Summary
Мы описываем использование моноклональных антител TG30 (CD9) и GCTM-2 для комбинированного обнаружения поверхностных антигенов клеток с помощью флуоресценции активированной сортировки клеток (FACS) для идентификации и обогащения живых эмбриональных стволовых клеток человека (HESC) с использованием положительного отбора, а также использования отрицательного отбора для очистки гЕСК от смешанной популяции клеток.
Abstract
Эмбриональные стволовые клетки человека (hESC) могут самообновляться бесконечно in vitro,и с соответствующими сигналами могут быть вызваны дифференцироваться в потенциально все соматические линии клеток. Дифференцированные производные hESC потенциально могут быть использованы в трансплантационной терапии для лечения различных клеточных дегенеративных заболеваний. Тем не менее, протоколы дифференциации hESC обычно дают смесь дифференцированных целевых и внецелевых типов клеток, а также остаточных недифференцированных клеток. Для перевода дифференцированных hESC-производных из лаборатории в клинику, важно уметь различать недифференцированные (плюрипотентные) и дифференцированные клетки, а также генерировать методы для разъединю этих популяций. Безопасное применение гЕСК полученных соматических типов клеток может быть достигнуто только с плюрипотентными стволовыми клетками свободных популяций, как остаточные ГЕСК может вызвать опухоли, известные как тератомы после трансплантации. С этой целью мы описываем методологию обнаружения плюрипотентности связанных поверхностных антигенов клеток с моноклональными антителами TG30 (CD9) и GCTM-2 с помощью флуоресценции активированной клеточной сортировки (FACS) для идентификации плюрипотентных TG30 Hi-GCTM-2Hi hESCs с использованием положительного отбора. Используя отрицательный отбор с нашей методологией TG30/GCTM-2 FACS, мы смогли обнаружить и очистить недифференцированные гЕСК в популяциях, проходящих очень раннюю стадию дифференциации (TG30Neg-GCTM-2Neg). В дальнейшем исследовании, плюрипотентные стволовые клетки без образцов дифференцированных TG30Neg-GCTM-2Neg клеток, отобранных с помощью нашего TG30/GCTM-2 FACS протокол не образуют тератомы после пересадки в иммунной скомпрометированных мышей, поддерживая надежность нашего протокола. С другой стороны, TG30/GCTM-2 FACS-опосредованное последовательное протекание обогащенного плюрипотента TG30 Hi-GCTM-2Hi hESCs не повлияло на их способность к самообновлению in vitro или их внутренней плюрипотентности. Таким образом, характеристики нашей методологии TG30/GCTM-2 FACS обеспечивают чувствительный анализ для получения высокообогащенного населения hPSC в качестве входных данных для дифференциации анализов и для избавления потенциально опухолевых (или остаточных) HESC от производных популяций клеток.
Introduction
HPSC (hPSC) включают эмбриональные стволовые клетки человека (hESC) и индуцированные человеком плюрипотентные стволовые клетки (hIPSC). HPSC может самообновиться на неопределенный срок в соответствующих культурных условиях, не теряя своих способностей, известных как "плюрипотентность". Плюрипотенция определяется как потенциал для клетки, чтобы дифференцироваться в основном любой соматической клеточной линии, включая клетки представитель каждого из трех эмбриональных слоев зародышевых клеток. Замечательный потенциал HPSC обеспечивает средства для широкого спектра клеточных приложений, включая терапевтические варианты. Например, есть расстройства, связанные со смертью клеток и дегенерацией, где нормальная функциональность клеток в организме человека скомпрометирована, как при сердечной недостаточности, травмах позвоночника, диабете, болезни Паркинсона, некоторых видах рака и других клинических патологиях. Пациенты, страдающие этими условиями потенциально могут рассматриваться путем трансплантации здоровых и функциональных соматических клеток, которые были получены из HPSC в лаборатории. Тем не менее, текущие протоколы дифференциации HPSC не являются 100% эффективными и дают смесь дифференцированных целевых и внецелесочных типов клеток, а также остаточных HPSCs, которые не прошли дифференциацию, вместо этого продолжаясамообновать 1-3. Наличие даже небольшого количества hPSC в образце hPSC полученных соматических клеток, предназначенных для трансплантации пациентам, представляет собой серьезный клинический риск, поскольку эти клетки по своей присущей природе образуют ткани всех трех эмбриональных слоев микробов, потенциально могут образовывать виво тип опухоли, известный как тератома. Таким образом, только целевые популяции клеток, которые, как установлено, свободны от плюрипотентных стволовых клеток, могут считаться безопасными для трансплантации пациентам. Есть несколько подходов, как сообщается, потенциально выполнить очистки остаточного HPSCs после дифференциации, (для обзора см. Polanco и Ласлетт4). Ранее мы сообщали об использовании моноклональных антител TG30 (CD9) и GCTM-2 в сочетании с флуоресценцией активированной сортировки клеток (FACS) для выявления плюрипотентных стволовых клеток и дискриминации их от клеток, проходящих раннюю стадию дифференциации в культурахлиний HESC 5-7.
