Summary
Asätare har potential att translocate smitt transmissibel spongiform encefalopati prioner i sin avföring till sjukdomsfria områden. Vi detalj metoder som används för att avgöra om mus-anpassade scrapie prioner bära på smitta efter passage om mag-tarmkanalen av amerikanska kråkor (Corvus brachyrhynchos), en vanlig konsument av döda djur.
Abstract
Smitt prion (PrP Res) material är sannolikt orsaken till dödlig, neurodegenerativ transmissibel spongiform encefalopati (TSE) sjukdomar 1. Överföring av TSE-sjukdomar, såsom chronic wasting disease (CWD), antas vara från djur till djur 2,3 samt från miljökällor 4-6. Asätare och rovdjur har potential att translocate PrP Res material genom konsumtion och utsöndring av CWD-förorenat kadaver. Senaste arbete har dokumenterat passage av PrP Res material genom matsmältningssystemet av amerikanska kråkor (Corvus brachyrhynchos), en gemensam nordamerikanska gatsopare 7.
Vi beskriver förfaranden som används för att dokumentera passage av PrP Res material genom amerikanska kråkor. Crows sondmatades med RML-stammen mus-anpassade scrapie och deras avföring samlades 4 timmar efter sondmatning. Crow avföring slogs sedan samman och injicerades intraperitonealt iC57BL / 6 möss. Möss övervakades dagligen tills de uttryckte kliniska tecken på musen scrapie och var därefter avlivas. Asymtomatisk möss övervakades under 365 dagar efter ympning. Western blot-analys utfördes för att bekräfta sjukdomsstatus. Resultaten visade att prioner bära på smitta efter resa genom matsmältningssystemet av kråkor och finns i avföringen, vilket orsakar sjukdom hos försöksmöss.
Introduction
Transmissibla spongiforma encefalopatier (TSE) är dödliga smittneurodegenerativa sjukdomar som drabbar djur, tamdjur och människor. Smittämnet av TSE-sjukdomar verkar vara felveckade eller patogena isoformer (PrP Res) av prionproteiner 1. Animal TSE-sjukdomar inkluderar chronic wasting disease (CWD) i mulehjortar (Odocoileushemionus), vitsvanshjort (Odocoileusvirginianus), älg (Cervus elaphus) och älg (Alces alces), scrapie hos får och getter, bovin spongiform encefalopati ( BSE) i inhemska nötkreatur, överförbar mink encefalopati i odlad mink, katt spongiform encefalopati hos katter, exotiska hovdjur spongiform encefalopati i exotiska zoo idisslar av familjen Bovidae, och spongiform encefalopati i icke-mänskliga primater 8. Den enda människa TSE-sjukdom, variant Creutzfeldt-Jakobs sjukdom, är sällsynt och tros förvärvas genom att konsumera PrP Res-förorenadeated maten 9. På samma sätt kan BSE smitta människor om förorenad nötkött konsumeras 10. Av alla TSE-sjukdomar, scrapie och CWD är de enda två med självbärande epidemier och källor för infektioner antas vara från djur till djur 2,3,11 samt från miljökällor 4-6. Forskning tyder på att de flesta TSE-sjukdomar kräver noter förlängda inkubationsperioder från naturliga exponering händelser av PrP Res material till manifestation av kliniska tecken 2-4,6,8 och uppenbara artbarriärer minimera, men eliminerar inte risken för, mellan arter transmission 12-14 .
Identifiera mekanismer för spridning av smittsamma prioner (PrP Res) material är oerhört viktigt för att svara på frågor om hur TSE-sjukdomarna rör sig över landskapet. Experimentella undersökningar har antytt att insekter 15,16, fjäderfä och svin 17, och amerikanska kråkor (Corvus brachyrhynchos) 7,18 är passiva bärare eller släck av PrP Res material. Passage av PrP Res material genom matsmältningssystemet av kråkor har nyligen dokumenterats, vilket visar vilken roll de kan spela för spridning av TSE-sjukdomar 7. Dessa resultat gör det troligt att kråkor, en asätare, kan stöta på, konsumera, och transportera infektiöst material via avföring nedfall, till sjukdomsfria områden.
