Summary
スカベンジャーは無病領域に糞中の感染伝達性海綿状脳症プリオンを移動させる可能性を持っている。私たちはマウス適応スクレイピープリオンはアメリカのカラスの消化管（ アメリカガラス ）、死んだ動物の共通の消費者も通過した後、感染のままかどうかを判断するために使用される詳細な方法。
Abstract
感染性プリオン（PRP RES）材料は、おそらく致命的な神経変性伝達性 海綿状脳症（TSE）の病気1の原因である。例えば、慢性消耗病（CWD）などのTSE疾患の送信は、動物から動物への2,3並びに環境源4-6からであると推定される。スカベンジャーと肉食動物は、CWDに汚染された死肉の摂取と排泄を通してプリオン解像度材料を移動させる可能性を持っている。最近の研究はアメリカのカラスの消化器系（ アメリカガラス ）、一般的な北アメリカのスカベンジャー7を通してプリオン解像度素材の通過を文書化しました。
我々はアメリカのカラスを通じてプリオン解像度素材の通過を記録するために使用される手順について説明します。カラスはRML - ひずみマウス適応スクレイピーで強制経口投与し、それらの糞は4時間後に強制経口投与を収集した。カラスの糞をし、その後プールし、腹腔内に注射したC57BL / 6マウス。彼らはマウススクレイピーの臨床徴候を表明し、その後、安楽死させたまではマウスを毎日モニターした。無症候性マウスは365日後に接種するまで監視した。ウェスタンブロット解析は、疾患状態を確認するために行った。結果は、プリオンがカラスの消化器系を通って移動した後に感染性のままであり、試験マウスにおいて疾患を引き起こす、糞便中に存在することが明らかになった。
Introduction
伝達性海綿状脳症（TSE）は、野生生物に影響を与える致命的な感染性の神経変性疾患、家畜、そしてヒトである。 TSE疾患の感染性病原体はプリオンタンパク質1のミスフォールドまたは病原性アイソフォーム（PRP RES）であるように思われる。ヒツジおよびヤギにおけるスクレイピー;、牛海綿状脳症（動物TSE疾患はラバ鹿（ ミュールジカ ）、オジロジカ（ オジロジカ ）、エルク（ アカシカ ）、およびムース（ ヘラジカ ）の慢性消耗病（CWD）が含まれ国内の牛のBSE）;養殖ミンクにおける伝染性ミンク脳症、ネコのネコ海綿状脳症、ヒト以外の霊長類8にし、海綿状脳症、エキゾチックな動物園のエキゾチックな有蹄動物海綿状脳症は、家族ウシ科の反芻。単一のヒトTSE病、変異型クロイツフェルト·ヤコブ病は、稀で、 解像度のPrP-contaminを消費することによって取得されると考えられているated食品9。汚染された牛肉が10消費された場合も、BSEはヒトに感染することができます。すべてのTSE疾患のうち、スクレイピーおよびCWDは、動物から動物2,3,11にだけでなく、環境源4-6からのものであると推定される自律的な流行と感染のソースでのみ2である。研究では、ほとんどのTSE疾患は臨床徴候が発現する前にプリオン解像度素材の自然曝露イベントからの注目すべき拡張潜伏期間が必要2-4,6,8、見かけ種の壁を最小限に、しかし、種間伝播12月14日の可能性を排除しないことを示唆している。
感染性プリオン（PRP RES）材料の普及のためのメカニズムを識別することはTSE疾患が風景を越えて移動する方法についての質問に答えるために非常に重要です。実験的研究は、昆虫15,16、家禽および豚17、およびアメリカのカラス（ カラスのブラチことが示唆されているhyrhynchos）7,18は、PrP解像度材料の受動的なキャリアまたは分散機である。カラスの消化器系を通じてプリオンのRES物質の通過は最近、TSE疾患7の分散でプレイしてもよい役割を示す、文書化されています。これらの結果は、カラス、スカベンジャーは、遭遇する可能性があること、それがもっともらしい作る消費し、無病領域に、糞の堆積により感染性物質を輸送する。
我々はここに証明する手続きは、カラスの消化システムを介してプリオンのRES物質の通過を記録するために使用されたと大いに関連する今後の研究の他のスカベンジャーと肉食種特異的なモデルに、これらの方法の適用を容易にします。本研究では、従来の方法は、プリオン解像度素材の広がりと全体的な重荷に貢献できるプリオン解像度素材を、人身売買の型破りな手段を調査するために使用された。
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Protocol
我々のプロトコルは、我々が以前に7を発表した1から採用されている。動物に関わるすべての手続きは、米国農務省（USDA）、動植物衛生検査局（APHIS）、野生動物サービス（WS）、国立野生生物研究センター（NWRC）の施設内動物管理使用委員会によって承認された。
