Summary
Падальщики есть потенциал, чтобы перемещать инфекционные инфекционные губчатой энцефалопатии прионы в их фекалиях безрецидивному областях. Мы методов детали, используемые для определения, если мышь-адаптированные скрепи прионы остаются инфекционные после прохождения хотя пищеварительного тракта американских ворон (Corvus brachyrhynchos), общей потребителя мертвых животных.
Abstract
Инфекционные прионов (PRP Res) материал, скорее всего, причиной смертельных, нейродегенеративных передающегося губчатой энцефалопатии (TSE) заболеваний 1. Передача TSE заболеваний, таких как хроническая изнуряющая болезнь (УХО), как предполагают, от животного к животному 2,3, а также от экологических источников 4-6. Падальщики и плотоядные есть потенциал, чтобы перемещать PrP Res материала через потребление и экскреции УХО загрязненных падалью. Последние работы документально прохождение PrP Res материала через пищеварительную систему американских ворон (Corvus brachyrhynchos), общей североамериканского поглотителя 7.
Мы описываем процедуры, используемые для документирования прохождения PrP Res материала через американские вороны. Вороны были через желудочный зонд с RML-деформированного мыши адаптированных скрепи и их фекалии собирают 4 ч после введения через зонд. Crow фекалии собирают и затем вводили внутрибрюшинно вC57BL / 6 мышей. Мышей контролировали ежедневно, пока они не выразили клинические признаки мыши скрепи и были впоследствии подвергнуты эвтаназии. Бессимптомные мышей не наблюдали до 365 дней после инокуляции. Вестерн-блот анализ был проведен для подтверждения статуса заболевания. Результаты показали, что прионы остаются инфекционные после путешествия через пищеварительную систему ворон и присутствуют в кале, вызывая болезни в тестовых мышей.
Introduction
Трансмиссивные губчатые энцефалопатии (TSE) смертельные инфекционные нейродегенеративные расстройства, которые влияют на диких животных, домашние животные, и люди. Возбудитель из TSE заболеваний, как представляется, неправильно уложенные или патогенные изоформы (PRP Res) прионных белков 1. Животное TSE заболевания включают хроническое заболевание атрофии (УХО) в оленя мула (Odocoileus hemionus), белохвостый олень (Odocoileus virginianus), лося (Cervus Elaphus) и лося (Alces Alces); скрепи у овец и коз; коровьей губчатой энцефалопатии ( БФБ) в домашнего скота; передающийся норки энцефалопатия в выращиваемых норки; кошачий губчатая энцефалопатия у кошек; экзотические копытных губчатая энцефалопатия в экзотическом зоопарке размышляет семейного парнокопытных и губчатая энцефалопатия в приматов 8. Сингл болезнь человеческого TSE, вариант болезни Крейтцфельда-Якоба, является редким и считается, приобрел, потребляя PrP Res-разлиованные питания 9. Точно так же, BSE может инфицировать людей при загрязнении говядины расходуется 10. Из всех заболеваний TSE, скрепи и УХО являются только два с самостоятельных эпидемий и источников для инфекции, как предполагается, будет от животного к животному 2,3,11, а также от экологических источников 4-6. Исследования показывают, что большинство болезней TSE требуют заметных длительные периоды инкубации от природных явлений облучения PrP Res материала проявления клинических признаков 2-4,6,8 и очевидные видов барьеры минимизировать, но не устраняют потенциал для, передачи межвидовая 12-14 .
Выявление механизмов для распространения инфекционных прионов (PRP Res) материала является чрезвычайно важным для ответов на вопросы о том, как TSE заболевания двигаться по всему ландшафту. Экспериментальные исследования показали, что насекомые 15,16, птицы и свиней 17 и американские вороны (Corvus Брачhyrhynchos) 7,18 являются пассивными носителями или диспергаторы из PrP Res материала. Прохождение PrP Res материала через пищеварительную систему ворон недавно были задокументированы, демонстрируя роль они могут сыграть в разгоне TSE заболеваний 7. Эти результаты дают вероятно, что вороны, мусорщик, может столкнуться, потреблять и транспортировать инфекционного материала с помощью осаждения фекалий, безрецидивному областях.