De förfaranden som vi visar här användes för att dokumentera passage av PrP Res material genom rötning system av kråkor och kommer att kraftigt underlätta tillämpningen av dessa metoder till andra asätare och rovdjur artspecifika modeller i relaterad framtida forskning. I denna studie konventionella metoder användes för att utreda en okonventionell form av människohandel PrP Res material, vilket skulle kunna bidra till spridningen och totala bördan av PrP Res material.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Vår protokoll är anpassad från en vi tidigare publicerat 7. Alla som deltar i djurförsök har godkänts av Institutional Animal Care och användning kommittén av Förenta staternas Department of Agriculture (USDA), djur-och växtskydd Inspection Service (APHIS), Wildlife Services (WS), National Wildlife Research Center (NWRC).
1. Crow Gavaging
- Uppskatta passagetiden för "pseudohjärnmaterial" genom matsmältningskanalen av amerikanska kråkor.
- Blanda 5 ml kokt och oordning hela ägg med blått färgämne och sondmatning 1 kråka med hjälp av en 2 i sondmatning nål (Figur 1).
- Kontrollera kråkan var 30 min tills blå / grön-färgade avföring inte längre utsöndras.
- Skaffa oinfekterade och obotligt sjuka RML (Chandler stam)-infekterade C57BL / 6 mus hjärnor.
- Generera en 20% vikt / volym normal och infekterad mus-hjämhomogenat i en kula mixer homogenisator med 1xfosfatbuffrad saltlösning (PBS) och glaspärlor, centrifugera sedan vid 3000 x g under 1 min för att avlägsna större partiklar. Avlägsna supernatanten och späddes med en lika stor volym av 1 x PBS för att generera en 10% vikt / volym i steril PBS. Frys vid -80 ° C tills de behövdes.
- 17 timmar före sondmatning bort mat, men inte vatten, från kråk pennor.
- Slumpvis allokera gal i behandlingsgrupper och oralt gavage varje galande med 5 ml av antingen normal eller infekterad mushjärna-homogenat med användning av en 2 i sondmatning nål.
- Transfer gal till individuella burar och samla upp och slå samman all avföring inom varje bur för 4 timmar efter sondmatning (Figur 2).
- Homogenisera poolade avföring för varje galande i en kula mixer homogenisator med glaskulor tills en likformig konsistens uppnåtts. * Crow avföring är oftast flytande och kan blandas lätt.
- För varje galande, späd 500 | il av fekalt homogenat i 9,5 ml 1 x PBS för en total volym av 10 ml.
- Centrifugera det fekala homogenate under 15 min vid 1400 x g och extrahera supernatanten.
- För att minimera risken för en sekundär mikrobiell infektion, behandla supernatanten med 1 | il av 100 enheter / ml penicillin och 100 | ig / ml streptomycin (Invitrogen, NY) per 100 | il av homogenatet placera sedan under UV-ljus vid rumstemperatur under 20 min för att minska risk för viral och bakteriell kontamination. Efter UV-exponering, Sonikera prover i en 3000 Mp sonikator vid inställning 70 för 30 sekunder för att störa membranet i eventuella kvarvarande mikrober.
2. Mus Inokulering
- Slumpmässigt fördela möss till följande behandlingsgrupper (tabell 1):
- Grupp 1 - positiv behandling möss ympades intraperitonealt (IP) med 1 ml av fekalt homogenat från Mast oralt sondmatades med 5ml infekterat mushjärna.
- Grupp 2 - Negativ behandling möss inokulerade IP med 1 ml fekal homogenatet från kråkor oralt sondmatades med 5 ml normal mus hjärnor.
- Späd infected och vanlig mus hjämhomogenat för grupper 3 och 4 till 1:100 vikt / volym i 1x PBS.
