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Biology

मोनोक्लोनल एंटीबॉडी टीजी30 और जीसीटीएम-2 का उपयोग करके सेल सरफेस एंटीजन का पता लगाकर मानव भ्रूणस्टेम कोशिकाओं का संवर्धन और शुद्धीकरण

Published: December 6, 2013 doi: 10.3791/50856
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1
1Materials Science and Engineering, CSIRO

Summary

हम सकारात्मक चयन का उपयोग कर जीवित मानव भ्रूणस्टेम कोशिकाओं (एचएससी) की पहचान और संवर्धन के लिए फ्लोरेसेंस सक्रिय सेल छंटाई (FACS) के माध्यम से सेल सतह एंटीजन के संयुक्त पता लगाने के लिए मोनोक्लोनल एंटीबॉडी TG30 (सीडी 9) और GCTM-2 के उपयोग का वर्णन करते हैं और मिश्रित कोशिका आबादी से एचईएससी को शुद्ध करने के लिए नकारात्मक चयन का उपयोग भी करते हैं।

Abstract

मानव भ्रूणस्टेम कोशिकाओं (hESC) स्वयं को विट्रो मेंअनिश्चित काल के लिए नवीनीकृत कर सकते हैं, और उचित संकेतों के साथ संभावित सभी दैहिक सेल वंश में अंतर करने के लिए प्रेरित किया जा सकता है । विभेदित एचएससी डेरिवेटिव संभावित रूप से प्रत्यारोपण चिकित्सा में इस्तेमाल किया जा सकता है सेल अपक्षयी रोगों की एक किस्म के इलाज के लिए । हालांकि, एचएससी विभेदन प्रोटोकॉल आमतौर पर विभेदित लक्ष्य और ऑफ-टारगेट सेल प्रकारों के साथ-साथ अवशिष्ट अविभेदित कोशिकाओं का मिश्रण उत्पीड करते हैं। प्रयोगशाला से क्लिनिक में विभेदित एचईएससी-डेरिवेटिव के अनुवाद के लिए, अविभेदित (pluripotent) और विभेदित कोशिकाओं के बीच भेदभाव करने में सक्षम होना महत्वपूर्ण है, और इन आबादी को अलग करने के तरीके उत्पन्न करते हैं। एचएसएससी-व्युत्पन्न दैहिक कोशिका प्रकारों के सुरक्षित अनुप्रयोग को केवल pluripotent स्टेम सेल मुक्त आबादी के साथ पूरा किया जा सकता है, क्योंकि अवशिष्ट एचईएससी प्रत्यारोपण के बाद टेराटोमा के रूप में जाना जाने वाले ट्यूमर को प्रेरित कर सकता है। इस उद्देश्य की ओर, यहां हम सकारात्मक चयन का उपयोग करके pluripotent TG30 हाय-जीसीटीएम-2 एचईएससी की पहचान के लिए फ्लोरीपॉसेंट टीजी30 हाई-जीसीटीएम-2एचईएससी की पहचान के लिए फ्लोरीपॉजिटेंस से जुड़े सेल सरफेस एंटीजन का पता लगाने के लिए एक मोनोक्लोनल एंटीबॉडी टीजी30 (सीडी9) और जीसीटीएम-2 के माध्यम से एक पद्धति का वर्णन करते हैं। हमारे TG30/GCTM-2 FACS पद्धति के साथ नकारात्मक चयन का उपयोग करना, हम बहुत प्रारंभिक चरण के भेदभाव (TG30 Neg-GCTM-2Neg)के दौर से गुजर आबादी में अविभेदित hESCs का पता लगाने और शुद्ध करने में सक्षम थे । एक और अध्ययन में, हमारे TG30/GCTM-2 FACS प्रोटोकॉल का उपयोग कर चयनित विभेदित TG30 Neg-GCTM-2Neg कोशिकाओं के pluripotent स्टेम सेल मुक्त नमूनों एक बार प्रतिरक्षा समझौता चूहों में प्रत्यारोपित teratomas फार्म नहीं किया, हमारे प्रोटोकॉल की मजबूती का समर्थन । दूसरी ओर, TG30/GCTM-2 FACS-समृद्ध pluripotent TG30 हाय-GCTM-2हाय hESCs के लगातार पासिंग उनके लिए स्वयं को प्रभावित नहीं किया विट्रो या उनके आंतरिक pluripotency में नवीनीकृत । इसलिए, हमारे TG30/GCTM-2 FACS पद्धति की विशेषताओं को भेदभाव परख के लिए इनपुट के रूप में एचपीएससी की अत्यधिक समृद्ध आबादी प्राप्त करने के लिए और व्युत्पन्न कोशिका आबादी से संभावित ट्यूमरजेनिक (या अवशिष्ट) एचएसएससी से छुटकारा पाने के लिए एक संवेदनशील परख प्रदान करते हैं ।

