Summary
Los carroñeros tienen potencial para trasladar infecciosas priones de encefalopatía espongiforme transmisible en sus heces a las zonas libres de la enfermedad. Nos detalle los métodos utilizados para determinar si priones de scrapie adaptados-ratón permanecen infecciosa después del paso a través del tracto digestivo de cuervos americanos (Corvus brachyrhynchos), un consumidor común de animales muertos.
Abstract
Priónica infecciosa (PrP Res) material es probablemente la causa de la fatal neurodegenerativa encefalopatía espongiforme transmisible (EET) enfermedades 1. La transmisión de las EET, como la caquexia crónica (CWD), se presume que es de un animal a 2,3, así como de fuentes ambientales 4-6. Los carroñeros y carnívoros tienen potencial para trasladar material de PrP Res a través del consumo y la excreción de carroña CWD-contaminada. Trabajos recientes han documentado el paso de material PrP Res a través del sistema digestivo de los cuervos americanos (Corvus brachyrhynchos), un carroñero norteamericano común 7.
Se describen los procedimientos utilizados para documentar el paso de material PrP Res través de cuervos americanos. Cuervos fueron alimentadas por sonda con RML-tembladera cepa adaptada a ratón y sus heces se recogieron 4 h después de alimentación forzada. Crow heces fueron reunidas después y se inyectaron por vía intraperitoneal enC57BL / 6 ratones. Los ratones fueron controlados diariamente hasta que expresaron los signos clínicos de la tembladera de ratón y se sacrificaron a partir de entonces. Ratones asintomáticos fueron monitoreados hasta 365 días después de la inoculación. Se realizó un análisis de Western blot para confirmar el estado de la enfermedad. Los resultados revelaron que los priones infecciosos permanecen después de viajar a través del sistema digestivo de cuervos y están presentes en las heces, causante de la enfermedad en los ratones de prueba.
Introduction
Las encefalopatías espongiformes transmisibles (EET) son enfermedades infecciosas mortales neurodegenerativas que afectan a la vida silvestre, los animales domésticos y los seres humanos. El agente infeccioso de las EET parece ser isoformas mal plegadas o patógenos (PrP Res) de proteínas priónicas 1. Las EET animales incluyen la caquexia crónica (CWD) en el venado bura (Odocoileus hemionus), el venado cola blanca (Odocoileus virginianus), el alce (Cervus elaphus), y el alce (Alces alces), la tembladera en ovinos y caprinos; encefalopatía espongiforme bovina ( EEB) en bovinos domésticos; encefalopatía transmisible del visón en el visón de criadero; encefalopatía espongiforme felina en gatos; exótica encefalopatía espongiforme de ungulados exóticos en zoológico rumia de la familia de los bóvidos, y la encefalopatía espongiforme en los primates no humanos 8. La enfermedad TSE humano único, la enfermedad de Creutzfeldt-Jakob variante, es raro y pensado para ser adquirida por el consumo de PrP Res-contamialimentos ATED 9. Del mismo modo, la EEB puede infectar a los seres humanos si carne contaminada se consume 10. De todas las enfermedades EET, la tembladera y la caquexia crónica son los dos únicos con las epidemias y las fuentes de infección autosostenibles se supone que son de un animal a 2,3,11, así como de fuentes ambientales 4-6. La investigación sugiere que la mayoría de las EET requieren períodos de incubación prolongados notables de eventos de exposición naturales de materiales PrP Res a la manifestación de signos clínicos 2-4,6,8 y barreras de las especies aparentes minimizar, pero no eliminan la posibilidad de que, la transmisión entre 12-14 .