1。カラスGavaging
- アメリカのカラスの消化管を通して「疑似脳物質 'の通過時間を見積もります。
- 調理の5ミリリットルを混合し、強制経口投与針2（ 図1）を用いた青色色素および強制経口投与1カラスと全卵をスクランブル。
- 青/緑に染色された糞はもはや排泄されるまで、30分ごとにカラスないことを確認してください。
- 感染していないと末期RML（チャンドラー株）に感染したC57BL / 6マウスの脳を入手します。
- 1Xと弾丸ブレンダーホモジナイザーの通常20％重量/容量、感染したマウス脳乳剤を生成リン酸緩衝生理食塩水（PBS）とガラスビーズを、次いで、より大きな粒子状物質を除去するために1分間3,000×gで遠心する。上清を除去し、無菌のPBS中の10％重量/体積を生成するために、1×PBS等容量の希釈した。必要になるまで-80℃で凍結する。
- 前胃管栄養への17時間は、カラスのペンから、水食料を削除ではなく。
- 無作為に処置群にカラスを割り当て、強制経口強制栄養針2を使用して正常または感染したいずれかのマウス脳ホモジネート5mlでそれぞれカラス。
- 転送は、個々のケージにカラスや4時間後、胃管栄養法（ 図2）のために、各ケージ内のすべての糞を集め、プール。
- 均一な組織が得られるまでガラスビーズと弾丸ブレンダーホモジナイザーの各カラスのためにプールされた糞を均質化する。 *カラスの糞は主に液体であり、容易に混合することができる。
- 各カラスのために、10ミリリットルの全容量のために9.5ミリリットルの1X PBSに糞便ホモジネート500μlの希釈する。
- 糞便homogenaを遠心分離1400×gで15分間のTE、上清を抽出します。
- 二微生物感染の脅威を最小限ホモジネート、100μlの1〜100単位の液/ mlペニシリンおよび100μg/ mlのストレプトマイシン（Invitrogen社、NY）を用いて上清を治療するためにその後減少させるために20分間室温でUV光下に置くウイルスおよび細菌汚染のリスク。 UV露光した後、残りの微生物の膜を破壊するために30秒間70を設定することで、3000 Mpは超音波処理における超音波処理のサンプル。
2。マウス接種
- 無作為に以下の処置群（ 表1）にマウスを割り当てる。
- グループ1 - 陽性の処置マウスは経口5ミリリットル感染マウスの脳を強制飼養カラスからの糞便ホモジネート1mlで腹腔内（IP）接種した。
- グループ2 - 負の処置マウスは、経口5ミリリットル、通常のマウスの脳を強制飼養カラスからの糞便ホモジネート1mlのIPアドレスを接種した。
- infecteを希釈1×PBSで1:100重量/容量のグループ3および4のdおよび正常マウス脳ホモジネート。
- 第3群 - 陽性対照マウスは、感染マウス脳ホモジネート1mlのIPを接種した。
- グループ4 - 陰性対照マウスは正常マウス脳ホモジネート1mlのIPを接種した。
| 治療グループ | 動物の数 | |
| グループ1 | スクレイピー+クロウ糞 | 100 |
| グループ2 | スクレイピー - クロウ糞 | 25 |
| グループ3 | スクレイピー+マウス脳 | 10 |
| グループ4 | スクレイピー - マウス脳 | 5 |
表1スクレイピー接種の状況（負正+、 - ）と動物の数が7を使用していました。
- 腹腔内にマウスに接種：
- 優しく首筋の親指と人差し指で背面の首の毛皮によるマウスとは、腹側を露出させ回転させます。
- ヘッドがやや低いので、マウスの後端部を上昇させる。
- 針ロック注射器を用いて仙腸関節にCM前部皮膚を通して25 G針1センチ、正中線の左右1cmの1-2を挿入します。
- 1mlを、マウスの体腔内に徐々に接種注入する。
3。マウスの監視
- 彼らはマウススクレイピーの臨床徴候を表現まで毎日マウスを監視します。臨床症状は含まれる：脊柱後、運動失調、硬い尾、グルーミング、衰弱、および嗜眠の欠如を。
- 0目に見える=なし、1 =中等度、および2 =が激しいところ目に見える兆候は、明らかであるとき6臨床徴候のそれぞれにマウスを獲得。
- 3日間、または365日後に接種（DPI）で連続6それぞれの記号の1日の総得点は1日の≥8に到達したときに、マウスを安楽死させる≥。
- 収穫脳直後のeuthan-70℃でのアジアと店舗
