Procedures voor het identificeren van Besmettelijke Prions na passage door het spijsverteringsstelsel van een vogelsoort

Summary

Aaseters hebben potentieel om besmettelijke overdraagbare spongiforme encefalopathie prionen translokeren in hun uitwerpselen te ziektevrije gebieden. We detail methoden die worden gebruikt om te bepalen of de muis aangepast scrapie prionen infectieus blijven na passage al is het spijsverteringskanaal van de Amerikaanse kraaien (Corvus brachyrhynchos), een gemeenschappelijke consument van dode dieren.

Abstract

Infectieuze prion (PrP ^Res) materiaal is waarschijnlijk de oorzaak van fatale, neurodegeneratieve overdraagbare spongiforme encefalopathieën (TSE) ziekten ^1. Overdracht van TSE ziekten, zoals chronische wasting disease (CWD), wordt geacht te zijn van dier tot dier ^2,3 en uit omgevingsbronnen ^4-6. Aaseters en carnivoren hebben potentieel om PrP ^Res materiaal translocatie door de consumptie en de uitscheiding van CWD-besmette kadavers. Recent werk heeft passage van PrP ^Res materiaal gedocumenteerd door het spijsverteringsstelsel van de Amerikaanse kraaien (Corvus brachyrhynchos), een gemeenschappelijke Noord-Amerikaanse scavenger ^7.

We beschrijven procedures die gebruikt worden om de doorgang van PrP ^Res materiaal documenteren door Amerikaanse kraaien. Kraaien werden gavaged met RML-stam-muis aangepast scrapie en hun uitwerpselen werden verzameld 4 uur na maagsonde. Crow ontlasting werden vervolgens samengevoegd en intraperitoneaal geïnjecteerdC57BL / 6 muizen. Muizen werden dagelijks gecontroleerd totdat ze uitgedrukt klinische symptomen van muis scrapie en werden daarna gedood. Asymptomatische muizen werden gevolgd tot 365 dagen na de inenting. Western blot analyse werd uitgevoerd om ziektestatus bevestigen. Resultaten bleek dat prionen infectieus blijven na een reis door het spijsverteringsstelsel van kraaien en aanwezig in de ontlasting zijn, waardoor de ziekte in de test muizen.

Introduction

Overdraagbare spongiforme encefalopathieën (TSE) zijn fatale besmettelijke neurodegeneratieve aandoeningen die dieren beïnvloeden, huisdieren en mensen. De ziekteverwekker van TSE-ziekten lijkt verkeerd gevouwen of pathogene isovormen (PrP ^Res) van prion-eiwitten ¹ zijn. Dierlijke TSE-ziekten omvatten Chronic Wasting Disease (CWD) bij muildierhert (Odocoileus hemionus), wit-staart hert (virginianus), elanden (Cervus elaphus), en elanden (Alces Alces), scrapie bij schapen en geiten, boviene spongiforme encefalopathie ( BSE) in vee; overdraagbare encefalopathie van de nerts in gekweekte nertsen; katachtige spongiforme encefalopathie bij katten; exotische hoefdieren spongiforme encefalopathie in exotische dierentuin herkauwt van de familie Bovidae, en spongiforme encefalopathie bij niet-humane primaten ^8. De single menselijke ziekte TSE, variant van de ziekte van Creutzfeldt-Jakob, is zeldzaam en gedacht te worden overgenomen door het consumeren van PrP ^Res-Contaminated eten ^9. Op dezelfde manier kan BSE mensen besmetten als besmet rundvlees wordt verbruikt ^10. Van alle TSE-ziekten, scrapie en CWD zijn de enige twee met zelfdragende epidemieën en de bronnen van infectie word aangenomen dat van dier tot dier ^2,3,11 en uit omgevingsbronnen ^4-6. Uit onderzoek blijkt dat de meeste TSE-ziekten vereisen opmerkelijk langere incubatie door natuurlijke blootstelling gebeurtenissen van PrP ^Res materiaal manifestatie van klinische symptomen ^2-4,6,8 en schijnbare soort barrières te minimaliseren, maar het potentieel voor, tussen soorten transmissie ^12-14 niet elimineren .