Introduction

एचपीएससी (एचपीएससी) में मानव भ्रूणीय स्टेम सेल (एचईएससी) और मानव प्रेरित प्लूइपोपेंट स्टेम सेल (एचपीएससी) शामिल हैं। एचपीएससी "pluripotency" के रूप में जाना जाता अपनी क्षमता को खोने के बिना उपयुक्त संस्कृति की स्थिति में अनिश्चित काल के लिए आत्म नवीनीकृत कर सकते हैं । Pluripotency एक कोशिका के लिए क्षमता के रूप में परिभाषित किया गया है अनिवार्य रूप से तीन भ्रूण रोगाणु कोशिका परतों में से प्रत्येक के कोशिकाओं प्रतिनिधि सहित किसी भी दैहिक सेल वंश में अंतर करने के लिए । एचपीएससी की उल्लेखनीय क्षमता चिकित्सीय विकल्पों सहित सेल-आधारित अनुप्रयोगों की एक बड़ी विविधता के लिए एक साधन प्रदान करती है। उदाहरण के लिए, कोशिका मृत्यु और पतन से जुड़े विकार हैं, जहां मानव शरीर में कोशिकाओं की सामान्य कार्यक्षमता से समझौता किया जाता है, जैसा कि दिल की विफलता, रीढ़ की हड्डी की चोटों, मधुमेह, पार्किंसंस रोग, कुछ कैंसर और अन्य नैदानिक विकृतियों में होता है। इन स्थितियों से पीड़ित रोगियों को प्रयोगशाला में एचपीएससी से प्राप्त स्वस्थ और कार्यात्मक दैहिक कोशिकाओं का प्रत्यारोपण करके संभावित रूप से इलाज किया जा सकता है । हालांकि, वर्तमान एचपीएससी भेदभाव प्रोटोकॉल 100% कुशल नहीं हैं और विभेदित लक्ष्य और ऑफ-टारगेट सेल प्रकारों का मिश्रण उत्पीड करते हैं, साथ ही अवशिष्ट एचपीएससी जो भेदभाव नहीं करते हैं, इसके बजाय स्वयं को नवीनीकृत करने के लिए जारी रखतेहैं 1-3। रोगियों में प्रत्यारोपण के लिए इरादा एचपीएससी-व्युत्पन्न दैहिक कोशिकाओं के एक नमूने में एचपीएससी की एक छोटी संख्या की उपस्थिति एक गंभीर नैदानिक जोखिम का गठन करती है क्योंकि इन कोशिकाओं को उनकी अंतर्निहित प्रकृति द्वारा सभी तीन भ्रूणीय रोगाणु परतों के ऊतकों के रूप में, संभवतः वीवो में एक प्रकार के ट्यूमर का रूप ले सकता है जिसे टेराटोमा के रूप में जाना जाता है। इसलिए, केवल लक्ष्य सेल आबादी pluripotent स्टेम सेल से मुक्त होने के लिए निर्धारित रोगियों में प्रत्यारोपण के लिए सुरक्षित माना जा सकता है । भेदभाव के बाद अवशिष्ट एचपीएससी के मिटाने को संभावित रूप से पूरा करने के लिए कई दृष्टिकोण ों की सूचना दी गई है, (समीक्षा के लिए पोलांको और लैलेट4देखें)। हमने पहले मोनोक्लोनल एंटीबॉडी टीजी 30 (सीडी 9) और जीसीटीएम-2 के उपयोग की सूचना दी है, जो प्लूसिपोटेंट स्टेम कोशिकाओं की पहचान करने और एचएससीलाइन5-7की संस्कृतियों में भेदभाव के प्रारंभिक चरण से गुजर रही कोशिकाओं से भेदभाव करने के लिए सक्रिय सेल छंटाई (FACS) के साथ मिलकर किया गया है।