Процедуры мы демонстрируем здесь были использованы для документирования прохождения PrP Res материала через системы пищеварения ворон и значительно облегчит применение этих методов к другим поглотителя и мясоеда видовой конкретных моделей в соответствующих будущих исследований. В этом исследовании обычные методы были использованы для исследования нетрадиционных средств торговли людьми, PrP Res материал, который мог бы внести вклад в распространение и общей бремени PrP Res материала.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Наш протокол адаптирован из одного мы ранее опубликованной 7. Все процедуры с участием животных были одобрены Институциональные уходу и использованию животных комитета Соединенных Штатов департамента сельского хозяйства (USDA), животных и растений инспекционной службы здравоохранения (APHIS), дикой природы служб (WS), Национального исследовательского центра дикой природы (NWRC) на.
1. Ворона Gavaging
- Оценка срок прохождения 'псевдо мозга материала "через пищеварительный тракт американских ворон.
- Смешайте 5 мл приготовленные и яичница целое яйцо с синим красителем и через желудочный зонд 1 ворона с использованием 2 в зондового иглы (рис. 1).
- Проверьте ворона каждые 30 мин до тех пор, синий / зеленый окрашенных фекалий не больше не выводятся из организма.
- Получить незараженных и неизлечимо больных RML (Чандлер штамм)-инфицированных C57BL / 6 мозги мыши.
- Создайте 20% вес / объем нормальный и зараженный гомогената мыши мозга в пуля блендера гомогенизатор с 1хфосфатный буферный раствор (PBS), и стеклянные бусы, то центрифуге при 3000 мкг в течение 1 мин для удаления крупных твердых частиц. Удалить супернатант и разбавляют равным объемом 1x PBS, чтобы генерировать 10% вес / объем в стерильном PBS. Замораживание при -80 ° С до использования.
- 17 ч до зонд удаления остатков пищи, но не воды, от ворона ручек.
- Случайно выделить ворон в группах лечения и в устной форме через желудочный зонд каждый ворону с 5 мл либо нормальной или зараженной гомогената мозга мыши с помощью 2 в зондового иглы.
- Передача вороны в индивидуальные клетки и собирать и объединять все фекалии внутри каждой клетки в течение 4 часов после кормления через желудочный зонд (рис. 2).
- Гомогенизируют объединенных фекалии для каждого ворона в пуля блендера гомогенизатора со стеклянными шариками до образования однородной текстуры не будет достигнута. * Crow фекалии в основном жидкости и может быть легко смешивается.
- Для каждого ворон, разбавленной 500 мкл гомогената фекального в 9,5 мл 1x PBS при общем объеме 10 мл.
- Центрифуга фекальный homogenaТе течение 15 мин при 1400 х г и извлечения супернатанта.
- Чтобы свести к минимуму угрозу вторичного микробной инфекции, лечения супернатант с 1 мкл 100 единиц / мл пенициллина и 100 мкг / мл стрептомицина (Invitrogen, Нью-Йорк) в 100 мкл гомогената затем поместите под УФ-светом при комнатной температуре в течение 20 мин, чтобы уменьшить риск вирусного и бактериального загрязнения. После УФ-облучения, соникатные образцы в 3000 Мп для обработки ультразвуком на установке 70 в течение 30 сек, чтобы сорвать мембрану оставшихся микробов.
2. Мышь Прививка
- Случайно выделить мышей на следующие группы лечения (табл. 1):
- Группа 1 - Положительные мышей лечение прививку внутрибрюшинно (IP) 1 мл фекального гомогената из ворон устно которым вводили 5 мл заражен мозг мыши.
- Группа 2 - мыши лечения Отрицательный прививку IP 1 мл фекального гомогената из ворон устно которым вводили 5 мл нормальных мозгах мыши.
- Развести infecteг и нормальной мозга мыши гомогенат для групп 3 и 4 до 1:100 вес / объем в 1x PBS.