- Grupp 3 - Positiva kontrollmöss inokulerade IP med 1 ml infekterad mus-hjämhomogenat.
- Grupp 4 - Negativt kontrollmöss inokulerade IP med 1 ml vanlig mus-hjämhomogenat.
| Behandlingsgrupp | Antal djur | |
| Grupp 1 | Scrapie + Crow Avföring | 100 |
| Grupp 2 | Scrapie - Crow Avföring | 25 |
| Grupp 3 | Scrapie + Mouse Brain | 10 |
| Grupp 4 | Scrapie - Mouse Brain | 5 |
. Tabell 1 scrapie status inokulat (positiv +, negativ -) och antalet djur som används 7.
- Intraperitonealt ympa mus:
- Scruff musen genom rygg hals päls med tummen och pekfingret och försiktigt vrida avslöja ventrala sidan.
- Höj bakre änden av musen så att huvudet är något lägre.
- Sätt 25 G nål 1 cm genom huden, 1 cm lateralt om mittlinjen, och 1-2 cm anterior till sakroiliakaleden med hjälp av en nål-låsning spruta.
- Injicera 1 ml ympa långsamt i mus kroppshålan.
3. Mus Övervakning
- Övervaka möss dagligen tills de uttrycker kliniska tecken på musen scrapie. Kliniska tecken kan vara: kyfos, ataxi, stel svans, brist på grooming, avmagring och slöhet.
- Betyg möss för var och en av de sex kliniska tecken när synliga tecken är uppenbara, där 0 = ingen synlig, 1 = måttlig, och 2 = allvarlig.
- Euthanize möss när totala dagliga poängen för varje tecken når ≥ 8 för 1 dag, ≥ 6 kontinuerligt i 3 dagar, eller 365 dagar efter ympning (dpi).
- Harvest hjärnor omedelbart efter euthanasia och förvara vid -70 ° C.
- För att bekräfta en scrapie diagnos, smälta hjärnprover med 3 | il av en 50 ng / ml av proteinas-K-lösning (PK) utspädd enligt följande: 3,1. il PK, 12,5 | il av 500 mM EDTA, pH 8, 109,39 il av 1 x PBS under 30 min vid 45 ° C och därefter inaktivering av PK genom tillsats av 8 | il laddningsbuffert och inkubera proverna vid 95 ° C under 5 min. Last prover på en 12% SDS-PAGE-gel, elektrofores och överföring till Immobilon PVDF-membran och block med 5% fettfri mjölk i 0,2% Tween 20 i PBS under 1 h vid rumstemperatur. Då proben med Bar224 av anti-PrP monoklonal antikropp konjugerad till pepparrotsperoxidas, utspätt i superblock, under 1 timme vid rumstemperatur. Skölj membranet under 1 h med PBS-0.2% Tween 20. För att visualisera, inkubera Western blot-5 min med kemiluminiscenta substratet och avbilda på en G-box geldokumenteringssystem.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De förfaranden som används för att visa att matsmältningssystemet hos gal inte eliminerar PrP Res infektivitet 4 h efter oral sondmatning av scrapie hjämhomogenat 7. Alla tjugo kråkor som sondmatades med PrP Res material som senare överförs PrP Res material via avföring till möss. Sjuka möss identifierades genom manifestation av kliniska mus-scrapie tecken och bekräftelse sjukdom avslutades med Western blot-analys.
Undersökning av retentionstiden för materialet förtärs av gal visade passagetiden genom matsmältningskanalen för en sondmatades galande att vara 4 timmar, baserad på närvaron av färgämne i avföring (figur 1). Alla avföring samlades med engångspipetter och slås samman för varje kråka (Figur 2). Akut toxicitet från obehandlade kråk avföring inträffade när rå fekal supernatant injicerades IP i pilotförsöksmöss. Genom att behandla fekal inokulat med penicillin och streptomycin, UV-ljus, och sonikering vi lindras detta problem.
