נהלים לזיהוי פריוני זיהומיות לאחר המעבר דרך מערכת העיכול של מינים עופות

Summary

יש אוכלי נבלות פוטנציאל translocate פריונים ספגו מוח העברה זיהומיות בצואה שלהם לאזורים ללא מחלה. שלנו שיטות פירוט משמשות כדי לקבוע אם פריונים מרוסקים מותאמים עכבר יישארו זיהומיות לאחר מעבר למרות שמערכת העיכול של עורבים אמריקאים (brachyrhynchos Corvus), הצריכה נפוצה של בעלי חיים מתים.

Abstract

חומר פריון זיהומיות (PRP ^{מיל ')} סביר להניח הגורם לאנצפלופתיה הקטלנית, ניווניות העברה ספג מחלות (TSE) ^1. העברת מחלות TSE, כגון מחלה כרונית לבזבז (CWD), חזקה כי מבעלי החיים לבעלי החיים ^2,3, כמו גם ממקורות סביבתיים ^4-6. יש אוכלי נבלות וטורפים פוטנציאליים לtranslocate חומרי PRP ^Res באמצעות הצריכה והפרשה של נבלות מזוהמת CWD. מחקר שנערך לאחרונה תעד מעבר של חומר PRP ^Res דרך מערכת העיכול של עורבים אמריקאים (brachyrhynchos Corvus), נבלות בצפון אמריקה נפוצות ^7.

אנו מתארים נהלים המשמשים לתיעוד מעבר של חומר PRP ^Res דרך עורבים אמריקאי. עורבי gavaged עם מרוסק מותאם עכבר RML מתח והצואה שלהם נאספו 4 ההודעה hr gavage. צואה עורב אז היו נקווית והזריקה לתוך intraperitoneallyעכברי C57BL / 6. עכברים היו במעקב יומי עד שהם באים לידי ביטוי סימנים קליניים של מרוסק של עכבר והיו מורדמים לאחר מכן. עכברים ללא תסמינים היו במעקב עד הודעה 365 ימי חיסון. ניתוח כתם מערבי נערך כדי לאשר את מצב מחלה. תוצאות הראה כי פריונים יישארו זיהומיות לאחר שנסעו דרך מערכת העיכול של עורבים ונמצאים בצואה, גרימת מחלה בעכברי מבחן.

Introduction

"ספגות מוח מדבק (TSE) הם הפרעות קטלניות זיהומיות ניווניות המשפיעות על חיות הבר, חיות בית, ובני אדם. הגורם המדבק של מחלות TSE נראה isoforms misfolded או פתוגניים (PRP ^Res) של חלבוני פריון ^1. מחלות בעלי החיים TSE כוללות מחלה ממארת כרונית (CWD) בפרד צבי (hemionus Odocoileus), צבי לבן זנב (virginianus Odocoileus), איילים (elaphus Cervus), ואייל (alces Alces); מרוסק בכבשים ועזים; ספג מוח ( BSE) בבקר; אנצפלופתיה מינק העברה במינק Farmed; ספג מוח של חתולים בחתולים; ספגתי מוח פרסה אקזוטי בגן החיות אקזוטיות מעלה גירה ממשפחת Bovidae; וספג מוח בפרימטים לא אנושיים ^8. המחלה אחת האדם TSE, מחלת קרויצפלד יקוב וריאנט, היא נדירה וחשבו שיירכשו על ידי צריכת PRP ^Res-contaminאוכל ated ^9. באופן דומה, BSE יכול להדביק בני אדם, אם בשר מזוהם הוא נצרך ^10. מבינים כל מחלות TSE, מרוסק וCWD הם שני עם מגיפות עצמית לקיום ומקורות לזיהום רק הונחו כמבעלי חיים לבעלי חי ^2,3,11 כמו גם ממקורות סביבתיים ^4-6. המחקר מצביע על כך שרוב המחלות TSE דורשות תקופות דגירה ממושכות בולטות מאירועי חשיפה טבעיים של חומר PRP ^Res לביטוי של סימנים קליניים ^2-4,6,8 ומחסומי מינים לכאורה למזער, אבל לא לחסל את הפוטנציאל, שידור interspecies ^12-14 .

