Summary
Vi beskriver brugen af de monoklonale antistoffer TG30 (CD9) og GCTM-2 til kombineret påvisning af celleoverfladeantigener via fluorescensaktiveret cellesortering (FACS) til identifikation og berigelse af levende menneskelige embryonale stamceller (hESC) ved hjælp af positiv udvælgelse og også brugen af negativ udvælgelse til at rense HESC'er fra en blandet cellepopulation.
Abstract
Humane embryonale stamceller (hESC) kan forny sig selv på ubestemt tid in vitro, og med de relevante signaler kan induceres til at differentiere i potentielt alle somatiske celle afstamninger. Differentierede hESC-derivater kan potentielt anvendes i transplantationsbehandlinger til behandling af en række celledegenerative sygdomme. HESC-differentieringsprotokoller giver dog normalt en blanding af differentierede mål- og off-target celletyper samt resterende udifferentierede celler. Til oversættelse af differentierede hESC-derivater fra laboratoriet til klinikken er det vigtigt at kunne skelne mellem udifferentierede (pluripotente) og differentierede celler og generere metoder til at adskille disse populationer. Sikker anvendelse af hESC-afledte somatiske celletyper kan kun opnås med pluripotente stamcellefri populationer, da resterende HESC'er kan fremkalde tumorer kendt som teratomer efter transplantation. Med henblik herpå beskriver vi her en metode til påvisning af pluripotensrelaterede celleoverfladeantigener med de monoklonale antistoffer TG30 (CD9) og GCTM-2 via fluorescensaktiveret cellesortering (FACS) til identifikation af pluripotente TG30Hi-GCTM-2Hi hESCs ved hjælp af positiv udvælgelse. Ved hjælp af negativ udvælgelse med vores TG30/GCTM-2 FACS-metode var vi i stand til at opdage og rense udifferentierede HESC'er i populationer, der gennemgår meget tidlig differentiering (TG30Neg-GCTM-2Neg). I en yderligere undersøgelse, pluripotente stamcelle-fri prøver af differentierede TG30 Neg-GCTM-2Neg celler udvalgt ved hjælp af vores TG30/GCTM-2 FACS protokol ikke danne teratomer gang transplanteret i immun-kompromitteret mus, støtte robusthed af vores protokol. På den anden side påvirkede TG30/GCTM-2 FACS-medieret på hinanden følgende passaging af beriget pluripotente TG30Hi-GCTM-2Hi hESC'er ikke deres evne til selvfornyelse in vitro eller deres iboende pluripotency. Derfor giver kendetegnene ved vores TG30/GCTM-2 FACS-metode en følsom analyse for at opnå højt berigede populationer af hPSC som input til differentieringsanalyser og for at fjerne potentielt tumorigenic (eller resterende) hESC fra afledte cellepopulationer.
Introduction
HPSC (hPSC) omfatter humane embryonale stamceller (hESC) og menneskeskabte pluripotente stamceller (hIPSC). HPSC kan forny sig selv på ubestemt tid under passende kulturforhold uden at miste deres evner kendt som "pluripotency". Pluripotens defineres som potentialet for en celle til at differentiere i det væsentlige enhver somatisk celle afstamning, herunder celler repræsentative for hver af de tre embryonale kimcelle lag. Det bemærkelsesværdige potentiale i hPSC giver et middel til en lang række cellebaserede applikationer, herunder terapeutiske muligheder. For eksempel er der lidelser, der involverer celledød og degeneration, hvor normal funktionalitet af celler i menneskekroppen er kompromitteret, som i hjertesvigt, rygskader, diabetes, Parkinsons sygdom, nogle kræftformer og andre kliniske patologier. Patienter, der lider af disse tilstande, kan potentielt behandles ved at transplantere sunde og funktionelle somatiske celler, der er afledt af hPSC i laboratoriet. De nuværende hPSC-differentieringsprotokoller er imidlertid ikke 100% effektive og giver en blanding af differentierede mål- og off-target celletyper samt resterende hPSC'er, der ikke har gennemgået differentiering, i stedet fortsætter med at fornyselv 1-3. Tilstedeværelsen af selv et lille antal hPSC i en prøve af hPSC-afledte somatiske celler beregnet til transplantation til patienter udgør en alvorlig klinisk risiko, da disse celler ved deres iboende natur til at danne væv af alle tre embryonale kimlag, potentielt kunne danne in vivo en type tumor kendt som en teratoma. Derfor kan kun målcellepopulationer, der er bestemt til at være fri for pluripotente stamceller, betragtes som sikre til transplantation til patienter. Der er flere metoder rapporteret til potentielt at opnå udrensning af resterende HPSCs efter differentiering, (til gennemgang se Polanco og Laslett4). Vi har tidligere rapporteret brugen af de monoklonale antistoffer TG30 (CD9) og GCTM-2 koblet til fluorescens aktiveret cellesortering (FACS) for at identificere pluripotente stamceller og diskriminere dem fra celler, der gennemgår tidlig differentiering i kulturer afhESC-linjer 5-7.