कोशिका सतह एंटीजन का पता लगाने के लिए एंटीबॉडी का उपयोग करने का एक लाभ यह है कि लक्षित कोशिकाएं आमतौर पर एंटीबॉडी बाइंडिंग और/या लेबलिंग के बाद व्यवहार्य होती हैं । इसलिए, प्रत्यारोपण से पहले विस्तार और आगे के अनुप्रयोगों के लिए एंटीबॉडी लेबलिंग और पुनर्संस्कृति के बाद लक्षित कोशिकाओं को एकत्र किया जा सकता है। एचपीएससी पर व्यक्त सेल सतह एंटीजन के लिए एक चेतावनी यह है कि वे प्लुरिपोटेंट चरण के लिए अनन्य नहीं हैं और विकास के दौरान कई मामलों में अस्थायी रूप से फिर से व्यक्त किए जाते हैं और इसलिए कुछ विभेदित सेल प्रकारों में पता लगाया जाएगा। इसलिए, यदि उद्देश्य मानव pluripotent कोशिकाओं का पता लगाने और उन्हें एचपीएससी-व्युत्पन्न कोशिकाओं के एक नमूने से शुद्ध करने के लिए एंटीबॉडी का उपयोग करना है, तो चयनित एंटीबॉडी को प्रत्यारोपण के लिए इरादा विशिष्ट विभेदित कोशिका प्रकारों पर एंटीजन के साथ प्रतिक्रिया भी नहीं करनी चाहिए। दुर्भाग्य से, सीमित संख्या में एंटीबॉडी हैं जो लाइव एचपीएससी 4पर सेल सतह मार्कर का पता लगाते हैं, जिससे चयन के लिए विकल्प सीमित हो जाते हैं। इसके अलावा, कुछ अध्ययनों ने बताया है कि सभी एचपीएससी को खत्म करने के लिए एक एकल सेल-सरफेस मार्कर का पता लगाना पर्याप्त नहीं है, यह सुझाव देते हुए कि सभी एचपीएससी प्लूइटोटेंट उपआबादी को खत्म करने के किसी भी प्रयास को उन तरीकों पर निर्भर करना चाहिए जो एचपीएससी 9-10द्वारा व्यक्त विभिन्न एपिटोप का पता लगाने वाले दो या अधिक एंटीबॉडी का उपयोग करते हैं । जैसा कि ऊपर उल्लेख किया गया है, केवल एचपीएससी-व्युत्पन्न कोशिकाएं जिन्हें pluripotent स्टेम सेल-मुक्त सेल आबादी के रूप में निर्धारित किया जा सकता है, मानव प्रत्यारोपण के लिए उपयुक्त हैं। एक एंटीबॉडी-मध्यस्थता सेल छंटाई प्रौद्योगिकी के माध्यम से एक भी पास के साथ स्ट्रिंग के इस स्तर तक पहुंचने प्राप्त नहीं किया जा सकता है। विभेदित लक्ष्य कोशिकाओं की समृद्ध आबादी की पुनर्संस्कृति और सेल छंटाई के बाद के दौर निश्चित रूप से pluripotent स्टेम सेल मुक्त नमूने प्राप्त करने के लिए आवश्यक हो सकता है ।