Одним из преимуществ использования антител для обнаружения поверхностных антигенов клеток является то, что целевые клетки, как правило, жизнеспособны после связывания антител и/или маркировки. Таким образом, целевые клетки могут быть собраны после маркировки антител и перекультуры для расширения и дальнейшего применения перед трансплантацией. Одно предостережение для антигенов поверхности клетки выраженное на hPSC что они не только к плюрипотентной стадии и in many cases re-expressed височно во время развития и поэтому будут обнаружены в некоторых продифференцированных типах клетки. Поэтому, если цель состоит в том, чтобы использовать антитела для обнаружения человеческих плюрипотентных клеток и очистить их от образца клеток, полученных из HPSC, выбранные антитела не должны также реагировать с антигенами на конкретные дифференцированные типы клеток, предназначенных для трансплантации. К сожалению, Есть ограниченное количество антител, которые обнаруживают маркеры поверхности клеток на живых HPSCs 4, что делает ограниченные варианты для выбора. Кроме того, несколько исследований указали, что обнаружение одного маркера поверхности клетки не является достаточным для устранения всех hPSC, предполагая, что любая попытка устранить все плюрипотентные субпопуляции hPSC должны опираться на методы, которые используют два или более антител обнаружения различных эпитопов, выраженных HPSCs 9-10. Как упоминалось выше, только HPSC полученных клеток, которые могут быть определены как плюрипотентных стволовых клеток свободных клеток популяций подходят для трансплантации человека. Достижение этого уровня строгости не может быть достигнуто с помощью одного прохода через антитела опосредованной технологии сортировки клеток. Для окончательного получения плюрипотентных образцов стволовых клеток может потребоваться рекультура обогащенной популяции дифференцированных целевых клеток и последующие раунды сортировки клеток.
В нашей лаборатории мы широко охарактеризовали два антитела к поверхности клеток HES, TG30 (CD9) и GCTM-2, для обнаружения живых плюрипотентных клеток. Наши исследования показали, что комбинированное обнаружение как TG30, так и GCTM-2 сильно коррелирует с экспрессией канонических генов, связанных с плюрипотенцией, в линиях HESC 5-7. Иммунопрофилирование TG30/GCTM-2 FACS последовательно показывает, что культуры hESC представляют собой количественный непрерывный градиент выражения TG30/GCTM-2 5-7. Мы произвольно установили четыре популяции (P) ячеек в пределах этого TG30/GCTM-2 градиента: P4 (TG30Neg-GCTM-2Neg),P5 (TG30Low-GCTM-2Low),P6 (TG30Mid-GCTM-2Mid)и P7 (TG30Hi-GCTM-2Hi) 5-7. Наша характеристика этих P4, P5, P6 и P7 популяций клеток показала, что подфракции P6 и P7 выражают большое количество генов, связанных с плюрипотенцией, и эффективно образуют стволовые колонии при перекультуре после FACS 2-3. С другой стороны, P4 (TG30Neg-GCTM-2Neg) клетки выражают большое количество маркеров дифференциации и представляют собой спонтанно дифференцированные типы клеток, которые обычно встречаются в расширяющихся культурах линий hESC 5-6. Мы решили проверить потенциал нашего TG30/GCTM-2 FACS для селективной ликвидации остаточных HPSCs после ранней дифференциации стадии, а также для обогащения плюрипотентных популяций стволовых клеток. Протокол, описанный ниже, показывает, как собирать и рекультуры дифференцированных P4 (TG30Neg-GCTM-2Neg) клетки после FACS для выполнения очистки плюрипотентных P7 (TG30Привет-GCTM-2Привет). Кроме того, мы также объясняем сбор и рекультуру плюрипотентных P7 (TG30Hi-GCTM-2Hi)клеток для получения обогащенной культуры плюрипотентных клеток, которые впоследствии могут быть использованы в качестве определенной входной популяции для потенциального повышения эффективности и согласованности дифференциации анализов.
Protocol
Следующий протокол был выполнен с использованием стандартных массовых культур hESC-MEL111, предоставленных stemCore в Университете Монаша (Мельбурн). Эта линия клеток обычно культурируется на слое митотически инактивированных эмбриональных фибробластов мыши (MEF) в bFGF дополненных hESC/KOSR media7 и поддерживается с энзиматической диссоциацией (коллагеназы) каждые 5-7дней 8. Культуры hESC, выращенные до 80% слияния в колбы 75см 2 (T75), используются в качестве входных популяций для этого протокола. Все процедуры манипуляции клетками, описанные ниже, должны выполняться в асептических условиях в биобезопасности HEPA-фильтрованного класса II.
За два дня до проведения анализа TG30/GCTM-2 FACS подготовьйте культурные пластины T75 (описанные в разделе 1), которые будут использоваться для рекультуры клеток, восстановленных после FACS (описано в разделе 4).
1. Посев МЭФ и подготовка средней степени безопасности
1.1 День -2: Покрытие МЭФ в колбы T75
- Пипетт 10 мл 0,1% ж / В желатин в каждой колбе T75 и наклона, чтобы покрыть поверхность равномерно.
- Инкубировать в течение 30 минут при комнатной температуре в шкафу биобезопасности.
- Аспират желатиновый раствор.
- Добавьте 20 мл MEF-среды в колбу и предварительно эквилибрата до 37 градусов по Цельсию/5% CO2 в течение 30 мин в инкубаторе культуры клеток.
- Плита митотично инактивированных МЭФ на подготовленную колбу (ы) при следующих плотностях. Для семян плотности 1/3 МЭФ 1,4 х 104 ячейки/см 2 (T75" 1 x 106 МЭФ). Для полной плотности MEF семян 5,3 х 104 клеток /см 2 (T75 и 4 х 106 МЭФ).
Примечание: Мы регулярно используем МЕФ, которые были митотично инактивированы γ облучения. Протокол подготовки облученных γ можно найти в Михальске12.
- Инкубационный облученный MEF культур при 37 C/5% CO2 ночь. 1/3 колбы можно инкубировали в течение 1-4 дней без изменения MEF-среды. Эти колбы используются для переоформляния ячеек post-FACS (как в протоколе 4). Полный MEF колбы инкубируется в одночасье для создания CM в соответствии с ниже в шаге 1.2.