En fordel ved at bruge antistoffer til at detektere celleoverfladeantigener er, at målcellerne normalt er levedygtige efter antistofbinding og/eller mærkning. Derfor kan målceller indsamles efter antistofmærkning og rekultureres til ekspansion og yderligere applikationer før transplantation. En advarsel for celleoverfladeantigener udtrykt på hPSC er, at de ikke er eksklusive i pluripotente fase og i mange tilfælde udtrykkes tidsmæssigt igen under udviklingen og derfor vil blive opdaget i nogle differentierede celletyper. Hvis målet er at anvende antistoffer til at detektere humane pluripotente celler og rense dem fra en prøve af hPSC-afledte celler, bør udvalgte antistoffer derfor ikke også reagere med antigener på de specifikke differentierede celletyper, der er beregnet til transplantation. Desværre er der et begrænset antal antistoffer, der registrerer celleoverflademarkører på live hPSCs 4, hvilket gør begrænsede muligheder for valg. Derudover har nogle få undersøgelser påpeget, at påvisning af en enkelt celleoverflademarkør ikke er tilstrækkelig til at eliminere alle hPSC, hvilket tyder på, at ethvert forsøg på at eliminere alle hPSC pluripotente delpopulationer bør baseres på metoder, der bruger to eller flere antistoffer, der registrerer forskellige epitoper udtrykt af hPSC 9-10. Som nævnt ovenfor er det kun hPSC-afledte celler, der kan bestemmes som pluripotente stamcellefri cellepopulationer, der er egnede til menneskelig transplantation. At nå dette strenghedsniveau opnås muligvis ikke med et enkelt gennemløb gennem en antistofmedieret cellesorteringsteknologi. Rekultur af den berigede population af differentierede målceller og efterfølgende runder af cellesortering kan være påkrævet for definitivt at opnå pluripotente stamcellefri prøver.
I vores laboratorium har vi udførligt karakteriseret to hES celle-overflade antistoffer, TG30 (CD9) og GCTM-2, til påvisning af levende pluripotente celler. Vores undersøgelser har vist, at kombineret detektion af både TG30 og GCTM-2 stærkt korrelerer med udtrykket af kanoniske pluripotency-associerede gener i hESC-linjer 5-7. TG30/GCTM-2 FACS immunoprofiling har konsekvent vist, at hESC kulturer udgør en kvantitativ kontinuerlig gradient af TG30/GCTM-2 udtryk 5-7. Vi har vilkårligt etableret fire populationer (P) af celler inden for denne TG30/GCTM-2 gradient: P4 (TG30Neg-GCTM-2Neg), P5 (TG3 0Lav-GCTM-2Lav),P6 (TG30Mid-GCTM-2Mid) og P7 (TG30Hi-GCTM-2Hi) 5-7. Vores karakteristik af disse P4, P5, P6 og P7 cellepopulationer har vist, at P6 og P7 subfractions udtrykke et stort antal pluripotens-associerede gener og effektivt danne stamcellelignende kolonier, når rekultureret post-FACS 2-3. På den anden side udtrykker P4-celler (TG30Neg-GCTM-2Neg)et stort antal differentieringsmarkører og udgør de spontant differentierede celletyper, der typisk forekommer i ekspanderende kulturer af hESC-linjer 5-6. Vi besluttede at teste potentialet i vores TG30/GCTM-2 FACS for selektiv eliminering af resterende HPSCs efter tidlig differentiering, og også til berigelse af pluripotente stamcellepopulationer. Protokollen beskrevet nedenfor viser, hvordan man indsamler og rekultur differentieret P4 (TG30Neg-GCTM-2Neg)celler post-FACS at opnå udrensning af pluripotente P7 (TG30Hi-GCTM-2Hi). Desuden forklarer vi også indsamling og rekultur af pluripotente P7 -celler (TG30Hi-GCTM-2Hi)for at opnå en beriget kultur af pluripotente celler, som efterfølgende kan bruges som en defineret inputpopulation for potentielt at øge effektiviteten og konsistensen af differentieringsanalyser.
Protocol
Følgende protokol blev udført ved hjælp af hESC-MEL111 standard bulkkulturer leveret af StemCore-anlægget på Monash University (Melbourne). Denne celle linje er rutinemæssigt dyrket på et lag af mitotically inaktiveret mus embryonale fibroblaster (MEFs) i bFGF suppleret hESC / KOSR medier7 og opretholdes med enzymatisk dissociation (Collagenase) hver 5-7 dage8. hESC kulturer dyrket til ~ 80% sammenløb i 75 cm2 (T75) kolber anvendes som input populationer for denne protokol. Alle de cellemanipulationsprocedurer, der er beskrevet nedenfor, skal udføres under aseptiske forhold i et HEPA-filtreret biosikkerhedsskab i klasse II.
To dage før du udfører en TG30/GCTM-2 FACS-analyse, skal du forberede de T75-dyrkningsplader (beskrevet i afsnit 1), der skal bruges til rekultur af celler, der er genvundet efter FACS (beskrevet i afsnit 4).
1. Såning af MEF og forberedelse af MEF-konditioneret medium
1.1 DAG -2: Plating af MEF'er i T75 kolber
- Der afpipetteres 10 ml 0,1% w/v gelatine i hver T75 kolbe, og der vippes jævnt til pelsoverfladen.
- Inkuber i 30 minutter ved stuetemperatur i et biosikkerhedsskab.
- Aspirat gelatineopløsning.
- Kolben tilsættes 20 ml MEF-medium og forekvilibreres til 37 °C/5% CO2 i 30 minutter i en cellekulturinkubator.
- Plader, der er mitotically inaktiverede MEF'er, på tilberedte kolber med følgende tætheder. For 1/3 MEF densitet frø 1,4 x 104 celler/cm2 (T75= 1 x 106 MEFs). For MEF-frø med fuld densitet 5,3 x 104 celler/cm2 (T75 = 4 x 106 MEF'er).
Bemærk: Vi bruger rutinemæssigt MEF'er, der blev mitotically inaktiveret af γ-bestråling. En protokol til udarbejdelse af γ bestrålede MEF'er findes i Michalska12.