Alla möss som inokulerats med antingen scrapie positiva mushjärna (9/9) eller avföring från scrapie-inokulerade gal (66 * / 84) utvecklade kliniska tecken och testade positivt genom Western blot-analys (Figur 3), vilket visar att scrapie lätt passera genom matsmältningssystemet av kråkor och orsakade sjukdom. * Arton möss dog inom 3 dagar efter ympning, sannolikt på grund av toxicitet. Alla utom ett (1/23) av skrapie-negativa inokulerade möss var negativa med Western blot-analys. Vår hypotes är att denna mus misstag ympas med scrapie-positiva kråk avföring istället för avföring från en scrapie-negativ kråka.
Figur 1. Crow manuellt återhållsamma och oralt sondmatades med 5 ml av hela ägg blandat med blå färg (A) och blue / grön-färgade avföring 4 timmar efter sondmatning (B). Klicka här för att visa en större bild .
Figur 2. Crow avföring samling med pipett före homogenisering. Klicka här för att visa en större bild .
Figur 3. . Representant SDS-Sidan Western blot av musen hjärnan från bioassay NBH-normal mus hjämhomogenat, scrapie-negativ, TX bur 4 - hjärna från en mus inokuleras med avföring från en scrapie-inokulerade kråka. Med (+) och without (-). PK (proteinas K) matsmältning Klicka här för att visa en större bild .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi visar ett förfarande för att dokumentera passage av PrP Res material genom matsmältningssystemet av gal. Vi använde konventionella metoder för att bestämma om Mast har förmågan att translokera PrP Res material till sjukdomsfria geografiska områden. Andra har utvärderat motstånd av PrP Res till idisslande 19-21 och gnagare 22,23 matsmältningsvätskor, som båda misslyckats med att eliminera den. Framtida tillämpning av dessa tekniker bör tillämpas på andra rovdjur 24 eftersom de kan också potentiellt stöta PrP Res material i kadaver och transportera detta material över landskapet underlättar spridningen av prionsjukdomar.
Vi lade blå karamellfärg till våra äggröra "pseudo hjärna" material, som ger ett enkelt sätt att bedöma ungefärlig passagetiden för homogeniserad mushjärna genom matsmältningskanalen av kråkor. Vi råda andra väger denna teknik för första instänker befintliga avföring färg på studie djur och sedan använda karamellfärg som är mest kontrasterande. Detta kommer att möjliggöra enkel identifiering av mat färg färgade material som har passerat genom studie djur. Vi valde att använda karamellfärg för att uppskatta tidens gång, men andra har använt fluorescerande pigment 25, järnoxid 26, färgad plast markörer 27, och färgade metallflingor (dvs. glitter) 28.
Minimera risken för en sekundär mikrobiell infektion från kråk avföring och korrekt ympar möss är viktiga utgångspunkter för mus-prion studier som kräver lång inkubationstid. Om någon av dessa överväganden kränks, kommer sannolikt att resultera tidig dödlighet mus.
En annan möjlig verktyg för undersökning är serie protein misfolding cyklisk förstärkning eller sPMCA att utvärdera kråkavföringsprover över tid för att fastställa hur långt efter oral sondmatning kråkor pass smittsamt material, medatt det krävs en bioassay på möss. Senaste framstegen inom PMCA fekal analys av Pulford, et al. Visar att förstärkning av små halter av prioner kan upptäckas i däggdjurs avföring 29, vilket tyder PMCA kan också vara ett användbart verktyg för att utvärdera avian avföring. Musen bioassay och sPMCA metod skulle kunna användas för att utvärdera kvarvarande smitta i avföring från kråkor sondmatades med CWD-smittat material. En cervidized transgen mus linje skulle krävas och intracerebral kontra intraperitoneal ympning skulle ge snabbare resultat.