זיהוי מנגנונים להתפשטות פריון זיהומיות חומרים (PRP ^{מיל ')} הוא חשוב ביותר עבור מתן תשובות לשאלות על איך מחלות TSE נעו על פני השטח. חקירות ניסיוניות הראו כי חרקי ^15,16, עופות וחזירים ^17, ועורבים אמריקאים (נוי Corvushyrhynchos) ^7,18 הם נשאים או מפזרים פסיביים של חומר PRP ^Res. לאחרונה מעבר של חומר PRP ^Res דרך מערכת העיכול של עורבים תועד, הוכיח את התפקיד שהם עשויים לשחק בפיזור של מחלות TSE ^7. תוצאות אלו להפוך אותו מתקבלות על הדעת שעורבים, נבלות, יכולים להיתקל, לצרוך, ולהעביר את חומר זיהומיות באמצעות תצהיר צואה, לאזורים ללא מחלה.

הנהלים אנו מדגימים כאן שימשו לתיעוד מעבר של חומר PRP ^Res דרך מערכת העיכול של עורבים ויקלו על היישום של שיטות אלה לנבלות אחרות ודגמי טורף מינים ספציפיים במחקר עתידי הקשורים באופן משמעותי. במחקר זה שיטות קונבנציונליות נעשו שימוש כדי לחקור את אמצעים בלתי שגרתיים של סחר בחומרי PRP ^מיל, אשר יכול לתרום להתפשטות והניטל הכולל של חומר PRP ^Res.

Protocol

הפרוטוקול שלנו מותאם מאחד שפרסמנו בעבר ^7. כל ההליכים כרוכים בבעלי חיים אושרו על ידי הוועדה המוסדית טיפול בבעלי חיים ושימוש בארצות הברית מחלקת החקלאות (USDA), בעלי החיים וצמחי בריאות פיקוח השירות (כנימות), שירותים בטבע (WS), National Wildlife מרכז המחקר (NWRC).

1. העורב Gavaging

1. הערכת זמן מעבר של 'חומר המוח פסאודו' דרך מערכת העיכול של עורבים אמריקאים.
   1. מערבבים 5 מיליליטר של מבושל ומקושקשים ביצה שלמה עם צבע כחול ועורב gavage 1 באמצעות 2 במחט gavage (איור 1).
   2. בדוק עורב כל 30 דקות עד צואה כחולה / מוכתם ירוקה הן כבר לא מופרשת.
2. השג C57BL / 6 מוח עכבר RML (זן צ'נדלר) נגוע נגוע וחולה במחלה סופנית.
3. צור 20% wt / כרך רגיל וhomogenate עכבר המוח הנגוע בhomogenizer בלנדר כדור עם 1xפוספט שנאגרו מלוח (PBS) וחרוזי זכוכית, אז צנטריפוגות ב3,000 XG דקות 1 כדי להסיר חומר חלקיקים גדול יותר. הסר supernatant ולדלל עם נפח שווה של 1x PBS ליצור 10% wt / כרך ב PBS סטרילית. להקפיא ב -80 ° C עד צורך.
4. 17 שעה לפני gavage להסיר מזון, אך לא מים, מעטים עורב.
5. באופן אקראי להקצות עורבים לקבוצות טיפול ובעל פה gavage כל עורב עם 5 מיליליטר של homogenate מוח עכבר הנורמלי או נגוע באמצעות 2 במחט gavage.
6. העברה עורבת בכלובים בודדים ולאסוף וברכה כל הצואה בתוך כל כלוב למשך 4 שעות לאחר gavage (איור 2).
7. Homogenize צואה נקוותה עבור כל עורב בhomogenizer בלנדר כדור עם חרוזי זכוכית עד שמרקם אחיד מושגת. * צואה העורב הן בעיקר נוזלית ויכולה להיות מעורבת בקלות.
8. לכל עורב, לדלל 500 μl של homogenate צואה ל9.5 מיליליטר 1x PBS להיקף כולל של 10 מיליליטר.
9. צנטריפוגה homogena הצואהטה ל15 דקות ב 1,400 XG ולחלץ את supernatant.
10. כדי למזער את האיום של זיהום מיקרוביאלי המשני, טיפול supernatant עם 1 μl של 100 יחידות / מיליליטר פניצילין ו100 מיקרוגרם / מיליליטר סטרפטומיצין (Invitrogen, ניו יורק) לשל homogenate 100 μl ואז למקם תחת אור UV בטמפרטורת חדר למשך 20 דקות כדי להפחית את סיכון לזיהום נגיפי וחיידקיים. לאחר חשיפה לקרינת UV, דגימות sonicate בsonicator מגה פיקסל 3000 בהגדרת 70 ל30 שניות כדי לשבש את הקרום של כל חיידקים שנותרו.