- Inkuber bestrålede MEF-kulturer ved 37 °C/5% CO2 natten over. 1/3 kolberne kan inkuberes i 1-4 dage uden MEF-medium ændring. Disse kolber anvendes til replating af post-FACS celler (som i protokol 4). Fuld MEF kolber inkuberes natten over for at generere CM som pr nedenfor i trin 1.2.
1.2 DAG -1: Forberedelse af MEF-konditioneret medium (CM)
- Aspirate MEF-medium fra fuld-MEF T75 kolber.
- Der tilsættes præekvilibreret 25 ml hESC/KOSR-medium suppleret med 5 ng/ml human FGF-2 pr. T75 kolbe. Inkuber ved 37 °C/5% CO2 i 24 timer.
- Mef-konditioneret medium (CM) opsamles i et sterilt vævskulturrør, supplerer CM frisk med 10 ng/ml humant FGF-2 og filtrerer med et 0,22 μm polyethersulfonfilter.
- Hvis du vil producere yderligere CM, skal du gentage trin 1.2.2 og 1.2.3 dagligt på den samme MEF-kultur i en uge.
På dagen for udførelsen af en TG30/GCTM-2-analyse skal MEF-medium udskiftes i 1/3 MEF T75-kolber med CM og præekvilibreres i mindst 30 minutter, inden der sås hESC'er eller hESC-afledte celler, der er genvundet efter proceduren som beskrevet nedenfor. CM anvendes enten frisk eller opbevares ved 4 °C i op til 2 uger. CM bruges i denne protokol som i vores hænder det øger levedygtigheden af cellerne post-FACS i forhold til ikke-fordomsfri medier (resultater ikke vist).
2. Udførelse af en TG30/GCTM-2 FACS Assay: Dissociation af hESC Bulk Cultures i enkeltceller
Bemærk: Prechill 20% FBS/DMEM-F12 medium ved 4 °C.
- Aspirate hESC / KOSR medier fra to T75 kolber med en kultiveret hESC linje.
- Cellerne skylles i hver T75 med 10 ml DPBS og indsugning for at fjerne dem.
- Der tilsættes 3 ml TrypLE Express-dissociationsopløsning i hver T75-kolbe. Inkuber ved 37 °C/5% CO2 i 5 min.
- Bump siden af kolberne for at opnå fuldstændig løsrivelse af cellerne. Tjek under mikroskop. Hvis cellerne ikke let løsner sig, inkuberes i yderligere 2-3 min ved 37 °C/5% CO2.
- Der tilsættes 10 ml 20% FBS/DMEM-F12 (opbevares ved 4 °C) til hver T75-kolbe. Ved hjælp af en steril 10 ml pipette trituratser de dissociated celler flere gange mod kolbevæggen for at opnå en overvejende enkeltcellesuspension.
- Der anbringes en 70 μm cellesien på et sterilt polypropylenrør på 50 ml. Brug en steril 10 ml pipette til at tvinge hESC enkeltcellesuspensioner samlet fra de to T75-kolber gennem sien.
- Kasser celle si, erstatte røret låget og centrifuge den samlede hESC suspension på 1.000 x g i 2 min.
- Supernatant kasseres, og cellerne vaskes ved forsigtigt at genbruge pellet'en i 10 ml 20% FBS/DMEM-F12 (prechilled ved 4 °C).
- Udfør en anden centrifugering ved 1.000 x g i 2 min.
- Supernatant kasseres, der tilsættes 10 ml 20% FBS/DMEM-F12 (prechilled ved 4 °C) og triturat forsigtigt for at genbruge celler. Læg 50 ml røret på is. Dette rør vil blive brugt til sortprøve immunostaining procedure beskrevet nedenfor.
- Tag 20 μl af hESC-enkeltcelleophænget (trin 2.10) for cellenummertælling ved hjælp af et hemotocytometer. Du bør forvente et udbytte på 10-15 millioner celler pr T75 kolbe.
Bemærk: FBS bruges i denne del af protokollen til at øge celle levedygtighed post-FACS.
3. Immunfluorescerende farvning af celleoverfladeantigener TG30 og GCTM-2
- Aliquot 150 μl (~100.000 celler) af en hESC enkeltcellesuspension (fra trin 2.11) til hvert af seks mikrocentrifugerør på 1,5 ml. Disse seks aliquots vil blive brugt til farvning kontrol, der kræves for at kalibrere analysen på FACS maskinen. De resterende ~ 9 ml celle suspension vil være din Sort Sample, hvor den dissociated kultur vil blive omkostningstjent til påvisning af TG30 og GCTM-2, ifølge tabel 1 og 2.
- Udfør bindende reaktioner af primære antistoffer i 20% FBS/DMEM-F12. De endelige reaktionsmængder skal være ~9 ml for sorteringsprøven og 200 μl for kontrollerne. Medtag isotypekontroller som primære antistoffer. Placer rør vandret på is og bland forsigtigt i 30 minutter på en gyngeplatform.
- Centrifuge primære antistofreaktioner ved 1.000 x g i 2 min.
- Supernatant kasseres, og cellerne vaskes ved at genbruge pellet'en i 20 ml 20% FBS/DMEM-F12 (forikket ved 4 °C) til sorteringsprøven og 200 μl til kontrollerne.
- Udfør et andet spin ved 1.000 x g i 2 min.
- Udfør bindende reaktioner af sekundære antistoffer i 20% FBS/DMEM-F12. De endelige reaktionsmængder skal være 2,5 ml for sorteringsprøven og 200 μl for kontrollerne. Forbered PE-anti-mus CD90.2 reaktionsrøret på dette tidspunkt. Placer rør vandret på is og bland forsigtigt i 30 minutter på en gyngeplatform.