- 、スクレイピー診断を確認、次のように希釈されたプロテイナーゼK溶液（PK）の50μg/ mlのの3μlの脳サンプルを消化するために：3.1。 μlのPK、500mMのEDTA12.5μlの、pH8で、45℃で30分間、1×PBSの109.39μlを、次いで、8μlのローディング緩衝液を添加し、95℃で5分間、サンプルをインキュベートすることによってPKを不活性化する。 12％SDS-PAGEゲル電気泳動させると、室温で1時間、PBS中の0.2％のTween 20でイモビロンPVDF膜を5％脱脂乳でブロックへの転送上に負荷サンプル。次いで、室温で1時間のSuperblock中で希釈西洋ワサビペルオキシダーゼ、Bar224にコンジュゲート抗プリオンモノクローナル抗体でプローブする。 PBS-0.2％Tween 20で1時間、膜を洗浄します。可視化するために、G-ボックスゲルドキュメンテーションシステムに化学発光基質およびイメージを使用してウエスタンブロット5分間インキュベートする。
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Representative Results
使用手順は、カラスの消化器系は、スクレイピー脳ホモジネート7の強制経口投与した後にPrPの解像度感染性4時間を排除しないことを示している。プリオン解像度材料で強制経口投与されたすべての20カラスはその後、マウスに糞を経由したPrP 解像度素材を送信した。ウェスタンブロット分析によって完了した罹患したマウスは、臨床マウススクレイピー徴候および疾患確認の発現によって同定した。
カラスが摂取物質の保持時間の検討糞便中の染料の存在（ 図1）に基づいて、4時間であることが強制飼養カラスのための消化管の通過時間を明らかにした。すべての糞は、使い捨てピペットを用いて収集し、それぞれのカラス（ 図2）のためにプールした。生の糞便上清をパイロットテストのマウスに腹腔内注射されたときに未処理のカラスの糞便から急性毒性が発生しました。ペニシリン及びSTREと糞便接種を処理することによりptomycin、紫外線、超音波処理、我々はこの問題を軽減する。
スクレイピー接種カラスからスクレイピー陽性のマウスの脳（9月9日）または便のどちらかを接種した全てのマウス（66 * / 84）は、臨床徴候を開発した（ 図3）ウエスタンブロット解析で陽性反応を示し、容易に通過したことスクレイピーを示すカラスと引き起こされる疾患の消化器系。 *エイティーンマウスは、おそらく毒性のため、接種の3日以内に死亡した。 1（1月23日）スクレイピー陰性接種したマウスが、すべては、ウェスタンブロット分析により陰性であった。我々は、このマウスが不注意にスクレイピー陰性カラスからスクレイピー陽性カラスの糞の代わりに、糞を接種したと仮定した。
図1。カラスは青色色素（A）およびBと混合した全卵5ミリリットルを使用して手動で拘束し、経口強制飼養LUE /緑に染色された糞4時間後に強制経口投与（B） 拡大画像を表示するには、ここをクリックしてください 。
図2。前の均質化にピペットでカラスの糞コレクション。 拡大画像を表示するには、ここをクリックしてください 。
図3。 。バイオアッセイからのマウスの脳の代表的なSDS-PAGE、ウェスタンブロット NBH-正常マウス脳ホモジネート、スクレイピー陰性、TXケージ4 -スクレイピー接種カラスから糞を接種したマウスの脳。 （+）とし、何も付けなけれT（ - ）、PK（プロテイナーゼK）消化。 拡大画像を表示するには、ここをクリックしてください 。
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Discussion
私たちは、カラスの消化器系を通じてプリオンのRES物質の通過を文書化するための手順を示しています。私たちは、カラスが無病の地域へのプリオン解像度素材を転位する能力を持っているかどうかを判断するために、従来の方法を使用していました。他はそれを排除することができなかった、どちらも19〜21と齧歯類22,23消化液を反芻するプリオン解像度の抵抗を評価した。彼らはまた、潜在的に死肉中のPrP 解像度材料に遭遇し、プリオン病の蔓延を促進する風景全体でこの材料を輸送する可能性があるため、これらの技術の将来の適用は24他の肉食動物に適用する必要があります。
私たちは、カラスの消化管を通して均質化されたマウスの脳のおおよその通過時間を評価するための簡単な方法を提供し、私たちのスクランブルエッグ "疑似脳の物質に青い食品着色料を追加しました。我々は最初のインに、この手法を検討して他の人にアドバイス実験動物の既存の糞の色をPECTしてから最も対照的なある食品着色料を使用しています。これは実験動物を通過した食品の色に染色された材料を容易に識別できるようになります。私たちは、通過時間を推定するために食品着色料を使用することを選択したが、他は蛍光顔料25、酸化第二鉄26、着色されたプラスチック製のマーカー27、および着色金属フレーク（ すなわちグリッター）28を使用していた。