हमारी प्रयोगशाला में, हमने लाइव प्लुरिपोटेंट कोशिकाओं का पता लगाने के लिए दो एचईएस सेल-सरफेस एंटीबॉडी, टीजी 30 (सीडी 9) और जीसीटीएम-2 की बड़े पैमाने पर विशेषता है। हमारे अध्ययनों से पता चला है कि टीजी 30 और जीसीटीएम-2 दोनों का संयुक्त पता लगाना एचईएससी लाइनों 5-7में विहित बहुलता से जुड़े जीन की अभिव्यक्ति से संबंधित है। TG30/GCTM-2 FACS इम्यूनोप्रोफिलिंग ने लगातार दिखाया है कि एचएसईसी संस्कृतियों TG30/GCTM-2 अभिव्यक्ति 5-7के एक मात्रात्मक सतत ढाल का गठन । हम मनमाने ढंग से इस TG30/GCTM-2 ढाल के भीतर कोशिकाओं की चार आबादी (पी) की स्थापना की है: P4 (TG30 Neg-GCTM-2Neg),P5(TG30 कम-GCTM-2कम),P6 (TG30मध्य-GCTM-2मिड)और P7 (TG30Hi-GCTM-2) Hi5-77 इन P4, P5, P6 और P7 सेल आबादी के हमारे लक्षण वर्णन से पता चला है कि P6 और P7 उपवर्वर्त बड़ी संख्या में pluripotency से जुड़े जीन व्यक्त करते है और कुशलता से स्टेम की तरह कालोनियों के रूप में जब faced के बाद FACS 2-3। दूसरी ओर, पी 4 (TG30 Neg-GCTM-2Neg)कोशिकाएं बड़ी संख्या में भेदभाव मार्कर व्यक्त करती हैं और अनायास विभेदित कोशिका प्रकारों का गठन करती हैं जो आमतौर पर एचएससी लाइनों 5-6की संस्कृतियों के विस्तार में होती हैं। हमने प्रारंभिक चरण के भेदभाव के बाद अवशिष्ट एचपीएससी के चयनात्मक उन्मूलन के लिए अपने टीजी 30/जीसीटीएम-2 FACS की क्षमता का परीक्षण करने का निर्णय लिया, और पूर्णीकृत स्टेम सेल आबादी के संवर्धन के लिए भी । नीचे वर्णित प्रोटोकॉल से पता चलता है कि कैसे इकट्ठा करने के लिए और पुनर्संस्कृति विभेदित P4 (TG30 Neg-GCTM-2Neg)कोशिकाओं के बाद FACS pluripotent P7 (TG30हाय-GCTM-2हाय)के मिटाने को पूरा करने के लिए । इसके अलावा, हम pluripotent P7 (TG30 हाय-GCTM-2हाय)कोशिकाओं के संग्रह और पुनर्संस्कृति की व्याख्या भी pluripotent कोशिकाओं की एक समृद्ध संस्कृति प्राप्त करने के लिए, जो बाद में संभावित दक्षता और भेदभाव परख की निरंतरता बढ़ाने के लिए एक परिभाषित इनपुट आबादी के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है ।

Protocol

मोनाश विश्वविद्यालय (मेलबोर्न) में स्टेमकोर सुविधा द्वारा प्रदान की गई एचईएससी-एमईए111 मानक थोक संस्कृतियों का उपयोग करके निम्नलिखित प्रोटोकॉल का प्रदर्शन किया गया था। इस सेल लाइन नियमित रूप से bFGF में मिटोटिक रूप से निष्क्रिय माउस भ्रूणीय फाइब्रोब्लास्ट (MEFs) की एक परत पर सुसंस्कृत है hESC पूरक/KOSR मीडिया7 और एंजाइमेटिक वियोजन (Collagenase) के साथ बनाए रखा है प्रत्येक 5-7 दिन8। 75 सेमी 2 (T75) फ्लास्क में ~ 80% की ढुलमुलता के लिए विकसित एचएससी संस्कृतियों का उपयोग इस प्रोटोकॉल के लिए इनपुट आबादी के रूप में कियाजाता है। नीचे वर्णित सभी सेल हेरफेर प्रक्रियाओं को हेपा-फ़िल्टर किए गए वर्ग II जैव सुरक्षा कैबिनेट में एसेप्टिक परिस्थितियों में किया जाना चाहिए।