Identificar mecanismos para la difusión de la (PrP Res) Material prión infeccioso es extremadamente importante para responder a las preguntas acerca de cómo las EET se mueven a través del paisaje. Las investigaciones experimentales han sugerido que los insectos 15,16, aves de corral y cerdos 17, y cuervos americanos (Corvus brachyrhynchos) 7,18 son portadores pasivos o dispersores de material PrP Res. La aprobación de material de PrP Res a través del sistema digestivo de los cuervos se ha documentado recientemente, lo que demuestra el papel que pueden desempeñar en la dispersión de las EET 7. Estos resultados hacen que sea posible que los cuervos, un carroñero, podrían encontrar, consumen, y transportan material infeccioso a través de las heces de depósito, a las zonas libres de la enfermedad.
Los procedimientos demostramos aquí se utilizan para documentar el paso de material PrP Res a través del sistema de digestión de los cuervos y facilitará en gran medida la aplicación de estos métodos para otro carroñero y modelos específicos de especies de carnívoros en futuras investigaciones relacionadas. En este estudio se utilizaron métodos convencionales para investigar un medio no convencional de la trata de material PrP Res, que podría contribuir a la difusión y la carga total de material de PrP Res.
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Protocol
Nuestro protocolo es una adaptación de una publicamos previamente 7. Todos los procedimientos con animales fueron aprobados por el Comité del Departamento de Agricultura de EE.UU. (USDA), Servicio de Inspección de Sanidad Agropecuaria (APHIS), Wildlife Services (WS), Centro Nacional de Investigación de la Vida Silvestre (CNRH) Cuidado de Animales institucional y el uso.
1. Crow gavaging
- Estimar el tiempo de paso de la "materia cerebral seudo 'a través del tracto digestivo de los cuervos americanos.
- Mezclar 5 ml de cocido y revueltos huevo entero con el tinte azul y sonda nasogástrica 1 cuervo usando un 2 en aguja de sonda (Figura 1).
- Compruebe cuervo cada 30 minutos hasta que las heces de color azul / verde manchado ya no se excreta.
- Obtener infectados por RML (cepa Chandler) C57BL / 6 cerebros infectados y enfermos terminales de ratón.
- Generar un 20% en peso / volumen normal y infectada homogeneizado de cerebro de ratón en un homogeneizador mezclador bala con 1xtampón fosfato salino (PBS) y cuentas de vidrio, luego se centrifuga a 3000 × g durante 1 min para eliminar las partículas más grandes. Eliminar el sobrenadante y diluir con un volumen igual de PBS 1x para generar un 10% en peso / vol, en PBS estéril. Congelación a -80 ° C hasta que se necesite.
- 17 horas antes de la alimentación forzada a eliminar la comida, pero no el agua, a partir de plumas de gallo.
- Aleatoriamente asignar cuervos a los grupos de tratamiento y alimentación forzada por vía oral cada cuervo con 5 ml de homogeneizado normal o infectado el cerebro de ratón usando un 2 en aguja de sonda.
- Transferencia cante a jaulas individuales y recopilar y poner en común todas las heces dentro de cada jaula de 4 h después de la alimentación por sonda (Figura 2).
- Homogeneizar heces agrupados para cada cuervo en un homogeneizador mezclador bala con perlas de vidrio hasta que se consigue una textura uniforme. * Heces Crow son en su mayoría líquidos y se pueden mezclar fácilmente.
- Para cada cuervo, diluir 500 l de homogenado fecal en 9,5 ml de 1x PBS para un volumen total de 10 ml.
- Centrifugar la homogena fecalTE durante 15 minutos a 1400 xg y extraer el sobrenadante.
- Para reducir al mínimo la amenaza de una infección microbiana secundaria, el tratamiento de sobrenadante con 1 l de 100 unidades / ml de penicilina y 100 mg / ml de estreptomicina (Invitrogen, NY) por cada 100 l de homogeneizado a continuación, colocar bajo luz UV a temperatura ambiente durante 20 min para reducir riesgo de contaminación viral y bacteriana. Después de la exposición UV, las muestras se somete a ultrasonidos en un baño de ultrasonidos 3000 Mp en el ajuste 70 durante 30 segundos para romper la membrana de los microbios restantes.