2. עכבר הרכבת חיסון

1. באופן אקראי להקצות עכברים לקבוצות לאחר הטיפול (טבלת 1):
   1. קבוצת 1 - עכברי טיפול חיוביים מחוסן intraperitoneally (IP) עם 1 מיליליטר של homogenate צואה מעורב פה gavaged עם המוח של עכבר 5 מ"ל נגוע.
   2. קבוצת 2 - עכברי טיפול שלילי מחוסן IP עם 1 מיליליטר של homogenate צואה מעורב פה gavaged עם מוח עכבר רגיל 5 מ"ל.
   3. לדלל infectehomogenate ד והנורמלי במוח עכבר לקבוצות 3 ו -4 ל1:100 w / v ב 1x PBS.
   4. קבוצה 3 - עכברי ביקורת חיוביים מחוסנת IP עם 1 מיליליטר של homogenate עכבר המוח הנגוע.
   5. קבוצת 4 - עכברי בקרה שלילית מחוסן IP עם 1 מיליליטר של homogenate עכבר המוח הנורמלי.

	קבוצת הטיפול	מספר בעלי חיים
קבוצת 1	צואה + העורב סקרייפי	100
קבוצה 2	סקרייפי - עורב צואה	25
קבוצה 3	מוח סקרייפי + עכבר	10
קבוצה 4	סקרייפי - מוח העכבר	5

. טבלת 1 מעמד סקרייפי של הבידוד (+ חיובי, שלילי -) ומספר בעלי החיים המשמשים ^7.

2. Intraperitoneally לחסן עכבר:
   1. עורף עכבר על ידי פרווה צוואר גב עם אגודל ואצבע מורה וסובב בעדינות לחשוף את הצד הגחוני.
   2. לרומם את הקצה אחורי של עכבר כך שהראש הוא מעט נמוך יותר.
   3. הכנס 25 מחט G 1 סנטימטר דרך עור, רוחב 1 סנטימטר של קו האמצע, ו 1-2 סנטימטר קדמי למפרק הע"כ באמצעות מזרק נעילת מחט.
   4. הזרק 1 מיליליטר לחסן לאט לתוך חלל גוף עכבר.

3. ניטור עכבר

1. לפקח על עכברים יומיים עד שהם מביעים את הסימנים קליניים של scrapie עכבר. סימנים קליניים יכולים לכלול: קיפוזיס, אטקסיה, זנב קשיח, חוסר הטיפוח, רזון, ועייפות.
2. ציון עכברים עבור כל אחד מ6 הסימנים הקליניים כאשר סימנים נראים לעין הם מאליו, שבו 0 = לא נראה לעין, 1 = בינונית, ו -2 = חמורים.
3. להרדים עכברים כאשר ציונים יומיים הכולל עבור כל סימן להגיע ≥ 8 ליום 1, ≥ 6 ברציפות במשך 3 ימים, או ב365 ימים שלאחר החיסון (dpi).
4. מוח קציר euthan מייד לאחראסיה ולאחסן ב -70 ° C.
5. כדי לאשר את האבחנה מרוסקת, לעכל דגימות מוח עם 3 μl של 50 מיקרוגרם / מיליליטר של תמיסת proteinase-K (PK) בדילול כדלקמן: 3.1. μl PK, 12.5 μl של 500 mM EDTA, pH 8, 109.39 μl של 1x PBS במשך 30 דקות על 45 מעלות צלזיוס, ולאחר מכן להשבית PK ידי הוספת 8 חיץ טעינת μl ודוגרי דגימות ב 95 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות. דגימות עומס על 12% ג'ל SDS-PAGE, Electrophorese והעברה לממברנה Immobilon PVDF ובלוק עם 5% חלב ללא שומן ב0.2% Tween 20 PBS במשך שעה 1 בטמפרטורת חדר. ואז לבחון עם הנוגדן חד שבטי אנטי PRP Bar224 מצומדת לחזרת peroxidase, בדילול מלא בבלוק, במשך שעה 1 בטמפרטורת חדר. יש לשטוף את הממברנה במשך שעה 1 עם PBS-0.2% Tween 20. כדי להמחיש, דגירה דקות כתם 5 מערביות עם מצע chemiluminescent ותמונה על מערכת תיעוד ג'ל G-box.