1.2 День -1: Подготовка среды с состоянием МЭФ (CM)
- Аспират MEF-средний от полных колб MEF T75.
- Добавьте предварительно уравновешенную 25 мл HESC/KOSR среды, дополненной 5 нг/мл человеческого FGF-2 на колбу T75. Инкубационный при 37 градусах по Цельсию/5% CO2 в течение 24 часов.
- Соберите MEF-кондиционированную среду (CM) в стерильную трубку культуры ткани, свежеприготовленную CM с 10 нг/мл человеческого FGF-2 и фильтр с помощью фильтра полиэтиленсульфона 0,22 мкм.
- Чтобы произвести дополнительные CM, повторите шаги 1.2.2 и 1.2.3 ежедневно на той же культуре MEF в течение одной недели.
В день проведения анализа TG30/GCTM-2 замените MEF-medium в 1/3 ЦЯП T75 колбами CM и дооквилбровки в течение не менее 30 минут до посева любых hESCs или hESC-производных клеток, восстановленных в ходе процедуры, описанной ниже. CM используется свежим или хранится при 4 градусах Цельсия в течение 2 недель. CM используется в этом протоколе, так как в наших руках он повышает жизнеспособность ячеек после FACS по сравнению с неучтенными средствами массовой информации (результаты не показаны).
2. Выполнение анализа TG30/GCTM-2 FACS: Диссоциация массовых культур hESC в одиночные клетки
Примечание: Prechill 20% FBS/DMEM-F12 среды при 4 C.
- Аспирировать hESC/KOSR сми из двух колб T75 с культурной линией hESC.
- Промыть клетки в каждом T75 с 10 мл DPBS и аспирата для удаления.
- Добавьте 3 мл раствора диссоциации TrypLE Express в каждую колбу T75. Инкубационный при 37 градусах по Цельсию/5% CO2 в течение 5 мин.
- Bump стороне колбы, чтобы получить полное вытеснение клеток. Проверьте под микроскопом. Если клетки не выбить легко, инкубировать еще 2-3 мин при 37 C/5% CO2.
- Добавьте 10 мл 20% FBS/DMEM-F12 (сохраняется при 4 градусов по Цельсию) к каждой колбе T75. Используя стерильные 10 мл пипетки аккуратно тритурировать диссоциированных клеток несколько раз против стенки колбы для достижения преимущественно одноклеточной подвески.
- Поместите 70 мкм клеточный ситечко на 50 мл стерильной полипропиленной трубки. Используйте стерильные 10 мл пипетки, чтобы заставить HESC одноклеточных суспензий, соединенных из двух колб T75 через ситечко.
- Откажитесь от ситечкой клеток, замените крышку трубки и центрифугайте подвеску с бассейном hESC при 1000 х г в течение 2 минут.
- Отбросьте супернатант и промойте клетки, аккуратно повторно помеская гранулы в 10 мл 20% FBS/DMEM-F12 (предварительно при 4 градусах Цельсия).
- Выполните вторую центрифугу при 1000 х г в течение 2 мин.
- Откажитесь от супернатанта, добавьте 10 мл 20% FBS/DMEM-F12 (предварительно при 4 градусах Цельсия) и аккуратно тритурат для повторного перерасхода клеток. Поместите 50 мл трубки на лед. Эта трубка будет использоваться для процедуры иммуностиминга Сорта образца, описанной ниже.
- Возьмите 20 мкл одноклеточной подвески hESC (шаг 2.10) для подсчета числа клеток с помощью гемотоцитометра. Вы должны ожидать выход 10-15 миллионов клеток на колбу T75.
Примечание: FBS используется в этой части протокола для повышения жизнеспособности ячеев после FACS.
3. Иммунофлуоресцентное окрашивание поверхностных антигенов TG30 и GCTM-2
- Aliquot 150 хл (100 000 клеток) одноклеточной подвески hESC (от шага 2.11) в каждую из шести микроцентрифугных трубок по 1,5 мл. Эти шесть aliquots будут использоваться для окрашивания элементов управления, необходимых для калибровки анализа на машине FACS. Оставшаяся подвеска клетки 9 мл будет вашим Сортированным Образцом, в котором разобщенное культура будет costained для обнаружения TG30 и GCTM-2, согласно таблицам 1 и 2.
- Выполняем связывающие реакции первичных антител в 20% FBS/DMEM-F12. Окончательные объемы реакции должны быть 9 мл для сорта образца и 200 мкл для элементов управления. Включите изотип управления в качестве основных антител. Поместите трубки горизонтально на лед и аккуратно перемешайте в течение 30 минут на платформу для качания.
- Центрифуга первичных реакций антител на 1000 х г в течение 2 мин.
- Отбросьте супернатант и промыть клетки путем повторного перерасхода гранул в 20 мл 20% FBS/DMEM-F12 (предварительно при 4 градусов по Цельсию) для сорта образца и 200 мкл для контроля.
- Выполните второй спин на 1000 х г в течение 2 мин.
- Выполняем связывающие реакции вторичных антител в 20% FBS/DMEM-F12. Окончательные объемы реакции должны быть 2,5 мл для сорта образца и 200 мкл для элементов управления. Подготовьтесь к реакционной трубке PE-антимошки CD90.2 на данном этапе. Поместите трубки горизонтально на лед и аккуратно перемешайте в течение 30 минут на платформу для качания.