Het identificeren van mechanismen voor de verspreiding van besmettelijke prion (PrP ^Res) materiaal is uiterst belangrijk voor het beantwoorden van vragen over het TSE-ziekten bewegen over het landschap. Experimentele onderzoeken hebben gesuggereerd dat ^15,16, pluimvee en varkens ^17, en Amerikaanse kraaien (Corvus brac insectenhyrhynchos) ^7,18 zijn passieve dragers of Verspreiders van PrP ^Res materiaal. Passage van PrP ^Res materiaal door het spijsverteringsstelsel van kraaien is onlangs gedocumenteerd, het aantonen van de rol die zij kunnen spelen bij de verspreiding van TSE-ziekten ^7. Deze resultaten maken het aannemelijk dat kraaien, een aaseter, zou kunnen tegenkomen, consumeren, en transporteren infectieus materiaal via uitwerpselen depositie, naar ziektevrije gebieden.

De procedures die we hier laten zien werden gebruikt om de passage van PrP ^Res materiaal te documenteren door het spijsverteringsstelsel van kraaien en zal de toepassing van deze methoden om andere aaseter en carnivoor soortspecifieke modellen in gerelateerde toekomstig onderzoek aanzienlijk vergemakkelijken. In deze studie werden conventionele methoden gebruikt om een onconventionele middelen van mensenhandel PrP ^Res materiaal, die kunnen bijdragen tot de verspreiding en de totale lasten van PrP ^Res materiaal te onderzoeken.

Protocol

Ons protocol is een bewerking van degene die we eerder gepubliceerde ^7. Alle procedures waarbij dieren werden goedgekeurd door de Institutional Animal Care en gebruik Comite van het Amerikaanse ministerie van Landbouw (USDA), Animal and Plant Health Inspection Service (APHIS), Wildlife Services (WS), National Wildlife Research Center (NWRC).

1. Kraai Gavaging

1. Schatten doorlooptijd van 'pseudo hersenmateriaal' door het spijsverteringskanaal van de Amerikaanse kraaien.
   1. Meng 5 ml gekookt en roerei hele eieren met blauwe kleurstof en maagsonde 1 kraai met een 2 in maagsonde naald (figuur 1).
   2. Controleer kraai elke 30 min, totdat blauw / groen-gekleurde ontlasting niet meer worden uitgescheiden.
2. Verkrijgen geïnfecteerde en terminaal zieke RML (Chandler stam) geïnfecteerde C57BL / 6 muis hersenen.
3. Genereer een 20% gew / vol normale en geïnfecteerde muizen-homogenaat in een kogel mixer homogenisator met 1xfosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) en glaskralen, centrifugeer bij 3000 xg gedurende 1 min tot grotere deeltjes te verwijderen. Verwijder de supernatant en verdun met een gelijk volume van 1 x PBS tot een 10% gew / vol in steriele PBS genereren. Invriezen bij -80 ° C totdat het nodig is.
4. 17 uur voorafgaand aan de maagsonde verwijderen voedsel, maar geen water, uit kraai pennen.
5. Willekeurig toewijzen kraaien behandelingsgroepen en mondeling maagsonde elke kraai met 5 ml van een normaal of een besmette muis hersenhomogenaat met behulp van een 2 in maagsonde naald.
6. Transfer kraaien individuele kooien en het verzamelen en bundelen alle uitwerpselen binnen elke kooi voor 4 uur na maagsonde (figuur 2).
7. Homogeniseren samengevoegde feces voor elke kraai in een kogel blender homogeniseerder met glaskralen totdat een gelijkmatige textuur wordt bereikt. * Crow uitwerpselen zijn meestal vloeibaar en kan gemakkelijk worden gemengd.
8. Voor elk object, verdun 500 gl fecale homogenaat in 9,5 ml 1x PBS gedurende een totaal volume van 10 ml.
9. Centrifugeer de fecale homogenate gedurende 15 minuten bij 1400 xg en verwijder de bovenstaande vloeistof.
10. Om het gevaar van een secundaire microbiële infectie minimaliseren, behandel supernatant met 1 pl van 100 eenheden / ml penicilline en 100 ug / ml streptomycine (Invitrogen, NY) per 100 pl homogenaat dan plaats onder UV licht bij kamertemperatuur gedurende 20 minuten te verminderen risico van virale en bacteriële besmetting. Na blootstelling aan UV, ultrasone trillingen monsters in een 3000 Mp sonicator bij instelling 70 gedurende 30 seconden op het membraan van de overige microben verstoren.