2. Inoculación de ratones
- Aleatoriamente asignar los ratones a los siguientes grupos de tratamiento (Tabla 1):
- Grupo 1 - ratones de tratamiento positivos inoculados por vía intraperitoneal (IP) con 1 ml de homogenado fecal de cuervos alimentado a la fuerza con 5ml infectados cerebros de ratón.
- Grupo 2 - Negativo ratones en tratamiento inoculados IP con 1 ml de homogenado fecal de cuervos alimentado a la fuerza con 5ml cerebros normales de ratón.
- Diluir infecteD y normal homogeneizado de cerebro de ratón para los Grupos 3 y 4 a 1:100 w / v en PBS 1x.
- Grupo 3 - ratones de control positivos inoculados IP con 1 ml de infectada homogeneizado de cerebro de ratón.
- Grupo 4 - ratones de control negativo inocularon ip con 1 ml de homogenado normal de cerebro de ratón.
| Grupo de Tratamiento | Número de animales | |
| Grupo 1 | Tembladera + Crow heces | 100 |
| Grupo 2 | Tembladera - Crow heces | 25 |
| Grupo 3 | Scrapie + ratón Cerebro | 10 |
| Grupo 4 | Scrapie - Ratón Cerebro | 5 |
. Cuadro 1 Estado de la tembladera de inóculo (+ positivo, negativo -) y el número de animales utilizados 7.
- Intraperitoneal inocular ratón:
- Ratón Scruff por dorsal piel del cuello con el pulgar y el dedo índice y suavemente gire para exponer la parte ventral.
- Eleve extremo posterior del ratón para que la cabeza es ligeramente inferior.
- Inserte la aguja 25 G 1 cm a través de la piel, 1 cm lateral de la línea media, y 1-2 cm por delante de la articulación sacroilíaca utilizando una jeringa con aguja de bloqueo.
- Inyectar 1 ml inocular lentamente en la cavidad del cuerpo del ratón.
3. Monitoreo Ratón
- Monitorear los ratones diariamente hasta que expresan los signos clínicos de la tembladera ratón. Los signos clínicos pueden incluir: cifosis, ataxia, cola rígida, falta de aseo, emaciación y letargo.
- Puntuación ratones para cada uno de los 6 signos clínicos cuando los signos visibles son evidentes, donde 0 = ninguno visible, 1 = moderado, 2 = y severa.
- La eutanasia a los ratones cuando las puntuaciones diarias totales para cada signo alcanzan ≥ 8 por 1 día, ≥ 6 continua durante 3 días, o 365 días después de la inoculación (dpi).
- Cerebros cosecha inmediatamente después euthanasia y almacenar a -70 ° C.
- Para confirmar un diagnóstico de la tembladera, digerir muestras de cerebro con 3 l de un 50 g / ml de solución de proteinasa K (PK) diluidas de la siguiente manera: 3.1. l de PK, 12,5 l de EDTA 500 mM, pH 8, 109.39 l de 1x PBS durante 30 min a 45 ° C, a continuación, inactivar la PK mediante la adición de 8 l de tampón de carga e incubando las muestras a 95 ° C durante 5 min. Cargar las muestras en un gel de SDS-PAGE al 12%, electroforesis y transferencia a membrana Immobilon PVDF y bloque con 5% de leche sin grasa en 0,2% de Tween 20 en PBS durante 1 hora a temperatura ambiente. A continuación, la sonda con Bar224 anticuerpo monoclonal anti-PrP conjugado con peroxidasa de rábano picante, diluida en superbloque, durante 1 hora a temperatura ambiente. Enjuague la membrana durante 1 hora con PBS-Tween 20 al 0,2%. Para visualizar, incubar Western blot 5 min con sustrato quimioluminiscente y la imagen de un sistema de documentación de gel G-box.