Примечание: В это инкубационные время удобно собирать CM и готовить 1/3 колбы MEF T75 с CM, как в разделе 1.2.
- Центрифуга вторичных реакций антител на 1000 х г в течение 2 мин.
- Отбросьте супернатант и вымойте клетки TWICE путем повторного перерасхода гранул в 20 мл 20% FBS/DMEM-F12 (предварительно при 4 градусах Цельсия) для Сорта Образца и 200 мкл для элементов управления.
- Выполните спин на 1000 х г в течение 2 минут после каждой стирки и место трубки на льду.
- Отбросьте супернатанты и гранулы клеток resuspend в 20% FBS/DMEM-F12, дополненных йодидом пропидия (PI) при 0,3 мкг/мл. Используйте 2-3 мл для сортировки образца и 300 мкл для управления.
Примечание: НЕ добавляйте PI в контрольную трубку с необлименеными клетками.
- Используйте микропипют P1000, чтобы заставить каждую индивидуальную подвеску клетки через 35 мкм ситечко клетки крышки, в сочетании с 5 мл трубки полистирола круглые нижние пробирки.
- Центрифуга при 50 г/мин, чтобы заставить через остаточную подвесную клетку на крышках ситечко.
- Resuspend каждой отдельной подвески ячейки, нажав стороны труб, и место на льду. Ваши ячейки теперь готовы к FACS. Пожалуйста, продолжайте сразу.
4. Пост-FACS Культура TG30/GCTM-2 Подфракционные клетки в 75см 2 (T75) Колбы
- Ранее мы сообщали о том, как настроить машину FACS для иммунопрофилирования TG30/GCTM-27. Процедура позволяет восстановление жизнеспособных одиночных ХЭСК, свободных от МЭФ, и в пределах ворот P4 (TG30Neg-GCTM-2Neg),P5 (TG30Low-GCTM-2Low),P6 (TG30Mid-GCTM-2Mid)и P7 (TG30Hi-GCTM-2Hi)- см. Рисунок 1E. Настройка машины FACS для TG30/GCTM-2 FACS, как и в нашем предыдущем докладе, чтобы восстановить подфракции ячеек, которые будут использоваться в следующем.
- Добавьте 1 мл CM, подготовленный как в шаге 1.2, к каждому из 2 5 мл полистирола круглые нижние пробирки перед собирать клетки от машины FACS. Место на льду.
- Восстановление 400 000 ячеек каждый из дифференцированных P4 (TG30Neg-GCTM-2Neg) и плюрипотентных P7 (TG30Hi-GCTM-2Hi)клеточных подфракций с использованием TG30/GCTM-2 FACS.
- Центрифуга коллекционых трубок по 1000 х г в течение 5 мин.
- Аспирировать супернатантов. Добавьте 1 мл предварительно облибрированных 37 C/5% CO2 CM для повторного использования каждой клеточной гранулы с помощью микропайптора P1000. Семя клеток для каждой фракции на предварительно equilibrated 1/3 MEF T75 колбу с CM (подготовлено в соответствии с шагом 1.2)
- Культура при 37 градусах по Цельсию/5% CO2 в течение 24 часов в инкубаторе клеточной культуры.
- Аспирировать CM ежедневно и заменить свежеприготовленным CM (как в шаге 1.2) в течение примерно двух недель. Культуры плюрипотентных P7 (TG30Hi-GCTM-2Hi)клетки показывают человеческие стволовые колонии через неделю и достигают 80% слияния в 9-11 дней. Культуры P4 (TG30Neg-GCTM-2Neg) клетки в основном растут как газон фибробластов, как клетки, которые достигают слияния в 11-13 дней. На этом этапе, при необходимости, культуры клеток P4 и P7 могут быть использованы для TG30/GCTM-2 FACS опосредовано последовательной рекультуры либо P4 или P7 субфракций (см. цифры 2 и 3).
Representative Results
hESC-производные, которые плюрипотентные стволовые клетки, свободные могут быть получены путем последовательного прохода клеток из P4 (TG30Neg-GCTM-2Neg) субфракции.
Предыдущие доклады установили, что в стандартных культурах hESC смесь субпопуляций сосуществует, демонстрировали градиент экспрессии генов, связанныхс плюрипотенцией 5,6,13. Комбинированное обнаружение поверхностных антигенов клеток, таких как TG30 (CD9) и GCTM-2, допускает дискриминацию ряда подмножества клеток на плюрипотентной стадии и на различных стадиях ранней дифференциации, о чем свидетельствует их экспрессия маркеров стволовых клетоки специфических транскрипционных факторов линии 5,6,13. В соответствии с предыдущими докладами, мы смогли различить P4 (TG30Neg-GCTM-2Neg),P5 (TG30Low-GCTM-2Low),P6 (TG30Mid-GCTM-2Mid),и P7 (TG30Hi-GCTM-2Hi) клетки в линии hESC-MEL1, используемой для этого исследования (Рисунок 1). С этим результатом, мы приступили к сбору дифференцированных P4 (TG30Neg-GCTM-2Neg) клетки и плюрипотентные P7 (TG30Привет-GCTM-2 Привет )клеткидля дальнейшей культуры в исследованиях, описанных ниже.