Avian asätare, som t.ex. kråkor, gamar och örnar, skulle kunna spela en roll i spridningen av TSE-sjukdomar, nämligen CWD i Nordamerika. Dessa arter kan konsumera CWD-positiva vävnad från sjuka slaktkroppar eller inälvor (när det gäller jägare-dödat hjortdjur) och translocate infektiöst material i sin avföring till CWD fria områden eller populationer av hjortdjur. Som utfodring av spannmål till hjortdjur, i vild eller fångenskapinställningar, lockar kråkor som kan uträtta sina behov på näringskälla och oavsiktligt konsumeras av hjortdjur, är alltså en högriskpraxis (Vercauteren personlig observation). Vidare, även om oddsen för CWD-fria djur möter PrP Res material genom slump avföring nedfall kan vara låg, områden där kråkor och därmed deras avföring är koncentrerade, som nedan gemensamt övernattningsplatser, kan bli av högriskområden för smittspridning eftersom prioner är så långlivade i miljön 30,31.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Vi vill tacka S. Werner för att ge kråkorna som används i denna studie och USDA, APHIS, WS, NWRC djurvård personal för djurvård och övervakning. Nämn eller användning av en produkt innebär inte USDA godkännande. Finansieringen för denna studie gs av USDA, APHIS, veterinära tjänster.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RML Chandler strain mouse-adapted scrapie | Rocky Mountain Laboratories | ||
| RC57BL/6 mice | Hilltop Lab Animals | ||
| American crows | wild captured | ||
| Pen/Strep | Invitrogen | 15140-122 | |
| Phosphate buffered Saline | Invitrogen | 70011-044 | |
| Sonicator | Misonix | ||
| Proteinase-K solution | Roche | 3115887001 | |
| Loading buffer | Invitrogen | NP0007 and 0009 | |
| Bis-tris SDS PAGE 12% gel | Invitrogen | NP0342 | |
| Immobilon PVDF membrane | Millipore | 1SEQ00010 | |
| Tween 20 | Sigma Aldrich | P2287 | |
| Bullet blender homogenizer | Braintree Scientific | BBX24B | |
| 2.3 mm Zirconia/silica beads | BioSpec Products | 11079125Z | |
| Bar224 anti-PrP monoclonal antibody | Cayman Chemical | 10009035 | |
| Superblock | Thermo Scientific | 37517 | |
| chemiluminescent substrate | Millipore | WBKLS0500 | |
| G-box gel documentation system | Syngene |
References
- Prusiner, S. B. Novel proteinaceous infectious particles cause scrapie. Science. 216 (4542), 136-144 (1982).
- Miller, M. W., Williams, E. S., et al. Epizootiology of chronic wasting disease in free-ranging cervids in Colorado and Wyoming. Journal of Wildlife Diseases. 36 (4), 676-690 (2000).
- Miller, M. W., Williams, E. S. Horizontal prion transmission in mule deer. Nature. 425 (6953), 35-36 (2003).
- Sigurdson, C. J., Adriano, A.
- Miller, M. W., Williams, E. S., Hobbs, N. T., Wolfe, L. L. Environmental sources of prion transmission in mule deer. Emerging Infectious Diseases. 10 (6), 1003-1006 (2004).
- Mathiason, C. K., Hays, S. A., et al. Infectious prions in pre-clinical deer and transmission of chronic wasting disease solely by environmental exposure. PLoS ONE. 4 (6), e5916 (2009).
- VerCauteren, K. C., Pilon, J. L., Nash, P. B., Phillips, G. E., Fischer, J. W. Prion remains infectious after passage through digestive system of American crows (Corvus crachyrhunchos). PLoS ONE. 7 (10), e45774 (2012).
- Imran, M., Mahmood, S. An overview of animal prion diseases. Virology Journal. 8 (493), (2011).
- Watts, J. C., Balachandran, A., Westaway, D. The expanding universe of prion disease. PLoS PATHOGENS. 2 (3), e26 (2006).
- Bruce, M. E., et al. Transmissions to mice indicate that 'new variant' CJD is caused by the BSE agent. Nature. 389 (6650), 498-501 (1997).
- Ryder, S., Dexter, G., Bellworty, S., Tongue, S. Demonstration of lateral transmission of scrapie between sheep kept under natural conditions using lymphoid tissue biopsy. Research in Veterinary Science. 76 (2004), 211-217 (2004).