Bemærk: I denne inkubationstid er det praktisk at indsamle CM og forberede 1/3 MEF T75 kolber med CM som i punkt 1.2.
- Centrifuge sekundære antistofreaktioner ved 1.000 x g i 2 min.
- Supernatant kasseres, og cellerne vaskes to gange ved at genbruge pellet'en i 20 ml 20% FBS/DMEM-F12 (forikket ved 4 °C) til sorteringsprøven og 200 μl til kontrollerne.
- Udfør et spin på 1.000 x g i 2 minutter efter hver vask og læg rør på is.
- Supernatanter kasseres og genanvendes cellepiller i 20% FBS/DMEM-F12 suppleret med propidiumjodid (PI) ved 0,3 μg/ml. Der anvendes 2-3 ml til sorteringsprøven og 300 μl til kontrollerne.
Bemærk: Føj IKKE PI til kontrolrøret med celler, der ikke er indgroet.
- Brug en P1000 micropipette til at tvinge hver enkelt celleaffjedring gennem en 35 μm lågcellestien, koblet til 5 ml rør polystyren runde bundredningsrør.
- Centrifuge ved 50 g/min. for at gennemtvinge restcelleaffjedring på silågene.
- Genbrug hver enkelt celle suspension ved at trykke på siderne af rørene, og sted på is. Dine celler er nu klar til FACS. Fortsæt med det samme.
4. Post-FACS Kultur TG30/GCTM-2 Subfraction Celler i 75 cm2 (T75) Kolber
- Vi har tidligere rapporteret, hvordan man opsætter en FACS-maskine til TG30/GCTM-2 immunterapi7. Proceduren gør det muligt at genoprette levedygtige enkelt hESC'er, fri for MEF'er, og inden for portene til P4 (TG30Neg-GCTM-2Neg),P5 (TG30Low-GCTM-2Low), P6 (TG30Mid-GCTM-2Mid) og P7 (TG30Hi-GCTM-2Hi) - se figur 1E. Konfigurer FACS-maskinen til TG30/GCTM-2 FACS som i vores tidligere rapport for at gendanne de cellefragmenter, der skal bruges næste gang.
- Der tilsættes 1 ml CM, tilberedt som i trin 1.2, til hver af to 5 ml polystyren runde bundreagensglas, inden der indsamles celler fra FACS-maskinen. Sted på is.
- Gendan 400.000 celler hver fra differentieret P4 (TG30Neg-GCTM-2Neg) og pluripotente P7 (TG30Hi-GCTM-2Hi)celle subfractions ved hjælp af TG30/GCTM-2 FACS.
- Centrifuge opsamlingsrørene ved 1.000 x g i 5 min.
- Aspirate supernatants. Der tilsættes 1 ml præquilibreret 37 °C/5% CO2 CM for at genbruge hver cellepille ved hjælp af en P1000 micropipettor. Cellerne for hver fraktion anbringes på en forekvilibreret 1/3 MEF T75 kolbe med CM (udarbejdet i henhold til trin 1.2)
- Kultur ved 37 °C/5% CO2 i 24 timer i en cellekulturinkubator.
- Aspirat CM dagligt og erstatte med frisklavet CM (som i trin 1.2) i cirka to uger. Kulturer pluripotente P7 (TG30Hi-GCTM-2Hi)celler viser menneskelige stamceller-lignende kolonier efter en uge og nå ~ 80% sammenløb på 9-11 dage. Kulturer af P4 (TG30 Neg-GCTM-2Neg)celler for det meste vokse som en græsplæne af fibroblast-lignende celler, der når sammenløb på 11-13 dage. På nuværende tidspunkt kan P4- og P7-cellekulturer om nødvendigt anvendes til TG30/GCTM-2 FACS medieret fortløbende rekultur af enten P4- eller P7-subfraktioner (se figur 2 og 3).
Representative Results
hESC-derivater, der er pluripotente stamcellefri, kan opnås ved fortløbende passaging af celler fra P4 (TG30Neg-GCTM-2Neg)subfraction.
Tidligere rapporter har fastslået , at der i hESC-standardkulturer findes en blanding af delpopulationer , der udviser et udtryk for gradient af gener forbundet med pluripotens5,6,13. Kombineret påvisning af celleoverfladeantigener som TG30 (CD9) og GCTM-2 giver mulighed for forskelsbehandling af en række delmængder af celler på det pluripotente stadium og på forskellige stadier af tidlig differentiering, som det fremgår af deres udtryk for stamcellemarkører og afstamningsspecifikke transskriptionsfaktorer5,6,13. Efter aftale med tidligere rapporter var vi i stand til at diskriminere P4-celler (TG30Neg-GCTM-2Neg),P5 (TG30Low-GCTM-2Low), P6 (TG30Mid-GCTM-2Mid) og P7 (TG30Hi-GCTM-2Hi)i hESC-MEL1-linjen, der blev anvendt til denne undersøgelse (figur 1). Med dette resultat fortsatte vi med at indsamle differentierede P4 -celler (TG30Neg-GCTM-2Neg)og pluripotente P7-celler (TG30Hi-GCTM-2Hi)til yderligere kultur i undersøgelser beskrevet nedenfor.