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Representative Results
Los procedimientos utilizados demuestran que el sistema digestivo de cuervos no elimina la PrP Res. infectividad 4 horas después de la alimentación forzada oral de homogeneizado de cerebro tembladera 7. Los veinte cuervos que fueron alimentadas por sonda con material de PrP Res transmiten posteriormente el material PrP Res vía heces a los ratones. Ratones enfermos se identificaron por la manifestación de signos-ratón de tembladera clínicos y la confirmación de la enfermedad se completó por análisis de transferencia Western.
Investigación del tiempo de retención de material ingerido por cuervos reveló tiempo de paso a través del tracto digestivo de un cuervo alimentado a la fuerza a ser 4 horas, sobre la base de la presencia de colorante en las heces (Figura 1). Todas las heces se recogieron con pipetas desechables y se agruparon para cada cuervo (Figura 2). Toxicidad aguda de las heces de pájaro no tratados se produjo cuando sobrenadante fecal cruda se inyectó ip a ratones de la prueba piloto. Mediante el tratamiento de inóculo fecal con penicilina y streptomycin, la luz ultravioleta, y sonicación nos alivian este problema.
Todos los ratones inoculados con cualquiera de cerebro con scrapie positivo del ratón (9/9) o heces de cuervos tembladera de inoculado (66 * / 84) desarrollaron signos clínicos y dieron positivo por análisis de Western blot (Figura 3), que ilustra que la tembladera pasado fácilmente a través de la sistema digestivo de los cuervos y la enfermedad causada. * Dieciocho ratones murieron dentro de los 3 días de la inoculación, probablemente debido a la toxicidad. Todos menos uno (1/23) los ratones inoculados con la tembladera negativo fueron negativas por Western blot. Nuestra hipótesis es que este ratón se inoculó inadvertidamente con heces de pájaro tembladera positivo en lugar de las heces de un cuervo-tembladera negativo.
Figura 1. Crow restringido manualmente y alimentado a la fuerza por vía oral con 5 ml de huevo entero mezclado con colorante azul (A) y Blue / heces manchadas de verde a 4 h después de la alimentación por sonda (B). Haga clic aquí para ver la imagen más grande .
Figura 2. De recogida de heces Crow con la pipeta antes de la homogeneización. Haga clic aquí para ver la imagen más grande .
Figura 3. . Representante SDS-PAGE de transferencia Western de cerebro de ratón de bioensayo NBH normal homogeneizado de cerebro de ratón, del prurigo lumbar negativa, TX jaula 4 - el cerebro de un ratón inoculado con heces de un cuervo scrapie inoculadas. Con (+) y without (-). PK (proteinasa K) digestión Haga clic aquí para ver la imagen más grande .
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Discussion
Se demuestra un procedimiento para documentar el paso de material de PrP Res. través del sistema digestivo de cuervos. Se utilizaron los métodos convencionales para determinar si los cuervos tienen la capacidad de trasladar material de PrP Res a las áreas geográficas libres de la enfermedad. Otros han evaluado la resistencia de PrP Res a rumiantes y roedores 19-21 22,23 líquidos digestivos, los cuales no pudieron eliminarlo. Futura aplicación de estas técnicas debe ser aplicado a otros carnívoros 24, ya que podría también, potencialmente, encontrar material PrP Res en carroña y transportar este material a través del paisaje que facilita la propagación de las enfermedades priónicas.
Añadimos colorante azul en nuestro material "pseudo-cerebro 'huevos revueltos, que proporciona una forma sencilla de evaluar el tiempo de paso aproximado de cerebro de ratón homogeneizado a través del tracto digestivo de los cuervos. Aconsejamos a los demás teniendo en cuenta que esta técnica primera insdríamos prever heces existente color de los animales de estudio y luego utilizar colorante de alimentos que es más contrastante. Esto permitirá una fácil identificación de color de los alimentos material marcado que ha pasado a través de los animales de estudio. Hemos elegido utilizar colorante de alimentos para estimar el tiempo de paso, pero otros han utilizado pigmento fluorescente 25, óxido de hierro 26, los marcadores de plástico de colores 27 y escamas metálicas de color (es decir, brillo) 28.