TG30/GCTM-2 FACS परख प्रदर्शन करने से दो दिन पहले, T75 संस्कृति प्लेटें (धारा 1 में वर्णित) तैयार करें जो कोशिकाओं की पुनर्संस्कृति के लिए उपयोग की जानी हैं पोस्ट-FACS (धारा 4 में वर्णित) बरामद की गई हैं ।

1. एमईएफ की सीडिंग और एमईएफ-वातानुकूलित माध्यम की तैयारी

1.1 दिन -2: T75 फ्लास्क में एमईएफ की चढ़ाना

  1. प्रत्येक T75 फ्लास्क में 0.1% w/v जिलेटिन के पिपेट 10 मिलीलीटर और कोट सतह के लिए समान रूप से झुकाव।
  2. एक जैव बचाव कैबिनेट में कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए इनक्यूबेट ।
  3. जिलेटिन समाधान के रूप में।
  4. एक सेल कल्चर इनक्यूबेटर में 30 मिनट के लिए फ्लास्क और प्री-इक्विलिब्रेट में20 एमएल एमईएफ-मीडियम जोड़ें ।
  5. प्लेट ने निम्नलिखित घनत्व पर तैयार फ्लास्क (ओं) पर एमईएफ को कम से कम निष्क्रिय कर दिया। 1/3 एमईएफ घनत्व बीज 1.4 x 104 कोशिकाओं/सेमी2 (T75 = 1 x 106 MEFs) के लिए । पूर्ण घनत्व के लिए एमईएफ बीज 5.3 x 104 कोशिकाएं/सेमी2 (T75 = 4 x 106 MEFs)।

नोट: हम नियमित रूप से एमईएफ का उपयोग करते हैं जो γ-विकिरण द्वारा माइटोटेली रूप से निष्क्रिय थे। γ-विकिरणित एमईएफ तैयार करने के लिए एक प्रोटोकॉल मिचलस्का12में पाया जा सकता है।

  1. रात भर 37 डिग्री सेल्सियस/5% सीओ2 पर किरणित एमईएफ संस्कृतियों। 1/3 फ्लास्क को एमईएफ-मीडियम चेंज के बिना 1-4 दिनों के लिए इनक्यूबेटेड किया जा सकता है । इन फ्लास्क का उपयोग पोस्ट-एफएक्स कोशिकाओं (प्रोटोकॉल 4 के रूप में) के रिपलेटिंग के लिए किया जाता है। चरण 1.2 में नीचे के अनुसार सीएम उत्पन्न करने के लिए पूर्ण एमईएफ फ्लास्क को रातोंरात इनक्यूबेटेड किया जाता है।

1.2 दिन -1: एमईएफ-वातानुकूलित माध्यम (मुख्यमंत्री) की तैयारी

  1. पूर्ण MEF T75 फ्लास्क से MEF-मध्यम aspirate ।
  2. 5 एनजी/एमएल ह्यूमन एफजीएफ-2 प्रति टी75 फ्लास्क के साथ प्री-समतुल्य 25 एमएल एचईएससी/कोएसआर मीडियम सप्लीमेंट जोड़ें । 24 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस/5% सीओ2 पर इनक्यूबेट ।
  3. एक बाँझ ऊतक संस्कृति ट्यूब में MEF वातानुकूलित माध्यम (सीएम) ले लीजिए, हौसले से 10 एनजी के साथ पूरक सीएम/एमएल मानव FGF-2 और फिल्टर एक ०.२२ माइक्रोन माइक्रोन पॉलीएथर्सल्फोन फिल्टर का उपयोग कर ।
  4. अतिरिक्त मुख्यमंत्री का उत्पादन करने के लिए, एक सप्ताह के लिए एक ही एमईएफ संस्कृति पर दैनिक चरण 1.2.2 और 1.2.3 दोहराएं।