- Collinge, J.
- Beringue, V., Vilotte, J. L., Laude, H. Prion agent diversity and species barrier. Veterinary Research. 39 (47), (2008).
- Harrington, R. D., Baszler, T., et al. A species barrier limits transmission of chronic wasting disease to mink (Mustela vison). The Journal of General Virology. 89 (4), 1086-1096 (2008).
- Wisniewski, H. M., Sigurdarson, S., Rubenstein, R., Kascsak, R. J., Carp, R. I. Mites as vectors for scrapie. Lancet. 347 (9008), 1114 (1996).
- Post, K., Riesner, D., Walldorf, V., Mehlhorn, H. Fly larvae and pupae as vectors for scrapie. Lancet. 354 (9194), 1969-1970 (1999).
- Matthews, D., Cooke, B. C. The potential for transmissible spongiform encephalopathies in non-ruminant livestock and fish. Revue Scientifique Et Technique-Office International Des Epizooties. 22 (1), 283-296 (2003).
- Jennelle, C. S., Samuel, M. D., Nolden, C. A., Berkley EA, Deer carcass decomposition and potential scavenger exposure to chronic wasting disease. Journal of Wildlife Management. 73 (5), 655-662 (2009).
- Scherbel, C., Pichner, R., et al. Degradation of scrapie associated prion protein (PrPSc) by the gastrointestinal microbiota of cattle. Veterinary Research. 37 (5), 695-703 (2006).
- Jeffrey, M., Gonzaález, L., et al. Transportation of prion protein across the intestinal mucosa of scrapie susceptible and scrapie-resistant sheep. Journal of Pathology. 209 (1), 4-14 (2006).
- Nicholson, E. M., Richt, J. A., Rasmussen, M. A., Hamir, A. N., Lebepe-Mazur, S., Horst, R. L. Exposure of sheep scrapie brain homogenate to rumen-simulating conditions does not result in a reduction of PrP(Sc) levels. Letters in Applied Microbiology. 44 (6), 631-636 (2007).
- Motes C, M. aluquerde, Grassi, J., et al. Excretion of BSE and scrapie prions in stools from murine models. Veterinary Microbiology. 131 (1-2), 205-211 (2008).
- Kruger, D., Thomzig, A., Lenz, G., Kampf, K., McBride, P., Beekes, M. Faecal shedding, alimentary clearance and intestinal spread of prions in hamsters fed with scrapie. Veterinary Research. 40 (1), 4 (2009).
- Mathiason, C. K., Nalls, A. V., et al. Susceptibility of domestic cats to chronic wasting disease. Journal of Virology. 87 (4), 1947-1956 (2013).
- Bjorndal, K. A. Flexibility of digestive responses in two generalist herbivores, the tortoises Geochelone carbonaria and Geochelone denticulate. Oecologia. 78 (3), 317-321 (1989).
- Clark, R. G., Gentle, G. C. Estimates of grain passage time in captive mallards. Canadian Journal of Zoology. 68 (11), 2275-2279 (1990).
- Dierenfeld, E. S., Koontz, F. W. Feed intake, digestion and passage of proboscis monkey (Nasalis larvatus) in captivity. Primates. 33 (3), 399-405 (1992).
- Thompson, A. K., Samuel, M. D., Van Deelen, T. R. Alternative feeding strategies and potential disease transmission in Wisconsin white-tailed deer. Journal of Wildlife Management. 72 (2), 416-421 (2008).
- Pulford, B., Spraker, T. A., et al. Detection of PrPCWD in feces from naturally exposed Rocky Mountain elk (Cervus elaphus nelsoni) using protein misfolding cyclic amplification. Journal of Wildlife Diseases. 48 (2), 425-433 (2012).
- Hicks, R. E. Guano deposition in an Oklahoma crow roost. Condor. 81 (3), 247-250 (1979).
- Aldous, S. E.