カラスの糞からの二次細菌感染の脅威を最小限に抑え、正確に接種したマウスは、長い潜伏期間を必要とするマウスプリオン研究のための重要な出発点である。これらの考慮事項のいずれかに違反した場合は、初期のマウスの死亡率が発生する可能性がある。
調査のための別の可能なツールが持つ強制経口投与のカラスが感染性物質に合格した後にどのくらいの確立に時間をかけてカラス糞便サンプルを評価するために、周期的な増幅またはsPMCAミスフォールディングシリアルタンパク質であるマウスバイオアッセイの必要性が不足しています。プルフォードによるPMCA糞便分析における最近の進歩は、 ら PMCAも鳥類糞便を評価するための有用なツールであることを示唆している可能性があり、プリオンの微小なレベルの増幅は、哺乳動物の糞29で検出することができることを示している。マウスバイオアッセイとsPMCAアプローチがCWDに感染した材料を用いて強制経口投与カラスの糞便中に残留感染性を評価するために使用することができた。 cervidizedトランスジェニックマウスラインが必要とされる、および腹腔内、脳内接種に対する、より迅速な結果を与えるだろう。
このようなカラス、ハゲタカとワシなどの鳥類スカベンジャー、すなわちCWD北米で、TSE疾患の広がりに役割を果たしている可能性があります。これらの種は、（狩猟殺したシカの場合）、罹患死体や内臓からCWD陽性組織を消費し、CWDのない地域やシカの個体群への糞便中に感染性物質を移動さでした。で、シカに穀物を供給するの実践として、野生または捕獲設定は、食料源で排便でき、不用意にシカによって消費されるカラスを集めて、このように高リスクの練習（VerCauteren個人観察）である。さらに、ランダムな糞の堆積によってプリオン解像度材料に遭遇CWDのない動物のオッズは低いかもしれませんが、共同ねぐらサイトを以下のようにカラスので、それらの糞が集中している地域は、プリオン以来、病気の伝染のための高リスク地域のなる可能性環境30,31でそう永続的です。
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Disclosures
利害の対立が宣言されていません。
Acknowledgments
私たちは、動物のケアとモニタリングのために、S.、本研究と米国農務省で使用されるカラスを提供するためのヴェルナー、APHIS、WS、NWRC動物管理スタッフに感謝したいと思います。言及または製品を使用するには、米国農務省の承認を意味するものではありません。この研究のための資金は、米国農務省、APHIS、獣医サービスによって提供された。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RML Chandler strain mouse-adapted scrapie | Rocky Mountain Laboratories | ||
| RC57BL/6 mice | Hilltop Lab Animals | ||
| American crows | wild captured | ||
| Pen/Strep | Invitrogen | 15140-122 | |
| Phosphate buffered Saline | Invitrogen | 70011-044 | |
| Sonicator | Misonix | ||
| Proteinase-K solution | Roche | 3115887001 | |
| Loading buffer | Invitrogen | NP0007 and 0009 | |
| Bis-tris SDS PAGE 12% gel | Invitrogen | NP0342 | |
| Immobilon PVDF membrane | Millipore | 1SEQ00010 | |
| Tween 20 | Sigma Aldrich | P2287 | |
| Bullet blender homogenizer | Braintree Scientific | BBX24B | |
| 2.3 mm Zirconia/silica beads | BioSpec Products | 11079125Z | |
| Bar224 anti-PrP monoclonal antibody | Cayman Chemical | 10009035 | |
| Superblock | Thermo Scientific | 37517 | |
| chemiluminescent substrate | Millipore | WBKLS0500 | |
| G-box gel documentation system | Syngene |
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