Vi undersøgte, om vi ved hjælp af en negativ udvælgelsesmetode kunne rense udifferentierede HESC'er fra cellepopulationer, der gennemgår meget tidlig differentiering (TG30Neg-GCTM-2Neg). Vi brugte et defineret antal P4 -celler (TG30Neg-GCTM-2Neg),der blev dyrket efterfølgende efter FACS(Figur 2A)i ca. to uger, og reanalyseret ved hjælp af TG30/GCTM-2 FACS, før vi replaterede ved hver passage. Resultaterne viste, at P4-subfraction beriget til TG30Neg-GCTM-2Neg differentierede celletyper efter på hinanden følgende passaging, og en mindre tilstedeværelse af P7 (TG30Hi-GCTM-2Hi) celler ved den første passage (Figur 2A, Passage 1) i sidste ende forsvandt efter yderligere passaging, bliver pluripotente stamcelle-fri prøver(Figur 2A, Passage 3).
Berigelse af pluripotente hESC-celler kan opnås ved indsamling af celler TG30Hi-GCTM-2Hi celler.
Baseret på tidligere observationer ved hjælp af denne analyse, ville vi forvente en berigelse af pluripotente hESCs ved at indsamle P7 (TG30Hi-GCTM-2Hi) celler, der skal danne hESC kolonier. Derfor undersøgte vi også TG30/GCTM-2 FACS-medierede på hinanden følgende passaging af pluripotente P7 (TG30Hi-GCTM-2Hi) celler. I disse P7 kulturer, TG30/GCTM-2 FACS immunterapi blev udført før replating celler ved hver passage og kun P7 (TG30Hi-GCTM-2Hi) celler blev rekultureret. På denne måde bemærkede vi, at størstedelen af cellerne var placeret i subfrasektioner forbundet med pluripotens (P6 og P7), hvilket indikerer en berigelse af pluripotente celler, der også opretholdt en kapacitet til at differentiere og generere en lille procentdel af P4 (TG30Neg-GCTM-2Neg) celler (Figur 3A). Desuden viste kulturer af P7-celler et stort antal hESC-lignende kolonier under passaging (Figur 3B), hvilket også indikerer vedligeholdelse af pluripotenstilstanden.
Figur 1. Repræsentativ sorteringsstrategi for at opnå TG30/GCTM-2 FACS-subfrasektioner. (A): Dissociated hES celle suspensioner sorteres som enkelt celler og potentielle klumper eller doublets er gated ud med den forreste scatter for højde og område (FSC-H og FSC-A). B): Potentielle vragrester fjernes med FSC-A og SSC-A, og kun intakte celler sorteres yderligere. C): Ikke-levedygtige celler er udelukket på basis af propidium-iodide (PI) fluorescens (FSC-A og FL3-A). (D): MEF-feederceller blev lukket ud af negativ markering baseret på udtryk for muse-CD90.2-PE (FL2-A og SSC-A). (E): Den isolerede levedygtige hESC-fraktion, fri for MEF-fødere, fraktioneres endelig til P4 (TG30Neg-GCTM-2Neg),P5 (TG30Low-GCTM-2Low), P6 (TG30Mid-GCTM-2Mid) og P7 (TG30Hi-GCTM-2Hi) delpopulationer. Den negative port (TG30Neg-GCTM-2Neg, opkaldt P4) blev sat i henhold til baggrund autofluorescens for de ikke-indgroede celler og også til isotype kontrol. (F): Procentdele af de forskellige indhegnede delpopulationer, der er typiske for en TG30/GCTM-2-flowcytometrianalyse. Klik her for at få vist en større figur.
Figur 2. Repræsentative på hinanden følgende kulturer af spontant differentierede P4-celler (TG30Neg-GCTM-2Neg)fra hESC-MEL1-linjen. (A): Repræsentative TG30/GCTM-2 FACS-områder, der viser indhegnede delmængder af celler (P4, P5, P6 og P7), der forskelsbehandles af niveauet for detekterede udtryk for TG30- og GCTM-2-celleoverflademarkører. En indledende befolkning på 400.000 hESC-derivater udstiller P4 (TG30Neg-GCTM-2Neg) immunprofilering er indsamlet fra bulk kulturer hESC-MEL1 linje. Disse P4 -celler (TG30Neg-GCTM-2Neg)er fortløbende passeret post-FACS under forhold, der understøtter hESC-fornyelse i T75-kolber, indtil de når sammenløb (11-13 dage). Forud for hver passage, TG30/GCTM-2 FACS udføres for at indsamle og rekultur kun P4 (TG30 Neg-GCTM-2Neg) differentierede celletyper. B): Typisk morfologi af plænen af differentierede P4 (TG30 Neg-GCTM-2Neg) celler efter 14 dage. C): Sporadiske hESC-lignende kolonier set efter 14 dage blandet med plænen af P4 (TG30Neg-GCTM-2Neg) celler ved passage 1 kun, er mest sandsynligt genereret ved at forurene P7 (TG30Hi-GCTM-2Hi) celler. Skalastang = 200 μm. Klik her for at få vist en større figur.
Figur 3. P7-celler (TG30Hi-GCTM-2Hi),der er afledt af hESC-linjer, kan passeres efter FACS fortløbende uden at miste deres iboende pluripotente egenskaber. Repræsentant TG30/GCTM-2 FACS immunterapi af de forskellige på hinanden følgende passager, der viser de diskriminerede delmængder af celler (P4, P5, P6 og P7) i henhold til niveauet for udtryk for TG30 og GCTM-2. (A): En startpopulation på 400.000 celler, der viser P7-egenskaber (TG30Hi-GCTM-2Hi),hentes fra bulkkulturer i hESC-MEL1-linjen. Pluripotente P7-celler (TG30Hi-GCTM-2Hi)er fortløbende passeret efter FACS under forhold, der understøtter hESC-fornyelse i T75-kolber, indtil de når ~ 80% sammenløb (9-11 dage). TG30/GCTM-2 FACS immunterapi udføres før replating celler ved hver passage, og kun theP7 (TG30Hi-GCTM-2Hi) celler er rekultureret. Resultaterne viser, at P7-celler (TG30Hi-GCTM-2Hi)bevarer deres pluripotente egenskaber med efterfølgende passaging, herunder bevarelse af (TG30Hi-GCTM-2Hi)udtryk, der danner hESC-lignende kolonier (vist i B) og opretholde evnen til at differentiere som kan udledes af rekapitulering af en lille brøkdel af differentieret P4 (TG30Neg-GCTM-2Neg) i hver af FACS-gradienterne. Skalastang = 200 μm. Klik her for at få vist en større figur.