- Группа 3 - Положительные контрольные мыши прививку IP 1 мл зараженной гомогената мыши мозга.
- Группа 4 - Отрицательный контрольных мышей прививали IP 1 мл нормальной гомогената мыши мозга.
| Группа по лечению | Количество животных | |
| Группа 1 | Скрепи + Crow Фекалии | 100 |
| Группа 2 | Скрепи - Crow Фекалии | 25 |
| Группа 3 | Скрепи + Mouse Brain | 10 |
| Группа 4 | Скрепи - мозга мыши | 5 |
. Таблица 1 Скрепи статус посевного (положительный +, отрицательный -) и количество животных используется 7.
- Внутрибрюшинно прививку мышь:
- Scruff мыши на спинной шеи меха с большим и указательным пальцами и аккуратно поверните выставить брюшной стороне.
- Поднимите задний конец мыши так голова немного ниже.
- Вставьте 25 г иглы 1 см через кожу, 1 см латеральнее от средней линии, и 1-2 см впереди крестцово-подвздошных сочленений, используя иглы блокировки шприц.
- Введите 1 мл инокул медленно в полости тела мыши.
3. Мониторинг мышь
- Монитор мышей ежедневно, пока они не выражают клинические признаки мыши скрепи. Клинические признаки могут включать: кифоз, атаксия, ригидность хвост, отсутствие ухода, истощение, и вялость.
- Оценка мышей для каждого из клинических признаков 6, когда видимые признаки очевидны, где 0 = нет видимый, 1 = умеренная, и 2 = тяжелая.
- Усыпить мышей, когда общая суточная баллы за каждого знака достичь ≥ 8 в течение 1 дня, ≥ 6 непрерывно в течение 3-х дней, или, по крайней 365 дней после прививки (точек на дюйм).
- Урожай мозги сразу же после euthanАзия и хранить при температуре -70 ° С.
- Чтобы подтвердить диагноз скрепи, переварить образцы мозга с 3 мкл 50 мкг / мл раствора протеиназы-К (PK) разбавленных следующим образом: 3.1. PK мкл, 12,5 мкл 500 мМ ЭДТА, рН 8, 109,39 мкл 1х PBS в течение 30 мин при 45 ° С, затем инактивируют добавлением PK 8 мкл загрузочного буфера и инкубации образцов при 95 ° С в течение 5 мин. Загружают образцы на 12% SDS-PAGE гель, électrophorèse и передачи в Immobilon PVDF мембрану и блок с 5% обезжиренным молоком в 0,2% Твин 20 в ЗФР в течение 1 часа при комнатной температуре. Затем зонд с Bar224 анти-PRP моноклонального антитела, конъюгированного с пероксидазой хрена, разведенного в Суперблок, в течение 1 часа при комнатной температуре. Промыть мембрану в течение 1 часа с PBS-0.2% Tween 20. Для визуализации, инкубировать вестерн-блот 5 мин с хемилюминесцентной подложки и изображения на G-коробки системы гель документации.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Процедуры, используемые продемонстрировать, что пищеварительная система ворон не исключает PrP Res инфективность 4 часа после перорального зонда скрепи гомогената мозга 7. Все двадцать вороны, которые были через желудочный зонд с PrP Res материала впоследствии передается PrP Res материал через фекалии мышам. Больные мыши были определены проявления клинических мыши-скрепи знаков и подтверждение болезнь была завершена Вестерн-блоттинга.
Исследование временем удерживания материала попадает на ворон показал время прохождения через пищеварительный тракт через желудочный зонд для ворон, чтобы быть 4 ч, основанные на присутствии красителя в кале (рис. 1). Все фекалии собирают с одноразовые пипетки и объединяли для каждого ворона (рис. 2). Острая токсичность из необработанных ворона калом произошло, когда сырье фекально супернатант вводят IP в тестовые мышей пилотных. Рассматривая фекальный прививку с пенициллином и Streptomycin, УФ-свет, и ультразвуком мы облегчены эту проблему.