Мы исследовали, можно ли с помощью отрицательного подхода отбора мы могли бы очистить недифференцированные гЕУ от популяций клеток, проходящих очень раннюю стадиюдифференциации(TG30 Neg -GCTM-2Neg). Мы использовали определенное количество ячеек P4 (TG30Neg-GCTM-2Neg),которые были последовательно культурны после FACS(рисунок 2A) в течение приблизительно двух недель, и повторно использовали TG30/GCTM-2 FACS до повторного покрытия на каждом проходе. Результаты показали, что P4-субфракция обогащена для TG30Neg-GCTM-2Neg дифференцированных типов клеток после последовательного прохождения, и незначительное присутствие P7 (TG30Привет-GCTM-2Hi) клеткина начальном проходе (Рисунок 2A, Прохождение 1) в конечном итоге исчезли после дальнейшего прохождения, став плюрипотентной стволовых клеток свободных образцов (Рисунок 2A, Прохождение 3).
Обогащение плюрипотентных клеток ХЕСК может быть достигнуто за счет сбора клеток TG30Hi-GCTM-2Hi-клеток.
Основываясь на предыдущих наблюдениях, использующих этот анализ, мы ожидаем обогащения плюрипотентных гЕСК путем сбора P7 (TG30Hi-GCTM-2Hi)клеток, которые должны образовывать колонии hESC. Таким образом, мы также исследовали TG30/GCTM-2 FACS-опосредованное последовательное протекание плюрипотентных P7 (TG30Hi-GCTM-2Hi)ячеек. В этих культурах P7 иммунопрофилирование TG30/GCTM-2 FACS проводилось до переливания клеток на каждом проходе, и только P7 (TG30Hi-GCTM-2Hi)клетки были перекультуры. Таким образом, мы заметили, что большинство клеток были расположены в подфракциях, связанных с плюрипотенцией (P6 и P7), что указывает на обогащение плюрипотентных клеток, которые также поддерживали способность дифференцировать и генерировать небольшой процент P4 (TG30Neg-GCTM-2Neg) клетки (Рисунок 3A). Кроме того, культуры клеток P7 показали большое количество hESC-как колонии во время passaging(рисунок 3B), также указывая на поддержание состояния плюрипотентности.
Рисунок 1. Стратегия сортировки представителей для получения субфракций TG30/GCTM-2 FACS. (A): Диссоциированные подвески клеток HES сортируются как одиночные клетки и потенциальные сгустки или дублеты закрыты с вперед рассеяния по высоте и области (FSC-H и FSC-A). (B): Потенциальные обломки удаляются с помощью FSC-A и SSC-A, и только нетронутые ячейки дополнительно сортируются. (C): Невекаемые клетки исключаются на основе флуоресценции пропидия йодида (PI) (FSC-A и FL3-A). (D): Ячейки фидер MEF были закрыты отрицательным отбором на основе выражения мыши CD90.2-PE (FL2-A и SSC-A). (E): Изолированная жизнеспособная фракция hESC, свободная от фидерсов MEF, наконец, фракционо в P4 (TG30Neg-GCTM-2Neg),P5 (TG30Low-GCTM-2Low),P6 (TG30Mid-GCTM-2Mid),и P7 (TG30Hi-GCTM-2Hi)субпопуляции. Отрицательные ворота (TG30Neg-GCTM-2 Neg ,названныйP4) были установлены в соответствии с фоном автофлуоресценции для необляных клеток, а также для управления изотипом. (F): Проценты различных закрытых субпопуляций, типичных для цитометрического анализа потока TG30/GCTM-2. Нажмите здесь, чтобы просмотреть большую цифру.
Рисунок 2. Представительные последовательные культуры спонтанно дифференцированных клеток P4 (TG30Neg-GCTM-2Neg)от линии hESC-MEL1. (A): Представитель TG30/GCTM-2 FACS участков, показывающих закрытые подмножества ячеек (P4, P5, P6 и P7) дискриминируется по уровню обнаруженного выражения маркеров поверхности клеток TG30 и GCTM-2. Первоначальная популяция 400 000 хЕСК-производных, выставляла иммунопрофилирование P4 (TG30Neg-GCTM-2Neg)из массовых культур линии hESC-MEL1. Эти P4 (TG30Neg-GCTM-2Neg) клетки последовательно пролетев после FACS в условиях, поддерживающих обновление HESC в колбы T75, до достижения слияния (11-13 дней). Перед каждым проходом TG30/GCTM-2 FACS выполняется для сбора и рекультуры только P4 (TG30Neg-GCTM-2Neg) дифференцированных типов клеток. (B): Типичная морфология газона дифференцированных клеток P4 (TG30Neg-GCTM-2Neg)через 14 дней. (C): Спорадические hESC-как колонии видели после 14 дней, переплетающихся с газоном P4 (TG30Neg-GCTM-2Neg) клетки на проходе 1 только, скорее всего, генерируется загрязняющих P7 (TG30Привет-GCTM-2Привет) клеток. Шкала бар 200 мкм. Нажмите здесь, чтобы просмотреть большую цифру.
Рисунок 3. P7 (TG30Hi-GCTM-2Hi)клетки, полученные из линий hESC, могут последовательно пройти после FACS, не теряя при этом своих внутренних плюрипотентных свойств. Представитель TG30/GCTM-2 FACS иммунопрофилирования различных последовательных проходов, показывая дискриминированную подмножества клеток (P4, P5, P6 и P7) в зависимости от уровня экспрессии TG30 и GCTM-2. (A): Стартовая популяция 400 000 ячеек, показывающих характеристики P7 (TG30Hi-GCTM-2Hi),извлекается из основных культур линии hESC-MEL1. Плюрипотентные P7 (TG30Hi-GCTM-2Hi)клетки последовательно проносяты после FACS в условиях, поддерживающих обновление HESC в колбы T75, до достижения 80% слияния (9-11 дней). TG30/GCTM-2 FACS иммунопрофилирование выполняется до переливания клеток на каждом проходе, и только клетки TG30Hi-GCTM-2Hiперекультуры. Результаты показывают, что P7 (TG30Hi-GCTM-2Hi)клетки сохраняют свои плюрипотентные характеристики с последующим проходом, включая сохранение (TG30Hi-GCTM-2Hi)экспрессию, формирование колоний, похожих на hESC (показано в B)и поддержание способности дифференцировать, как можно сделать вывод из перепросмотра небольшой доли дифференцированных P4 (TG30Neg-GCTM-2Neg) в каждом из градиентов FACS. Шкала бар 200 мкм. Нажмите здесь, чтобы просмотреть большую цифру.