TG30/GCTM-2 परख प्रदर्शन के दिन, एमईएफ-मीडियम को सीएम के साथ 1/3 MEF T75 फ्लास्क में प्रतिस्थापित करें और नीचे वर्णित प्रक्रिया से बरामद किसी भी एचएससी या एचईएससी-डेरिवेटिव कोशिकाओं को सीडिंग करने से पहले कम से 30 मिनट के लिए पूर्व-समतुल्य । सीएम या तो ताजा इस्तेमाल किया जाता है या 2 सप्ताह तक के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जाता है। सीएम का उपयोग इस प्रोटोकॉल में किया जाता है क्योंकि हमारे हाथों में यह गैर-वातानुकूलित मीडिया (परिणाम नहीं दिखाए गए) की तुलना में कोशिकाओं के बाद FACS की व्यवहार्यता बढ़ाता है।

2. एक TG30/GCTM-2 FACS परख प्रदर्शन: एकल कोशिकाओं में एचएससी थोक संस्कृतियों का वियोजन

नोट: 4 डिग्री सेल्सियस पर 20% FBS/DMEM-F12 मध्यम प्रीचिल।

  1. एक सुसंस्कृत एचएससी लाइन के साथ दो T75 फ्लैक्स से HESC/KOSR मीडिया को आकांक्षी ।
  2. 10 मिलीलीटर डीपीबीएस और हटाने के लिए एस्पिरेट के साथ प्रत्येक T75 में कोशिकाओं कुल्ला।
  3. प्रत्येक T75 फ्लास्क में 3 मिलीलीटर ट्रिपल एक्सप्रेस वियोजन समाधान जोड़ें। 5 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस/5% सीओ2 पर इनक्यूबेट।
  4. कोशिकाओं का पूर्ण विघटन प्राप्त करने के लिए फ्लास्क के किनारे को टक्कर दें। माइक्रोस्कोप के नीचे जांच करें। यदि कोशिकाएं आसानी से उखाड़ नहीं फेंकती हैं, तो 37 डिग्री सेल्सियस/5% सीओ 2 पर एक और2-3मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
  5. प्रत्येक T75 फ्लास्क में 10 मिलीलीटर 20% FBS/DMEM-F12 (4 डिग्री सेल्सियस पर रखा गया) जोड़ें। एक बाँझ 10 मिलीलीटर पिपेट का उपयोग करके मुख्य रूप से एकल कोशिका निलंबन प्राप्त करने के लिए फ्लास्क दीवार के खिलाफ कई बार अलग कोशिकाओं को धीरे से त्रिकोणीय करें।
  6. 50 मिलीलीटर बाँझ पॉलीप्रोपाइलीन ट्यूब पर 70 माइक्रोन सेल छन्नी रखें। छलनी के माध्यम से दो T75 फ्लास्क से जमा एचएससी एकल सेल निलंबन को मजबूर करने के लिए एक बाँझ 10 मिलीलीटर पिपेट का उपयोग करें।
  7. सेल छलनी त्यागें, ट्यूब ढक्कन की जगह और 2 मिनट के लिए 1,000 x g पर पूल्ड एचएससी निलंबन अपकेंद्रित्र।
  8. सुपरनैंट को त्यागें और 10 मिलीलीटर 20% एफबीएस/डीएमईएम-एफ12 (4 डिग्री सेल्सियस पर प्रीचिल्ड) में गोली को धीरे से रीसस्ट करके कोशिकाओं को धोएं।
  9. 2 मिनट के लिए 1,000 x ग्राम पर एक दूसरा अपकेंद्रित्र प्रदर्शन करें।
  10. सुपरनैंट को त्यागें, 10 मिलीलीटर 20% एफबीएस/डीएमईएम-एफ12 (4 डिग्री सेल्सियस पर प्रीचिल्ड) जोड़ें और धीरे-धीरे कोशिकाओं को फिर से रखना। बर्फ पर 50 मिली ट्यूब रखें। इस ट्यूब का उपयोग नीचे वर्णित सॉर्ट सैंपल इम्यूनोस्टेपिंग प्रक्रिया के लिए किया जाएगा।
  11. हेमोटोसाइटोमीटर का उपयोग करके सेल नंबर काउंटिंग के लिए एचएसएससी सिंगल सेल सस्पेंशन (चरण 2.10) का 20 माइक्रोल लें। आपको प्रति T75 फ्लास्क 10-15 मिलियन कोशिकाओं की उपज की उम्मीद करनी चाहिए।