Все мыши, привитые или скрепи-инфицированных мозга мыши (9/9) или кале от скрепи прививку ворон (66 * / 84) разработаны клинические признаки и дали положительный результат на вестерн-блоттинга (рис. 3), что свидетельствует, что скрепи легко проходит через Пищеварительная система ворон и вызванного болезнью. * Восемнадцать мыши умерли в течение 3 дней прививки, вероятно, из-за токсичности. Все, кроме одного (1/23) скрепи отрицательный инокулированных мышей были отрицательными с помощью Вестерн-блот-анализа. Мы предполагаем, что эта мышь была случайно засевают скрепи-инфицированных ворона кала вместо фекалий от скрепи-отрицательных ворона.
Рисунок 1. Ворона вручную сдержан и в устной форме через желудочный зонд с 5 мл цельного яйца, смешанные с синим красителем (а) и бLUE / зеленый окрашенных фекалий 4 ч после введения через зонд (B). Нажмите здесь, чтобы увеличить изображение .
Рисунок 2. Crow фекалии коллекция с пипетки до гомогенизации. Нажмите здесь, чтобы увеличить изображение .
Рисунок 3. . Представитель СДС-Page Вестерн-блот мышиного мозга от биопроб НБВ-нормальный гомогенат мозга мыши, скрепи-отрицательных, Техас клетка 4 - мозг от мыши инокулированного фекалий от скрепи-засевают ворона. С (+) и Withouт (-). PK (протеиназы К) пищеварение Нажмите здесь, чтобы увеличить изображение .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Мы демонстрируем процедуру документирования прохождения PrP Res материала через пищеварительную систему ворон. Мы использовали традиционные методы, чтобы определить, вороны имеют возможность перемещать PrP Res материал безрецидивному географических районах. Другие оценили сопротивление PrP Res жвачным 19-21 и грызунов 22,23 пищеварительные жидкости, оба из которых не в состоянии устранить его. Будущее применение этих методов должны быть применены к другим хищников 24, поскольку они могут также потенциально столкнуться PrP Res материал в падали и транспортировать этот материал через пейзаж облегчающей распространение прионами.
Мы добавили синий пищевой краситель в наш яичница "псевдо мозг" материала, что обеспечивает простой способ оценки примерное время прохождения усредненной мозга мыши через пищеварительный тракт ворон. Мы советуем другим учитывая эту технику, чтобы первые модулиPECT существующий кала цвет исследования животных, а затем использовать пищевой краситель, который является наиболее контрастными. Это позволит легко идентифицировать пищевой краситель цветного материала, который прошел через исследования животных. Мы решили использовать пищевые красители оценить время прохождения, но другие использовали флуоресцентный пигмент 25, оксид железа 26, цветные пластиковые маркеры 27, и цветные металлические хлопья (т.е. блеск) 28.
Сведение к минимуму угрозы вторичного микробного заражения от ворона калом и правильно прививки мышей являются ключевыми отправными точками для мыши-прионных исследований, которые требуют длительных периодов инкубации. Если любой из этих соображений, нарушены, ранняя смертность мыши, вероятно, приведет.
Другим возможным инструментом для исследования является последовательный белок неправильного сворачивания циклической амплификации или sPMCA оценить ворона фекальные образцы в течение долгого времени, чтобы установить, как долго после устных затравки вороны пройти инфекционного материала, сиз необходимости биоанализа мыши. Последние достижения в области PMCA анализа кала на Pulford, и др.. Показывают, что усиление минутных уровней прионы могут быть обнаружены в фекалиях млекопитающих 29, предполагая, PMCA также может быть полезным инструментом для оценки птичьего кала. Биологический мыши и sPMCA подход может быть использован для оценки остаточного инфекционность в кале ворон которым вводили УХО-инфицированных материала. Cervidized трансгенной линии мышей потребуется и внутримозговое против внутрибрюшинного заражения даст более быстрые результаты.