| Образец (объемы реакции) | Первичные антитела | Вторичные антитела | PE Крыса Антимоша CD90.2 b | Пропидий йодид c |
| Сортированная проба (9 мл для первичных ABs, 2,5 мл для вторичных ABs) | (TG30 и GCTM-2) a | AF 488 коза анти-мышь IgG2a и AF 647 коза анти-мышь IgM | + | + |
| Контроль-1: TG30 (200 мкл) | TG30 | AF 488 коза анти-мышь IgG2a | - | + |
| Контроль-2: ГКТМ-2 (200 мкл) | ГКТМ-2 | AF 647 коза анти-мышь IgM | - | + |
| Управление-3: Антимошашки CD90.2 (200 мкл) | - | - | + | + |
| Контроль-4: Фикоэритрин (PE) (200 мкл) | Мышь IgG2a изотип | R-фикоэритрин коза анти-мышь IgG2a | - | + |
| Контроль-5: Мышь Иммуноглобулин изотип (200 мкл) | Мышь IgG2a изотипа и изотип IgM | AF 488 коза анти-мышь IgG2a и AF 647 коза анти-мышь IgM | - | + |
| Контроль-6: Необлетонные клетки (200 мкл) | - | - | - | - |
Таблица 1. Сортировать образец и элементы управления для сортировки FACS. a Сортированная проба иммунолигурирована одновременно с антителами TG30 и GCTM-2. б PE-анти-мышь CD90.2 используется для распознавания ячеек мыши и удаления MEFs из ГЕСК во время FACS14. c Незвукаемые клетки исключаются с помощью йодида пропидия при конечной концентрации 0,3 мкг/мл. Реагент добавлен (я), не добавлен (-) к трубке реакции.
| антитело | хозяин | Изотип | Рабочее разбавление |
| TG30 (1,4 мг/мл) | мышь | IgG2a | 1:1,000 |
| GCTM-2 (супернатант гибридомы) | мышь | IgM | 1:5 и 1:10 a |
| AF 488 коза анти-мышь IgG2a | коза | Поликлональный | 1:500 |
| AF 647 коза анти-мышь IgM | коза | Поликлональный | 1:500 |
| R-фикоэритрин (PE) коза анти-мышь IgG2a | коза | Поликлональный | 1:1,000 |
| Антимошашки CD90.2 | крыса | IgG2b | 1:100 |
| Очищенная мышь IgG2a, и управление изотипом | мышь | IgG2a | 1:200 |
| Очищенная мышь IgM, и управление изотипом | мышь | IgM | 1:200 |
Таблица 2. Детали антител и разбавления для сортировки FACS. a Из-за чрезвычайно очень высокой экспрессии GCTM-2 на поверхности клеток ГЕУ не может достичь насыщения этим антителом. Каждая партия супернатанта гибридомы GCTM-2 должна быть присвоена стандартному элементу управления или предыдущей партии, чтобы получить аналогичные результаты с гЕУ в масштабе и избежать чрезмерного окрашивания.
| Название среды | состав |
| hESC/KOSR средний | Модифицированный Eagle Medium от Dulbecco: Nutrient Mixture F-12 (DMEM/F-12) дополнен 20% заменой сыворотки нокаута (KOSR), 2 мМ GlutaMAX, 1% МЭМ несущественные аминокислоты, 0,1 мМ 2-Меркаптоэтанол, 10 нг/мл фактора роста фибробласта человека 2 (FGF-2) и Pen/Strep в 1x. |
| СРЕДА MEF | Модифицированный eagle Medium Дульбекко, высокий уровень глюкозы (DMEM) дополнен 10% фетальной сыворотки крупного рогатого скота (FBS), 2 мМ GlutaMAX, и пен / Strep в 1x. |
Таблица 3. Состав культурных СМИ.
Discussion
В клиническом контексте дифференцированные типы соматических клеток являются конечной желаемой продукцией для трансплантации и терапевтического применения, а HPSC является самообновляемым и масштабируемым источником для генерации этих соматических клеток или их прародителей в лаборатории. Наличие остаточных недифференцированных гЕСК с присущим ему потенциалом для формирования тератомы является риском для безопасности при рассмотрении соматических клеток, полученных из HESC для трансплантации пациентам. Для рассмотрения этого и других рисков, связанных с клеточной терапии, пожалуйста, смотрите Шарп и др. 16 Поэтому, чтобы реализовать такие приложения, крайне важно, чтобы исследователи стремятся генерировать целевые популяции клеток, которые также плюрипотентные стволовые клетки бесплатно. С этой целью мы демонстрируем здесь, что с помощью нашей методологии TG30/GCTM-2 FACS можно контролировать наличие плюрипотентных клеток (TG30Hi-GCTM-2Hi)в дифференцируя популяции клеток и получить жизнеспособные производные, дифференцированные по ХЕСК, которые могут быть обогащены и перекультурированы после FACS. Хотя невозможно получить 100% плюрипотентных образцов, свободных от стволовых клеток с одним проходом нашего протокола, обогащенные hESC-производные могут быть перекультуры и после последовательного прохода 100% соматической клеточной чистоты достигается. Продемонстрирована жизнеспособность соматических клеток для расширения после FACS также потенциально позволяет для производства достаточного количества клеток, пригодных для потенциальной трансплантации терапии.