| Prøve (reaktionsvolumen) | Primært antistof | Sekundært antistof | PE Rotte Anti-Mouse CD90.2 b | Propidium Iodide c |
| Sorter prøve (~9 ml for primære ABs, 2,5 ml for sekundære ABs) | (TG30 + GCTM-2) a | AF 488 ged anti-mus IgG2a + AF 647 ged anti-mus IgM | + | + |
| Kontrol-1: TG30 (200 μl) | TG30 | AF 488 ged anti-mus IgG2a | - | + |
| Kontrol-2: GCTM-2 (200 μl) | GCTM-2 | AF 647 ged anti-mus IgM | - | + |
| Kontrol-3: Cd90.2 med antimus (200 μl) | - | - | + | + |
| Kontrol-4: Phycoerythrin (PE) (200 μl) | Mus IgG2a isotype | R-phycoerythrin ged anti-mus IgG2a | - | + |
| Kontrol-5: Mus Immunoglobulin isotype (200 μl) | Mus IgG2a isotype + IgM isotype | AF 488 ged anti-mus IgG2a + AF 647 ged anti-mus IgM | - | + |
| Kontrol-6: Ikke-indgroede celler (200 μl) | - | - | - | - |
Tabel 1. Sortere eksempel og kontrolelementer til FACS-sortering. a Sorteringsprøven immunostained samtidig med TG30 og GCTM-2 antistoffer. b PE-anti-mouse CD90.2 bruges til at genkende museceller og fjerne PDF-filer fra HESC'er under FACS14. c Ikke-levedygtige celler udelukkes ved anvendelse af propidiumididid ved en endelig koncentration på 0,3 μg/ml. Reagens tilsat (+), ikke tilsat (-) til reaktionsrøret.
| antistof | vært | Isotype | Arbejder fortynding |
| TG30 (1,4 mg/ml) | mus | IgG2a | 1:1,000 |
| GCTM-2 (hybridoma supernatant) | mus | Igm | 1:5 ~ 1:10 a |
| AF 488 ged anti-mus IgG2a | ged | Polyklonal | 1:500 |
| AF 647 ged anti-mus IgM | ged | Polyklonal | 1:500 |
| R-phycoerythrin (PE) ged anti-mus IgG2a | ged | Polyklonal | 1:1,000 |
| Cd 90 med antimus | rotte | IgG2b | 1:100 |
| Renset mus IgG2a, κ Isotype Kontrol | mus | IgG2a | 1:200 |
| Renset muse-IgM, κ Isotype-kontrol | mus | Igm | 1:200 |
Tabel 2. Antistofdetaljer og fortyndinger til FACS-sortering. a På grund af det ekstremt meget høje udtryk for GCTM-2 på hESC'ernes celleoverflade er det ikke muligt at opnå mætning med dette antistof. Hvert parti GCTM-2 hybridoma supernatant skal titreres mod en standardkontrol eller et tidligere parti for at opnå lignende resultater med HESC'er i skala og for at undgå overfarvning.
| Navn på mellem | sammensætning |
| hESC/KOSR-medie | Dulbecco's Modified Eagle Medium:Nutrient Mixture F-12 (DMEM/F-12) suppleret med 20% Knockout Serum Replacement (KOSR), 2 mM GlutaMAX, 1% MEM Nonessential Amino Acids, 0,1 mM 2-Mercaptoethanol, 10 ng/ml human fibroblast vækstfaktor 2 (FGF-2) og Pen/Strep ved 1x. |
| MEF-medie | Dulbecco's Modified Eagle Medium, høj glukose (DMEM) suppleret med 10% Føtal Kvæg Serum (FBS), 2 mM GlutaMAX, og Pen / Strep ved 1x. |
Tabel 3 . Sammensætning af kulturmedier.
Discussion
I den kliniske sammenhæng er differentierede somatiske celletyper det endelige ønskede produkt til transplantation og terapeutiske anvendelser, og hPSC er en selvfornyende og skalerbar kilde til at generere disse somatiske celler eller deres forfædre i laboratoriet. Tilstedeværelsen af resterende udifferentierede hESC'er med et iboende potentiale for teratomadannelse er en sikkerhedsrisiko, når man overvejer hESC-afledte somatiske celler til transplantation til patienter. For en gennemgang af dette og andre risici forbundet med celleterapi se Sharpe et al. 16 For at realisere sådanne anvendelser er det derfor bydende nødvendigt, at forskere sigter mod at generere målcellepopulationer, der også er pluripotente stamcellefri. I den forbindelse demonstrerer vi her, at det ved hjælp af vores TG30/GCTM-2 FACS-metode er muligt at overvåge for tilstedeværelsen af pluripotente celler (TG30Hi-GCTM-2Hi) i en differentierende cellepopulation og opnå levedygtige hESC-differentierede derivater, der kan beriges og rekultureres efter FACS. Selv om det ikke er muligt at opnå 100% pluripotente stamcellefri prøver med et enkelt gennemløb af vores protokol, kan berigede hESC-derivater rekultureres, og efter fortløbende passaging opnås 100% somatisk cellerenhed. Den påviste levedygtighed af somatiske celler til ekspansion efter FACS giver også potentielt mulighed for produktion af et tilstrækkeligt antal celler, der er egnede til potentielle transplantationsbehandlinger.