Reducir al mínimo la amenaza de una infección microbiana secundaria de las heces de pájaro y de inoculación correctamente ratones son puntos de partida fundamentales para los estudios del ratón prión que requieren largos períodos de incubación. Si cualquiera de estas consideraciones son violados, la mortalidad temprana ratón es probable que resulte.
Otra de las herramientas posibles para la investigación es la proteína de serie plegamiento amplificación cíclica o sPMCA para evaluar las muestras de heces de pájaro en el tiempo para establecer cuánto tiempo después de cuervos sonda oral pasan material infeccioso, conla necesidad de un bioensayo en ratón. Los recientes avances en EPCP análisis fecal por Pulford, et al. Indican que la amplificación de los niveles de minutos de priones se puede detectar en las heces de mamíferos 29, lo que sugiere EPCP también podría ser una herramienta útil para la evaluación de las heces aviares. El bioensayo del ratón y enfoque sPMCA podrían utilizarse para evaluar la infectividad residual en las heces de cuervos alimentado a la fuerza con el material de la caquexia crónica infectados. Una línea de ratones transgénicos cervidized sería necesaria y intracerebral contra la inoculación intraperitoneal daría resultados más rápidos.
Aves carroñeras, como los cuervos, buitres y águilas, podrían desempeñar un papel en la propagación de las EET, a saber, la caquexia crónica en América del Norte. Estas especies podrían consumir tejido CWD-positivo de canales enfermos o vísceras (en el caso de los cérvidos cazados) y trasladar el material infeccioso en sus heces a las zonas de CWD libre o poblaciones de cérvidos. A medida que la práctica de la alimentación de granos de cérvidos, en el medio silvestre o en cautividadajustes, atrae a los cuervos que puede defecar en la fuente de alimento y ser consumidos inadvertidamente por los cérvidos, es por lo tanto una práctica de alto riesgo (Vercauteren observación personal). Además, aunque las probabilidades de los animales de CWD libre encontrando material de PrP Res través de las heces de depósito aleatorio puede ser baja, las zonas donde se concentran los cuervos y por lo tanto sus heces, como a continuación dormideros comunales, podrían llegar a ser de las zonas de alto riesgo de transmisión de enfermedades desde los priones son tan persistentes en el medio 30,31.
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Disclosures
No hay conflictos de interés declarado.
Acknowledgments
Nos gustaría dar las gracias a S. Werner para la prestación de los cuervos utilizados en este estudio y el USDA, APHIS, WS, NWRC personal de cuidado de los animales para el cuidado de los animales y la vigilancia. Mención o uso de un producto no implica aprobación USDA. Los fondos para este estudio fue proporcionado por la USDA, APHIS, Servicios Veterinarios.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RML Chandler strain mouse-adapted scrapie | Rocky Mountain Laboratories | ||
| RC57BL/6 mice | Hilltop Lab Animals | ||
| American crows | wild captured | ||
| Pen/Strep | Invitrogen | 15140-122 | |
| Phosphate buffered Saline | Invitrogen | 70011-044 | |
| Sonicator | Misonix | ||
| Proteinase-K solution | Roche | 3115887001 | |
| Loading buffer | Invitrogen | NP0007 and 0009 | |
| Bis-tris SDS PAGE 12% gel | Invitrogen | NP0342 | |
| Immobilon PVDF membrane | Millipore | 1SEQ00010 | |
| Tween 20 | Sigma Aldrich | P2287 | |
| Bullet blender homogenizer | Braintree Scientific | BBX24B | |
| 2.3 mm Zirconia/silica beads | BioSpec Products | 11079125Z | |
| Bar224 anti-PrP monoclonal antibody | Cayman Chemical | 10009035 | |
| Superblock | Thermo Scientific | 37517 | |
| chemiluminescent substrate | Millipore | WBKLS0500 | |
| G-box gel documentation system | Syngene |
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