Обнадеживающие результаты этого экспериментального исследования побудили нас провести более всестороннее исследование с использованием нашего протокола TG30/GCTM-2 в сравнительном исследовании с несколькими индуцированными человеком плюрипотентными стволовыми клетками (hiPSC)линиями 15. В этом исследовании мы обнаружили, что плюрипотентные образцы, свободные от стволовых клеток, полученные с помощью нашего протокола TG30/GCTM-2 FACS, не генерируют тератомы при пересадке в лишенных иммунитета мышей. Таким образом, мы можем с уверенностью сказать, что с использованием этого протокола in vitro, ранней стадии дифференциации клеточных культур определяется как свободный от плюрипотентных TG30 Привет-GCTM-2Привет клетки не развиваются тератомы in vivo. Это решительно поддерживает надежность нашего анализа, обеспечивая потенциальный подход к устранению риска образования тератомы до использования клеток, полученных из HPSC в клинических применениях.
И наоборот, мы также показываем, что анализ TG30/GCTM-2 FACS может быть использован для извлечения плюрипотентной популяции клеток с высоким уровнем экспрессии этих двух поверхностных антигенов (TG30Hi-GCTM-2Hi). Предыдущие исследования показали, что TG30Привет-GCTM-2Привет клетки демонстрируют самую высокую корреляцию свыражением OCT4 привет и образуют наибольшее количество HESC-какколонии 5,6,13,15. Поэтому мы считаем, что сеть плюрипотенции активируется на максимальных уровнях в TG30Hi-GCTM-2Hi, выражаюющих ячейки. Мы считаем, что использование нашего протокола TG30/GCTM-2 FACS и извлечение клеток P7 (TG30Hi-GCTM-2Hi)может позволить провести крупномасштабную очистку обогащенных живых культур hESC, как входные данные для дифференциации анализов.
В заключение мы демонстрируем здесь потенциал наших анализов FACS на основе комбинированного выражения поверхностных антигенов TG30 и GCTM-2 как для очистки, так и для обогащения гЕСК. Будущие исследования с протоколами направленной дифференциации ГПСК, вероятно, также будут информативными в отношении этой потенциальности. Мы знаем, что в некоторых анализах, где дифференцированные hESC-производные временно выражают TG30 (CD9) или GCTM-2, эти два антитела могут быть неуместны или достаточны для очистки плюрипотентных клеток от дифференцированной популяции в определенный момент времени ванализе 6. Таким образом, существует постоянная необходимость найти новые антитела, которые специально распознают живые гЕУ для преодоления возможного ограничения перекрестной реакции с некоторыми дифференцированными типами клеток.
Disclosures
Нечего раскрывать.
Acknowledgments
Мы благодарим stemCore в Университете Монаша за предоставление линий hESC и объекта FlowCore в Университете Монаша за услуги FACS. Эта работа была поддержана научно-исследовательских грантов от Австралийского центра стволовых клеток, Новый южный Уэльс и викторианской правительства стволовых клеток научно-исследовательской грантовой программы для всех. ВСЕ является партнером исследователь Австралийского научно-исследовательского совета (ARC) Специальная исследовательская инициатива в области стволовых клеток науки, стволовые клетки Австралии.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM/F-12 | Life Technologies | 11320082 | Long Name: Dulbecco's Modified Eagle Medium:Nutrient Mixture F-12 |
| KOSR | Life Technologies | 10828028 | Long Name: Knockout Serum Replacement |
| GlutaMAX | Life Technologies | 35050061 | Long Name: GlutaMAX supplement |
| Nonessential Amino Acids | Life Technologies | 11140050 | Long Name: MEM Nonessential Amino Acids Solution |
| Mercaptoethanol | Life Technologies | 21985023 | Long Name: 2-Mercaptoethanol |
| DPBS | Life Technologies | 14190250 | Long Name: Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline, no calcium, no magnesium |
| TrypLE Express | Life Technologies | 12604039 | Long Name: TrypLE Express (1x), no Phenol Red |
| AF-488 | Life Technologies | A21131 | Long Name: Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG2a |
| AF-647 | Life Technologies | A21238 | Long Name: Alexa Fluor 647 goat anti-mouse IgM |
| PE-anti IgG2a | Life Technologies | P21139 | Long Name: R-Phycoerythrin Goat Anti-Mouse IgG2a (γ2a) Conjugate |
| DMEM | Life Technologies | 11965-092 | Long Name: Dulbecco's Modified Eagle Medium, high glucose |
| Pen/Strep | Life Technologies | 15140-122 | Long Name: Penicillin-Streptomycin, Liquid |
| Distilled Water | Life Technologies | 15230-089. | Long Name: Sterile Distilled Water |
| PI | SIGMA | P4864 | Long Name: Propidium iodide solution |
| FBS | SIGMA | 12203C | Long Name: Fetal Bovine Serum |
| Gelatin | SIGMA | G-1890 | Long Name: Gelatin from porcine skin |
| Human FGF-2 | Millipore | GF003AF-100UG | Long Name: Fibroblast Growth Factor basic, human recombinant, animal-free |
