al. Localized delivery of growth factors for bone repair. Eur. J. Pharm. Biopharm. 58 (2), 197-208 (2004).
- Nakaji-Hirabayashi, T., Kato, K., et al. Oriented immobilization of epidermal growth factor onto culture substrates for the selective expansion of neural stem cells. Biomaterials. 28 (24), 3517-3529 (2007).
- Gonçalves, R., Martins, M., et al. Bioactivity of immobilized EGF on self-assembled monolayers: Optimization of the immobilization process. J. Biomed. Mater. Res. Part A. 94A. 2 (2), 576-585 (2010).
- Pohl, T. L. M., Boergermann, J. H., et al. Surface immobilization of bone morphogenetic protein 2 via a self-assembled monolayer formation induces cell differentiation. Acta Biomater. 8 (2), 772-780 (2012).
- Love, J., Estroff, L., et al. Self-assembled monolayers of thiolates on metals as a form of nanotechnology. Chem. Rev. 105 (4), 1103-1169 (2005).
- Katagiri, T., Yamaguchi, A., et al. Bone morphogenetic protein-2 converts the differentiation pathway of C2C12 myoblasts into the osteoblast lineage. J. Cell Biol. 127 (6), 1755-1766 (1994).
- Whitaker, M. J., Quirk, R. A., et al. Growth factor release from tissue engineering scaffolds. J. Pharm. Pharmacol. 53 (11), 1427-1437 (2001).
- Uludag, H., D'Augusta, D., et al. Implantation of recombinant human bone morphogenetic proteins with biomaterial carriers: a correlation between protein pharmacokinetics and osteoinduction in the rat ectopic model. J. Biomed. Mater. Res. 50 (2), 227-238 (2000).
- Kashiwagi, K., Tsuji, T., et al. Directional BMP-2 for functionalization of titanium surfaces. Biomaterials. 30 (6), 1166-1175 (2008).
- Karageorgiou, V., Meinel, V. L., et al. Bone morphogenetic protein-2 decorated silk fibroin films induce osteogenic differentiation of human bone marrow stromal cells. J. Biomed. Mater. Res. 71 (3), 528-573 (2004).
- Rose, F. R. A. J., Hou, Q., et al. Delivery systems for bone growth factors - the new players in skeletal regeneration. J. Pharm. Pharmacol. 56 (4), 415-427 (2004).
- Masters, K. S. Covalent growth factor immobilization strategies for tissue repair and regeneration. Macromol. Biosci. 11 (9), 1149-1163 (2011).
- Crouzier, T., Fourel, L., et al. Presentation of BMP-2 from a soft biopolymeric film unveils its activity on cell adhesion and migration. Adv. Mater. 23 (12), H111-H118 (2011).
- Ruppert, R., Hoffmann, E., et al. Human bone morphogenetic protein 2 contains a heparin-binding site which modifies its biological activity. European Journal of Biochemistry. 237 (1), 295-302 (1996).
- Love, J., Estroff, L., et al. Self-assembled monolayers of thiolates on metals as a form of nanotechnology. Chem. Rev. 105 (4), 1103-1169 (2005).
- Kato, K., Sato, H., Iwata, H. Immobilization of histidine-tagged recombinant proteins onto micropatterned surfaces for cell-based functional assays. Langmuir. 21 (16), 7071-7075 (2005).
- Martins, M., Curtin, S., et al. Molecularly designed surfaces for blood deheparinization using an immobilized heparin-binding peptide. J. Biomed. Mater. Res. 88 (1), 162-173 (2009).
- Limbut, W., Kanatharana, P., et al. A comparative study of capacitive immunosensors based on self-assembled monolayers formed from thiourea, thioctic acid, and 3- mercaptopropionic acid. Biosens. Bioelectron. 22 (2), 233-240 (2006).
- Patel, N., Davies, M., et al. Immobilization of protein molecules onto homogeneous and mixed carboxylate-terminated self-assembled monolayers. Langmuir. 13 (24), 6485-6490 (1997).
- Hu, J., Duppatla, V., et al. Site-specific PEGylation of bone morphogenetic protein-2 cysteine analogues. Bioconjug. Chem. 21 (10), 1762-1772 (2010).
- Hersel, U., Dahmen, C., Kessler, H. RGD modified polymers: biomaterials for stimulated cell adhesion and beyond. Biomaterials. 24 (24), 4385-4415 (2003).
- Cao, T., Wang, A., et al. Investigation of spacer length effect on immobilized Escherichia coli pili-antibody molecular recognition by AFM. Biotechnol. Bioeng. 98 (6), 1109-1122 (2007).
- Puleo, D., Kissling, R., Sheu, M. A technique to immobilize bioactive proteins, including bone morphogenetic protein-4 (BMP-4), on titanium alloy. Biomaterials. 23 (9), 2079-2087 (2002).