De opmuntrende resultater af denne pilotundersøgelse fik os til at udføre en mere omfattende undersøgelse ved hjælp af vores TG30/GCTM-2-protokol i en sammenlignende undersøgelse med flere menneskeskabte pluripotente stamcellelinjer (hiPSC)linje 15. I denne undersøgelse fandt vi, at pluripotente stamcellefri prøver opnået ved hjælp af vores TG30/GCTM-2 FACS-protokol ikke genererede teratomer, når de blev transplanteret til immunfattige mus. Derfor kan vi trygt sige, at med brugen af denne in vitro-protokol udvikler tidlige differentieringscellekulturer, der er bestemt til at være fri for pluripotente TG30Hi-GCTM-2Hi-celler, ikke teratomer in vivo. Dette understøtter kraftigt robustheden af vores analyse, hvilket giver en potentiel tilgang til at eliminere risikoen for teratomadannelse før brug af hPSC-afledte celler i kliniske applikationer.
Omvendt viser vi også, at TG30/GCTM-2 FACS assay kan bruges til at hente en pluripotent cellepopulation med højt niveau af udtryk for disse to overfladeantigener (TG30Hi-GCTM-2Hi). Tidligere undersøgelser har vist, at TG30Hi-GCTM-2Hi celler udviser den højeste korrelation med OCT4hi udtryk og danner det højeste antal hESC-lignende kolonier5,6,13,15. Vi er derfor ræsonnerede for, at pluripotencynetværket aktiveres på dets maksimale niveauer i TG30Hi-GCTM-2Hi, der udtrykker celler. Vi mener, at brugen af vores TG30/GCTM-2 FACS-protokol og hentning af P7-celler (TG30Hi-GCTM-2Hi)kan give mulighed for storstilet rensning af berigede levende hESC-kulturer, som input til differentieringsanalyser.
Afslutningsvis demonstrerer vi her potentialiteten i vores FACS-analyse baseret på det kombinerede udtryk for overfladeantigener TG30 og GCTM-2 til både udrensning og berigelse af hESC'er. Fremtidige undersøgelser med protokoller for direkte differentiering af HPSC'er vil sandsynligvis også være informative med hensyn til denne potentielle potentialitet. Vi er klar over, at i nogle assays, hvor differentierede hESC-derivater tidsmæssigt udtrykke TG30 (CD9) eller GCTM-2, disse to antistoffer måske ikke være hensigtsmæssigt eller tilstrækkeligt til at rense pluripotente celler fra en differentieret befolkning på et bestemt tidspunkt i analysen6. Derfor er der et vedvarende behov for at finde nye antistoffer, der specifikt genkender levende HESC'er for at overvinde den mulige begrænsning af krydsreaktion med nogle differentierede celletyper.
Disclosures
Intet at afsløre.
Acknowledgments
Vi takker StemCore-anlægget på Monash University for levering af hESC-linjer og FlowCore-anlægget på Monash University for FACS-tjenester. Dette arbejde blev støttet af forskningsbevillinger fra den australske Stem Cell Centre, New South Wales og victorianske regering Stem Cell Research Grant Program til alle. ALL er partner investigator for Australian Research Council (ARC) Special Research Initiative i Stem Cell Science, Stem Cells Australia.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM/F-12 | Life Technologies | 11320082 | Long Name: Dulbecco's Modified Eagle Medium:Nutrient Mixture F-12 |
| KOSR | Life Technologies | 10828028 | Long Name: Knockout Serum Replacement |
| GlutaMAX | Life Technologies | 35050061 | Long Name: GlutaMAX supplement |
| Nonessential Amino Acids | Life Technologies | 11140050 | Long Name: MEM Nonessential Amino Acids Solution |
| Mercaptoethanol | Life Technologies | 21985023 | Long Name: 2-Mercaptoethanol |
| DPBS | Life Technologies | 14190250 | Long Name: Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline, no calcium, no magnesium |
| TrypLE Express | Life Technologies | 12604039 | Long Name: TrypLE Express (1x), no Phenol Red |
| AF-488 | Life Technologies | A21131 | Long Name: Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG2a |
| AF-647 | Life Technologies | A21238 | Long Name: Alexa Fluor 647 goat anti-mouse IgM |
| PE-anti IgG2a | Life Technologies | P21139 | Long Name: R-Phycoerythrin Goat Anti-Mouse IgG2a (γ2a) Conjugate |
| DMEM | Life Technologies | 11965-092 | Long Name: Dulbecco's Modified Eagle Medium, high glucose |
| Pen/Strep | Life Technologies | 15140-122 | Long Name: Penicillin-Streptomycin, Liquid |
| Distilled Water | Life Technologies | 15230-089. | Long Name: Sterile Distilled Water |
| PI | SIGMA | P4864 | Long Name: Propidium iodide solution |
| FBS | SIGMA | 12203C | Long Name: Fetal Bovine Serum |
| Gelatin | SIGMA | G-1890 | Long Name: Gelatin from porcine skin |
| Human FGF-2 | Millipore | GF003AF-100UG | Long Name: Fibroblast Growth Factor basic, human recombinant, animal-free |
| Filter 0.22 μm | Millipore | SCGPU02RE | Long Name: Stericup-GP, 0.22 μm, polyethersulfone, 250 ml, radio-sterilized |