| Filter 0.22 μm | Millipore | SCGPU02RE | Long Name: Stericup-GP, 0.22 μm, polyethersulfone, 250 ml, radio-sterilized |
| 70 μm Cell Strainer | Becton Dickinson | 352350 | Long Name: Cell strainer with 70 μm Nylon mesh |
| 35 μm Lid cell strainer, 5 ml tube | Becton Dickinson | 352235 | Long Name: 5 ml polystyrene round bottom test tube, with a cell strainer cap (35 μm) |
| 5 ml Polystyrene round bottom test tube | Becton Dickinson | 352054 | Long Name: 5 ml polystyrene round bottom test tube, sterile |
| IgG2a Isotype Control | Becton Dickinson | 554126 | Long Name: Purified Mouse IgG2a, κ Isotype Control |
| IgM Isotype Control | Becton Dickinson | 553472 | Long Name: Purified Mouse IgM, κ Isotype Control |
| PE-CD90.2 | Becton Dickinson | 553014 | Long Name: PE Rat Anti-Mouse CD90.2 |
| 8-peaks calibration | Becton Dickinson | 559123 | Long Name: Rainbow Calibration Particles (8 peaks) |
| 50 ml sterile Polypropylene tube | Greiner Bio-One | 227261 | Long Name: 50 ml Polypropylene tube with conical bottom, Sterile |
| T75 flask | Greiner Bio-One | 658175 | Long Name: CELLSTAR Filter Cap Cell Culture 75 cm2 Flasks |
| TG30 | Merck Millipore | MAB4427 | Long Name: TG30 Antibody, clone TG30 |
| GCTM-2 | Merck Millipore | MAB4346 | Long Name: GCTM-2 is not commercially available but TG343 and equivalent monoclonal antibody is |
| Table 4. List of materials and reagent | |||
| FACS machine | Becton Dickinson | FACSVantage SE with FACSDiva option | |
| Inverted microscope | Olympus | IX71 | |
| Table 5. List of equipment. | |||
References
- Pera, M. F., Tam, P. P. Extrinsic regulation of pluripotent stem cells. Nature. 10 (7299), 713-720 (2010).
- Pistollato, F., Bremer-Hoffmann, S., Healy, L., Young, L., Stacey, G. Standardization of pluripotent stem cell cultures for toxicity testing. Expert Opin. Drug Metab. Toxicol. 8 (2), 239-257 (2012).
- Miura, K., Okada, Y., Aoi, T., Okada, A., Takahashi, K., Okita, K., Nakagawa, M., Koyanagi, M., Tanabe, K., Ohnuki, M., et al. Variation in the safety of induced pluripotent stem cell lines. Nat. Biotechnol. 27 (8), 743-745 (2009).
- Polanco, J. C., Laslett, A. L. Safety Assessment of Reprogrammed Cells Prior to Clinical Applications: Potential Approaches to Eliminate Teratoma Formation. Pluripotent Stem Cells. Lenka, N. , InTech. (2013).
- Laslett, A. L., Grimmond, S., et al. Transcriptional analysis of early lineage commitment in human embryonic stem cells. BMC Dev. Biol. 7, 12 (2007).
- Kolle, G., Ho, M., et al. Identification of human embryonic stem cell surface markers by combined membrane-polysome translation state array analysis and immunotranscriptional profiling. Stem Cells. 27, 2446-2456 (2009).
- Zhou, Q., Chy, H., Laslett, A. L. Preparation of defined human embryonic stem cell populations for transcriptional profiling. Current protocols in stem cell biology. Chapter 1, Unit1B 7 (2010).
- Stem Cell Protocols - WiCell. , WiCell. Available from: http://www.wicell.org/home/support/stem-cell-protocols/stem-cell-protocols.cmsx (2013).
- Fong, C. Y., Peh, G. S., Gauthaman, K. Separation of SSEA-4 and TRA-1-60 labelled undifferentiated human embryonic stem cells from a heterogeneous cell population using magnetic-activated cell sorting (MACS) and fluorescence-activated cell sorting (FACS). Stem Cell Rev. 5, 72-80 (2009).
- Schriebl, K., Satianegara, G., et al. Selective removal of undifferentiated human embryonic stem cells using magnetic activated cell sorting followed by a cytotoxic antibody. Tissue Eng. Part A. 18, 899-909 (2012).
- Adewumi, O., Aflatoonian, B., et al. Characterization of human embryonic stem cell lines by the International Stem Cell Initiative. Nat. Biotechnol. 25, 803-816 (2007).
- Michalska, A. E. Isolation and propagation of mouse embryonic fibroblasts and preparation of mouse embryonic feeder layer cells. Current protocols in stem cell biology. Chapter 1, Unit1C 3 (2007).
- Hough, S. R., Laslett, A. L., Grimmond, S. B., Kolle, G., Pera, M. F. A continuum of cell states spans pluripotency and lineage commitment in human embryonic stem cells. PLoS One. 4, e7708 (2009).
- Filipczyk, A. A., Laslett, A. L., Mummery, C., Pera, M. F. Differentiation is coupled to changes in the cell cycle regulatory apparatus of human embryonic stem cells. Stem Cell Res. 1, 45-60 (2007).
- Polanco, J. C., Ho, M. S. H., Wang, B., Zhou, Q., Wolvetang, E., Mason, E., Wells, C., Kolle, G., Grimmond, S. M., Bertoncello, I., O'Brien, C., Laslett, A. L. Identification of unsafe human IPSC lines using a robust surrogate assay for pluripotency. Stem Cells. 31 (8), 1498-1510 (2013).
- Sharpe, M. E., Morton, D., Rossi, A. Nonclinical safety strategies for stem cell therapies. Toxicol. Appl. Pharmacol. 262 (3), 223-231 (2012).