Птичий мусорщики, такие как вороны, стервятники, и орлов, могут играть определенную роль в распространении TSE заболеваний, а именно УХО в Северной Америке. Эти виды могут потреблять УХО-положительных ткани от больных туш или внутренностей (в случае охотников-убил оленевых) и перемещать инфекционного материала в их фекалиях в УХО районы, свободные или популяций оленевых. Как показывает практика кормления зерно оленевых, в дикой природе или в неволеНастройки, привлекает ворон, которые могут испражняться на источник пищи и быть случайно потребляемых оленевых, таким образом, является практика высокого риска (Vercauteren личное наблюдение). Кроме того, хотя шансы на УХО без животных сталкиваются PrP Res материала через осаждения случайной кала может быть низким, области, где вороны и, таким образом, их фекалии сосредоточены, как показано ниже коммунального сайтов ночевок, может стать районах повышенного риска передачи заболевания, так как прионы так стойкостью в окружающей среде 30,31.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Acknowledgments
Мы хотели бы поблагодарить С. Вернер за предоставление ворон, используемые в этом исследовании и USDA, APHIS, WS, NWRC персонал по уходу за животными для ухода за животными и мониторинга. Упоминание или использование продукта не подразумевает USDA одобрение. Финансирование данного исследования была предоставлена USDA, APHIS, ветеринарных служб.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RML Chandler strain mouse-adapted scrapie | Rocky Mountain Laboratories | ||
| RC57BL/6 mice | Hilltop Lab Animals | ||
| American crows | wild captured | ||
| Pen/Strep | Invitrogen | 15140-122 | |
| Phosphate buffered Saline | Invitrogen | 70011-044 | |
| Sonicator | Misonix | ||
| Proteinase-K solution | Roche | 3115887001 | |
| Loading buffer | Invitrogen | NP0007 and 0009 | |
| Bis-tris SDS PAGE 12% gel | Invitrogen | NP0342 | |
| Immobilon PVDF membrane | Millipore | 1SEQ00010 | |
| Tween 20 | Sigma Aldrich | P2287 | |
| Bullet blender homogenizer | Braintree Scientific | BBX24B | |
| 2.3 mm Zirconia/silica beads | BioSpec Products | 11079125Z | |
| Bar224 anti-PrP monoclonal antibody | Cayman Chemical | 10009035 | |
| Superblock | Thermo Scientific | 37517 | |
| chemiluminescent substrate | Millipore | WBKLS0500 | |
| G-box gel documentation system | Syngene |
References
- Prusiner, S. B. Novel proteinaceous infectious particles cause scrapie. Science. 216 (4542), 136-144 (1982).
- Miller, M. W., Williams, E. S., et al. Epizootiology of chronic wasting disease in free-ranging cervids in Colorado and Wyoming. Journal of Wildlife Diseases. 36 (4), 676-690 (2000).
- Miller, M. W., Williams, E. S. Horizontal prion transmission in mule deer. Nature. 425 (6953), 35-36 (2003).
- Sigurdson, C. J., Adriano, A.
- Miller, M. W., Williams, E. S., Hobbs, N. T., Wolfe, L. L. Environmental sources of prion transmission in mule deer. Emerging Infectious Diseases. 10 (6), 1003-1006 (2004).
- Mathiason, C. K., Hays, S. A., et al. Infectious prions in pre-clinical deer and transmission of chronic wasting disease solely by environmental exposure. PLoS ONE. 4 (6), e5916 (2009).
- VerCauteren, K. C., Pilon, J. L., Nash, P. B., Phillips, G. E., Fischer, J. W. Prion remains infectious after passage through digestive system of American crows (Corvus crachyrhunchos). PLoS ONE. 7 (10), e45774 (2012).
- Imran, M., Mahmood, S. An overview of animal prion diseases. Virology Journal. 8 (493), (2011).
- Watts, J. C., Balachandran, A., Westaway, D. The expanding universe of prion disease. PLoS PATHOGENS. 2 (3), e26 (2006).
- Bruce, M. E., et al. Transmissions to mice indicate that 'new variant' CJD is caused by the BSE agent. Nature. 389 (6650), 498-501 (1997).