Representative Results

הנהלים המשמשים להוכיח כי מערכת העיכול של עורבים אינה מבטלת שעה PRP ^Res infectivity 4 לאחר gavage האוראלי של homogenate המוח המרוסק של ^7. כל העורבים עשרים שgavaged עם חומר PRP ^Res לאחר מכן מועברים חומר PRP ^Res באמצעות צואה לעכברים. עכברים חולים זוהו על ידי ביטוי של סימני עכבר מרוסק קליניים ואישור מחלה הושלם על ידי ניתוח כתם מערבי.

חקירה של זמן השמירה של חומר מעובדים על ידי עורבים חשפה זמן מעבר דרך מערכת העיכול לעורב gavaged להיות 4 שעות, המבוססות על הנוכחות של צבע בצואה (איור 1). כל הצואה נאספו עם טפטפות חד פעמית ותקווה לכל עורב (איור 2). רעילות אקוטית מצואה עורב שלא טופלה התרחשה כאשר supernatant צואה גלם שהוזרק לעכברים ה-IP בדיקת טייס. על ידי טיפול בלחסן צואה עם פניצילין וstreptomycin, אור UV, וsonication להקל על בעיה זו.

כל העכברים מחוסן גם עם מוח המרוסק חיובי עכבר (9/9) או צואה מעורבים-מחוסן מרוסקים (66 * / 84) פיתחו סימנים קליניים ונבדקו חיובי על ידי ניתוח כתם מערבי (איור 3), הממחישים מרוסק שעברו בקלות דרך מערכת עיכול של עורבים ומחלות שנגרמו. * שמונה עשר עכברים מתו בתוך 3 ימים מיום החיסון, סביר להניח בשל רעילות. עכברים כולם מלבד אחד (1/23) מרוסקים שלילית מחוסן היו שליליים על ידי ניתוח כתם מערבי. אנו משערים כי בעכבר זה היה מחוסן בשוגג עם צואה מרוסקת חיובית עורב במקום צואה מעורב מרוסק-שלילית.

איור 1. עורב מאופק באופן ידני וgavaged בעל פה עם 5 מיליליטר של ביצה שלמה מעורבב עם צבע כחול (א) ו בlue / מוכתם ירוק צואה 4 ההודעה hr gavage (ב '). לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.

איור 2. אוסף צואה עורב עם פיפטה לפני הומוגניזציה. לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.

איור 3. . כתם נציג Page-SDS המערבי של מוח עכבר ממבדק homogenate מוח עכבר NBH-רגיל, מרוסק שלילית, כלוב TX 4 - מוח מעכבר מחוסן עם צואה מעורבת מחוסן מרוסק. עם (+) וwithout (-). עיכול PK (proteinase K) לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.

Discussion

אנו מדגימים הליך לתעד מעבר של חומר PRP ^Res דרך מערכת העיכול של עורבים. אנחנו השתמשנו בשיטות מקובלות כדי לקבוע אם יש לי עורב היכולת translocate חומרי PRP ^Res לאזורים גיאוגרפיים ללא מחלה. אחרים העריכו התנגדות של PRP ^Res למעלי גירת ^19-21 ומכרסם ^22,23 נוזלי עיכול, אשר שניהם לא הצליחו לחסל אותו. יישום עתידי של שיטות אלו צריכים להיות מוחל על טורפים אחרים ²⁴ כפי שהם יכולים גם פוטנציאל נתקלים בחומרי PRP ^Res בפגרים ולהעביר את החומר הזה על פני הנוף לסייע להתפשטות של מחלות פריון.