2. Muis Enten

1. Willekeurig muizen kent de volgende behandelingsgroepen (tabel 1):
   1. Groep 1 - Positieve behandelde muizen intraperitoneaal geïnoculeerd (IP) met 1 ml van fecale homogenaat van kraaien oraal gavaged met 5 ml besmette muis hersenen.
   2. Groep 2 - Negatieve behandelde muizen ingeënt IP met 1 ml van fecale homogenaat van kraaien oraal gavaged met 5 ml normale muis hersenen.
   3. Verdunnen infected en normale muizenhersenen homogenaat voor groepen 3 en 4 tot 1:100 w / v in 1x PBS.
   4. Groep 3 - positieve controle muizen geïnoculeerd IP met 1 ml geïnfecteerde muizen-hersenhomogenaat.
   5. Groep 4 - Negatieve controle muizen geïnoculeerd IP met 1 ml normaal muizen-hersenhomogenaat.

	Behandeling Groep	Aantal dieren
Groep 1	Scrapie + Crow Uitwerpselen	100
Groep 2	Scrapie - Crow Uitwerpselen	25
Groep 3	Scrapie + Mouse Brain	10
Groep 4	Scrapie - Mouse Brain	5

. Tabel 1 Scrapie status van inoculum (positief +, negatief -) en het aantal gebruikte dieren ^7.

2. Intraperitoneaal te enten muis:
   1. Nekvel muis door het dorsale nek bont met duim en wijsvinger en voorzichtig draaien om buikzijde bloot.
   2. Elevate achterste eind van de muis, zodat het hoofd iets lager.
   3. Steek 25 G naald 1 cm door de huid, 1 cm lateraal van de middellijn, en 1-2 cm juist voor de SI-gewricht met behulp van een naald vergrendeling spuit.
   4. Injecteer 1 ml te enten langzaam in muis lichaamsholte.

3. Muis Monitoring

1. Monitor muizen dagelijks tot ze klinische symptomen van muis scrapie uit te drukken. Klinische verschijnselen kunnen zijn: kyfose, ataxie, stijve staart, gebrek aan verzorging, vermagering, en lethargie.
2. Score muizen voor elk van de 6 klinische symptomen als zichtbare tekenen zijn evident, waarbij 0 = geen zichtbare, 1 = matig, 2 = ernstig.
3. Euthanaseren muizen als totale dagelijkse scores voor elk teken bereiken ≥ 8 voor 1 dag, ≥ 6 continu gedurende 3 dagen, of 365 dagen na inoculatie (dpi).
4. Harvest hersenen onmiddellijk na euthanasia en bewaar bij -70 ° C.
5. Een scrapie diagnose te bevestigen, verteren hersenstalen met 3 pl van een 50 ug / ml proteïnase-K-oplossing (PK) als volgt verdund: 3.1. pl PK, 12,5 ui 500 mM EDTA, pH 8, 109,39 pl 1x PBS gedurende 30 min bij 45 ° C, daarna het inactiveren PK door toevoeging van 8 pi laadbuffer en incubatie monsters bij 95 ° C gedurende 5 minuten. Samples op een 12% SDS-PAGE gel, Electrophorèse transfer naar Immobilon PVDF membraan en blokkeren met 5% magere melk in 0,2% Tween 20 in PBS gedurende 1 uur bij kamertemperatuur geroerd. Sonde daarna met Bar224 anti-PrP monoklonaal antilichaam geconjugeerd aan mierikswortel peroxidase, verdund in superblok, gedurende 1 uur bij kamertemperatuur geroerd. Spoel membraan gedurende 1 uur met PBS 0,2% Tween 20. Visualiseren, incubeer Western blot 5 min met chemiluminescentiesubstraat en beeld op een G-box gel-documentatiesysteem.