- Ryder, S., Dexter, G., Bellworty, S., Tongue, S. Demonstration of lateral transmission of scrapie between sheep kept under natural conditions using lymphoid tissue biopsy. Research in Veterinary Science. 76 (2004), 211-217 (2004).
- Collinge, J.
- Beringue, V., Vilotte, J. L., Laude, H. Prion agent diversity and species barrier. Veterinary Research. 39 (47), (2008).
- Harrington, R. D., Baszler, T., et al. A species barrier limits transmission of chronic wasting disease to mink (Mustela vison). The Journal of General Virology. 89 (4), 1086-1096 (2008).
- Wisniewski, H. M., Sigurdarson, S., Rubenstein, R., Kascsak, R. J., Carp, R. I. Mites as vectors for scrapie. Lancet. 347 (9008), 1114 (1996).
- Post, K., Riesner, D., Walldorf, V., Mehlhorn, H. Fly larvae and pupae as vectors for scrapie. Lancet. 354 (9194), 1969-1970 (1999).
- Matthews, D., Cooke, B. C. The potential for transmissible spongiform encephalopathies in non-ruminant livestock and fish. Revue Scientifique Et Technique-Office International Des Epizooties. 22 (1), 283-296 (2003).
- Jennelle, C. S., Samuel, M. D., Nolden, C. A., Berkley EA, Deer carcass decomposition and potential scavenger exposure to chronic wasting disease. Journal of Wildlife Management. 73 (5), 655-662 (2009).
- Scherbel, C., Pichner, R., et al. Degradation of scrapie associated prion protein (PrPSc) by the gastrointestinal microbiota of cattle. Veterinary Research. 37 (5), 695-703 (2006).
- Jeffrey, M., Gonzaález, L., et al. Transportation of prion protein across the intestinal mucosa of scrapie susceptible and scrapie-resistant sheep. Journal of Pathology. 209 (1), 4-14 (2006).
- Nicholson, E. M., Richt, J. A., Rasmussen, M. A., Hamir, A. N., Lebepe-Mazur, S., Horst, R. L. Exposure of sheep scrapie brain homogenate to rumen-simulating conditions does not result in a reduction of PrP(Sc) levels. Letters in Applied Microbiology. 44 (6), 631-636 (2007).
- Motes C, M. aluquerde, Grassi, J., et al. Excretion of BSE and scrapie prions in stools from murine models. Veterinary Microbiology. 131 (1-2), 205-211 (2008).
- Kruger, D., Thomzig, A., Lenz, G., Kampf, K., McBride, P., Beekes, M. Faecal shedding, alimentary clearance and intestinal spread of prions in hamsters fed with scrapie. Veterinary Research. 40 (1), 4 (2009).
- Mathiason, C. K., Nalls, A. V., et al. Susceptibility of domestic cats to chronic wasting disease. Journal of Virology. 87 (4), 1947-1956 (2013).
- Bjorndal, K. A. Flexibility of digestive responses in two generalist herbivores, the tortoises Geochelone carbonaria and Geochelone denticulate. Oecologia. 78 (3), 317-321 (1989).
- Clark, R. G., Gentle, G. C. Estimates of grain passage time in captive mallards. Canadian Journal of Zoology. 68 (11), 2275-2279 (1990).
- Dierenfeld, E. S., Koontz, F. W. Feed intake, digestion and passage of proboscis monkey (Nasalis larvatus) in captivity. Primates. 33 (3), 399-405 (1992).
- Thompson, A. K., Samuel, M. D., Van Deelen, T. R. Alternative feeding strategies and potential disease transmission in Wisconsin white-tailed deer. Journal of Wildlife Management. 72 (2), 416-421 (2008).
- Pulford, B., Spraker, T. A., et al. Detection of PrPCWD in feces from naturally exposed Rocky Mountain elk (Cervus elaphus nelsoni) using protein misfolding cyclic amplification. Journal of Wildlife Diseases. 48 (2), 425-433 (2012).
- Hicks, R. E. Guano deposition in an Oklahoma crow roost. Condor. 81 (3), 247-250 (1979).
- Aldous, S. E.