הוספנו צבע מאכל כחול לביצה המקושקשת חומר "מוח פסאודו ', שמספק דרך פשוטה להעריך זמן מעבר משוער של מוח עכבר הומוגני דרך מערכת העיכול של עורבים. אנחנו מייעצים לאחרים בהתחשב בטכניקה זו כדי ins הראשוןpect צבע צואה הקיימת של בעלי חיים מחקר ולאחר מכן להשתמש בצבע מאכל שהוא מנוגד ביותר. זה יאפשר זיהוי קל של חומר מוכתם בצבע מזון שעבר דרך בעלי חיים במחקר. אנחנו בחרנו להשתמש בצבע מאכל כדי להעריך זמן מעבר, אבל אחרים השתמשו פיגמנט ניאון ^25, תחמוצת ברזל ^26, סמני פלסטיק צבעוניים ^27, ופתיתים צבעוניות מתכתיות (כלומר נצנצים) ^28.

עכברי מזעור האיום של זיהום מיקרוביאלי המשני מצואה עורב ובצורה נכונה יחסינו הם נקודות המוצא מרכזיות ללימודי עכבר פריון שדורשים תקופות דגירה ארוכות. אם אחד משיקולים אלה מופרים, תמותת עכבר מוקדמת עלולה לגרום.

עוד כלי אפשרי לחקירה הוא חלבון סידורי misfolding הגברה מחזורית או sPMCA להעריך דגימות צואה עורב לאורך הזמן להקים כמה זמן אחרי עורבים gavage אוראליים להעביר חומר זיהומיות, עםאת הצורך במבדק עכבר. ההתקדמות שחלה באחרונה בניתוח הצואה PMCA ידי Pulford, et al. עולה כי הגברה של רמות דקה של פריונים ניתן לאתרם בצואת יונק ^29, דבר המצביע PMCA עשוי גם להיות כלי שימושי להערכת צואת עופות. מבדק העכבר וגישת sPMCA יכולים לשמש כדי להעריך infectivity שייר בצואה של העורבים gavaged עם חומר נגוע CWD. קו עכבר מהונדס cervidized יידרש ותוך מוחי לעומת חיסון intraperitoneal היה נותן תוצאות מהירים יותר.

אוכלי נבלות עופות, כגון עורב, נשרים ועיטים, יכולים לשחק תפקיד בהתפשטות המחלות TSE, כלומר CWD בצפון אמריקה. מינים אלה יכולים לצרוך רקמת CWD חיובי מפגרים או קרביים חולים (במקרה של cervids-נהרג צייד) וtranslocate חומר זיהומיות בצואה שלהם לאזורים נטולי CWD או אוכלוסיות של cervids. כמנהג של האכלת תבואה לcervids, בטבע או בשביהגדרות, מושך אל עורבים שיכולים לעשות את צורך על מקור המזון ולצרוך בשוגג על ידי cervids, היא אפוא בפועל בסיכון גבוה (תצפית אישית VerCauteren). יתר על כן, אם כי סיכוייהם של בעלי החיים ללא CWD נתקלים בחומרי PRP ^Res באמצעות תצהיר צואה אקראי עשויים להיות נמוכים, אזורים בהם עורבים ולכן הצואה שלהם מרוכזים, כמו מתחת לאתרי קינון קהילתיים, עלולים להפוך לאזורים בעלי סיכון גבוה להעברת מחלה מאז פריונים כל כך עיקשים בסביבה ^30,31.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
RML Chandler strain mouse-adapted scrapie	Rocky Mountain Laboratories
RC57BL/6 mice	Hilltop Lab Animals
American crows	wild captured
Pen/Strep	Invitrogen	15140-122
Phosphate buffered Saline	Invitrogen	70011-044
Sonicator	Misonix
Proteinase-K solution	Roche	3115887001
Loading buffer	Invitrogen	NP0007 and 0009
Bis-tris SDS PAGE 12% gel	Invitrogen	NP0342
Immobilon PVDF membrane	Millipore	1SEQ00010
Tween 20	Sigma Aldrich	P2287
Bullet blender homogenizer	Braintree Scientific	BBX24B
2.3 mm Zirconia/silica beads	BioSpec Products	11079125Z
Bar224 anti-PrP monoclonal antibody	Cayman Chemical	10009035
Superblock	Thermo Scientific	37517
chemiluminescent substrate	Millipore	WBKLS0500
G-box gel documentation system	Syngene