Representative Results

De procedures die aantonen dat het spijsverteringsstelsel kraaien PrP ^Res infectiviteit 4 uur niet elimineert na orale gavage van scrapie hersenhomogenaat ^7. Alle twintig kraaien die werden gavaged met PrP ^Res materiaal vervolgens overgebracht PrP ^Res materiaal via ontlasting te muizen. Zieke muizen werden geïdentificeerd door manifestatie van klinische muis scrapie symptomen en bevestiging ziekte werd voltooid door Western blotanalyse.

Onderzoek van de retentietijd van materiaal ingenomen door kraaien geopenbaard passage tijd door het spijsverteringskanaal voor een gavaged kraai tot 4 uur, gebaseerd op de aanwezigheid van de kleurstof in de feces (figuur 1). Alle uitwerpselen werden met wegwerp pipetten verzameld en samengevoegd voor elke kraai (figuur 2). Acute toxiciteit van onbehandelde kraai uitwerpselen gebeurde toen ruwe fecale supernatant werd geïnjecteerd IP in pilot muizen. Door de behandeling van fecale enten met penicilline en streptomycin, UV-licht, en sonicatie we verlicht dit probleem.

Alle muizen geïnoculeerd met ofwel scrapie positieve muizenhersenen (9/9) of ontlasting van scrapie geïnoculeerd kraaien (66 * / 84) ontwikkelde klinische tekenen en positief door Western blot-analyse (Figuur 3) getest, die illustreert dat scrapie gemakkelijk doorheen de spijsverteringsstelsel van kraaien en veroorzaakt ziekte. * Achttien muizen stierven binnen 3 dagen na inoculatie, waarschijnlijk wegens toxiciteit. Alle, maar een (1/23) scrapie-negatieve geënt muizen waren negatief door Western blot analyse. Onze hypothese is dat deze muis per ongeluk werd geënt met scrapie-positieve kraai ontlasting in plaats van ontlasting van een scrapie-negatieve kraai.

Figuur 1. Kraai handmatig ingetogen en mondeling gavaged met 5 ml heel ei gemengd met blauwe kleurstof (A) en Blue / groen-gekleurde ontlasting 4 uur na sondevoeding (B). Klik hier voor grotere afbeelding .

Figuur 2. Kraai uitwerpselen collectie met pipet voorafgaand aan homogenisering. Klik hier voor grotere afbeelding .

Figuur 3. . Vertegenwoordiger SDS-PAGE Western Blot van de hersenen van muizen uit bioassay NBH-normale muis hersenhomogenaat, scrapie-negatieve, TX kooi 4 - hersenen van een muis ingeënt met uitwerpselen van een scrapie ingeënt kraai. Met (+) en without (-). PK (proteinase K) spijsvertering Klik hier voor grotere afbeelding .

Discussion

We tonen een procedure om doorgang van PrP ^Res materiaal te documenteren door het spijsverteringsstelsel van kraaien. We gebruikten gebruikelijke werkwijzen om te bepalen of kraaien de mogelijkheid om PrP ^Res materiaal verplaatsen naar ziektevrije geografische gebieden. Anderen hebben weerstand van PrP ^Res geëvalueerd om ^19-21 en knaagdieren ^22,23 spijsverteringssappen, die beide niet in geslaagd om het te elimineren herkauwers. Toekomstige toepassing van deze technieken moeten worden toegepast op andere carnivoren ²⁴ als ze konden ook potentieel PrP ^Res materiaal tegenkomen in aas en transporteren van dit materiaal over het landschap vergemakkelijken de verspreiding van prionziekten.