| 70 μm Cell Strainer | Becton Dickinson | 352350 | Long Name: Cell strainer with 70 μm Nylon mesh |
| 35 μm Lid cell strainer, 5 ml tube | Becton Dickinson | 352235 | Long Name: 5 ml polystyrene round bottom test tube, with a cell strainer cap (35 μm) |
| 5 ml Polystyrene round bottom test tube | Becton Dickinson | 352054 | Long Name: 5 ml polystyrene round bottom test tube, sterile |
| IgG2a Isotype Control | Becton Dickinson | 554126 | Long Name: Purified Mouse IgG2a, κ Isotype Control |
| IgM Isotype Control | Becton Dickinson | 553472 | Long Name: Purified Mouse IgM, κ Isotype Control |
| PE-CD90.2 | Becton Dickinson | 553014 | Long Name: PE Rat Anti-Mouse CD90.2 |
| 8-peaks calibration | Becton Dickinson | 559123 | Long Name: Rainbow Calibration Particles (8 peaks) |
| 50 ml sterile Polypropylene tube | Greiner Bio-One | 227261 | Long Name: 50 ml Polypropylene tube with conical bottom, Sterile |
| T75 flask | Greiner Bio-One | 658175 | Long Name: CELLSTAR Filter Cap Cell Culture 75 cm2 Flasks |
| TG30 | Merck Millipore | MAB4427 | Long Name: TG30 Antibody, clone TG30 |
| GCTM-2 | Merck Millipore | MAB4346 | Long Name: GCTM-2 is not commercially available but TG343 and equivalent monoclonal antibody is |
| Table 4. List of materials and reagent | |||
| FACS machine | Becton Dickinson | FACSVantage SE with FACSDiva option | |
| Inverted microscope | Olympus | IX71 | |
| Table 5. List of equipment. | |||
References
- Pera, M. F., Tam, P. P. Extrinsic regulation of pluripotent stem cells. Nature. 10 (7299), 713-720 (2010).
- Pistollato, F., Bremer-Hoffmann, S., Healy, L., Young, L., Stacey, G. Standardization of pluripotent stem cell cultures for toxicity testing. Expert Opin. Drug Metab. Toxicol. 8 (2), 239-257 (2012).
- Miura, K., Okada, Y., Aoi, T., Okada, A., Takahashi, K., Okita, K., Nakagawa, M., Koyanagi, M., Tanabe, K., Ohnuki, M., et al. Variation in the safety of induced pluripotent stem cell lines. Nat. Biotechnol. 27 (8), 743-745 (2009).
- Polanco, J. C., Laslett, A. L. Safety Assessment of Reprogrammed Cells Prior to Clinical Applications: Potential Approaches to Eliminate Teratoma Formation. Pluripotent Stem Cells. Lenka, N. , InTech. (2013).
- Laslett, A. L., Grimmond, S., et al. Transcriptional analysis of early lineage commitment in human embryonic stem cells. BMC Dev. Biol. 7, 12 (2007).
- Kolle, G., Ho, M., et al. Identification of human embryonic stem cell surface markers by combined membrane-polysome translation state array analysis and immunotranscriptional profiling. Stem Cells. 27, 2446-2456 (2009).
- Zhou, Q., Chy, H., Laslett, A. L. Preparation of defined human embryonic stem cell populations for transcriptional profiling. Current protocols in stem cell biology. Chapter 1, Unit1B 7 (2010).
- Stem Cell Protocols - WiCell. , WiCell. Available from: http://www.wicell.org/home/support/stem-cell-protocols/stem-cell-protocols.cmsx (2013).
- Fong, C. Y., Peh, G. S., Gauthaman, K. Separation of SSEA-4 and TRA-1-60 labelled undifferentiated human embryonic stem cells from a heterogeneous cell population using magnetic-activated cell sorting (MACS) and fluorescence-activated cell sorting (FACS). Stem Cell Rev. 5, 72-80 (2009).
- Schriebl, K., Satianegara, G., et al. Selective removal of undifferentiated human embryonic stem cells using magnetic activated cell sorting followed by a cytotoxic antibody. Tissue Eng. Part A. 18, 899-909 (2012).
- Adewumi, O., Aflatoonian, B., et al. Characterization of human embryonic stem cell lines by the International Stem Cell Initiative. Nat. Biotechnol. 25, 803-816 (2007).
- Michalska, A. E. Isolation and propagation of mouse embryonic fibroblasts and preparation of mouse embryonic feeder layer cells. Current protocols in stem cell biology. Chapter 1, Unit1C 3 (2007).
- Hough, S. R., Laslett, A. L., Grimmond, S. B., Kolle, G., Pera, M. F. A continuum of cell states spans pluripotency and lineage commitment in human embryonic stem cells. PLoS One. 4, e7708 (2009).
- Filipczyk, A. A., Laslett, A. L., Mummery, C., Pera, M. F. Differentiation is coupled to changes in the cell cycle regulatory apparatus of human embryonic stem cells. Stem Cell Res. 1, 45-60 (2007).
- Polanco, J. C., Ho, M. S. H., Wang, B., Zhou, Q., Wolvetang, E., Mason, E., Wells, C., Kolle, G., Grimmond, S. M., Bertoncello, I., O'Brien, C., Laslett, A. L. Identification of unsafe human IPSC lines using a robust surrogate assay for pluripotency. Stem Cells. 31 (8), 1498-1510 (2013).
- Sharpe, M. E., Morton, D., Rossi, A. Nonclinical safety strategies for stem cell therapies. Toxicol. Appl. Pharmacol. 262 (3), 223-231 (2012).