We voegden blauwe kleurstof om onze roerei 'pseudo brein' materiaal, het verstrekken van een eenvoudige manier om de geschatte doorlooptijd van gehomogeniseerd hersenen van muizen te beoordelen door het spijsverteringskanaal van kraaien. Wij adviseren anderen overwegen deze techniek eerst inswachten dat bestaande uitwerpselen kleur van studie dieren en gebruik vervolgens kleurstof die het meest contrasterende. Dit zal zorgen voor een gemakkelijke identificatie van de kleurstof gekleurd materiaal dat is gepasseerd door studie dieren. We kozen ervoor om kleurstof te gebruiken om schatten doorlooptijd, maar anderen hebben fluorescerende pigment ^25, ijzeroxide ^26, gekleurde plastic markers ²⁷ en gekleurde metaalpoeder (dwz glitter) ²⁸ gebruikt.

Het minimaliseren van de dreiging van een secundaire bacteriële infectie van kraai uitwerpselen en correct inenten van muizen zijn de belangrijkste uitgangspunten voor muis-prion studies die lange incubatieperiode nodig. Als een van deze overwegingen worden geschonden, vroeg de muis sterfte waarschijnlijk resulteren.

Een andere mogelijke hulpmiddel voor het onderzoek is seriële eiwit misfolding cyclische amplificatie of sPMCA om kraai fecale monsters te evalueren in de tijd om vast te stellen hoe lang na orale sondevoeding kraaien passeren infectieus materiaal, metop de noodzaak van een bioassay in muizen. Recente ontwikkelingen in PMCA fecale analyse door Pulford et al.. Aan dat amplificatie van minieme hoeveelheden prionen kunnen worden vastgesteld zoogdier ontlasting ^29, suggereert PMCA kan ook nuttig voor het evalueren van aviaire ontlasting zijn. De muis bioassay en sPMCA benadering kan worden gebruikt om restbesmettelijkheid evalueren uitwerpselen van kraaien gavaged met CWD besmette materiaal. Een cervidized transgene muis lijn nodig zou zijn en intracerebrale versus intraperitoneale enting zou snellere resultaten.

Avian aaseters, zoals kraaien, gieren en adelaars, zou een rol kunnen spelen bij de verspreiding van TSE-ziekten, namelijk CVO in Noord-Amerika. Deze soorten kunnen CWD-positieve weefsel consumeren van zieke karkassen of ingewanden (in het geval van-jager gedood hertachtigen) en translocate infectieus materiaal in hun uitwerpselen om-CVO vrije gebieden of populaties van hertachtigen. Als de praktijk van het voederen graan tot hertachtigen, in het wild of in gevangenschapinstellingen, trekt kraaien die kunnen poepen op de voedselbron en worden onbedoeld geconsumeerd door hertachtigen, is dus een hoog risico praktijk (Vercauteren persoonlijke observatie). Verder, hoewel de kansen van het CVO-vrije dieren tegenkomen PrP ^Res materiaal door middel van willekeurige ontlasting depositie laag kunnen zijn, gebieden waar kraaien en dus hun uitwerpselen zijn geconcentreerd, zoals hieronder gemeenschappelijk rustplaats sites, zou kunnen worden van hoog-risicogebieden voor overdracht van ziekten sinds prionen zijn zo persistent in het milieu ^30,31.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
RML Chandler strain mouse-adapted scrapie	Rocky Mountain Laboratories
RC57BL/6 mice	Hilltop Lab Animals
American crows	wild captured
Pen/Strep	Invitrogen	15140-122
Phosphate buffered Saline	Invitrogen	70011-044
Sonicator	Misonix
Proteinase-K solution	Roche	3115887001
Loading buffer	Invitrogen	NP0007 and 0009
Bis-tris SDS PAGE 12% gel	Invitrogen	NP0342
Immobilon PVDF membrane	Millipore	1SEQ00010
Tween 20	Sigma Aldrich	P2287
Bullet blender homogenizer	Braintree Scientific	BBX24B
2.3 mm Zirconia/silica beads	BioSpec Products	11079125Z
Bar224 anti-PrP monoclonal antibody	Cayman Chemical	10009035
Superblock	Thermo Scientific	37517
chemiluminescent substrate	Millipore	WBKLS0500
G-box gel documentation system	Syngene