नोट: एफबीएस का उपयोग प्रोटोकॉल के इस हिस्से में सेल व्यवहार्यता पोस्ट-एफएक्स बढ़ाने के लिए किया जाता है।

3. सेल सरफेस एंटीजन टीजी30 और जीसीटीएम-2 की इम्यूनोफ्लोरेसेंट स्टेनिंग

  1. एलिकोट 150 माइक्रोल (~ 100,000 कोशिकाओं) एक एचएससी एकल सेल निलंबन (चरण 2.11 से) 1.5 मिलीलीटर की छह माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूबों में से प्रत्येक में। इन छह aliquots FACS मशीन पर परख जांचने के लिए आवश्यक धुंधला नियंत्रण के लिए इस्तेमाल किया जाएगा । शेष ~ 9 मिलीलीटर सेल निलंबन आपका सॉर्ट नमूना होगा जिसमें टेबल 1 और 2 के अनुसार टीजी 30 और जीसीटीएम-2 का पता लगाने के लिए अलग संस्कृति को सहस्तंपित किया जाएगा।
  2. 20% FBS/DMEM-F12 में प्राथमिक एंटीबॉडी की बाध्यकारी प्रतिक्रियाओं का प्रदर्शन करें । अंतिम प्रतिक्रिया की मात्रा सॉर्ट सैंपल के लिए ~ 9 मिलीलीटर और नियंत्रण के लिए 200 माइक्रोन होनी चाहिए। प्राथमिक एंटीबॉडी के रूप में आइसोटाइप नियंत्रण शामिल करें। बर्फ पर क्षैतिज ट्यूब रखें और एक कमाल के मंच पर 30 मिनट के लिए धीरे मिलाएं।
  3. 2 मिनट के लिए 1,000 x ग्राम पर सेंट्रलाइज प्राथमिक एंटीबॉडी प्रतिक्रियाएं।
  4. सुपरनैंट को त्यागें और 20 मिलीलीटर 20% FBS/DMEM-F12 (4 डिग्री सेल्सियस पर prechilled) में लेपलेट को फिर से खर्च करके कोशिकाओं को धोएं।
  5. 2 मिनट के लिए 1,000 x ग्राम पर एक दूसरी स्पिन प्रदर्शन करें।
  6. 20% FBS/DMEM-F12 में माध्यमिक एंटीबॉडी की बाध्यकारी प्रतिक्रियाओं प्रदर्शन करते हैं । अंतिम प्रतिक्रिया की मात्रा सॉर्ट सैंपल के लिए 2.5 मिलीलीटर और नियंत्रण के लिए 200 माइक्रोन होनी चाहिए। इस स्तर पर पीई-एंटी-माउस सीडी 90.2 रिएक्शन ट्यूब तैयार करें। बर्फ पर क्षैतिज ट्यूब रखें और एक कमाल के मंच पर 30 मिनट के लिए धीरे मिलाएं।

नोट: इस इनक्यूबेशन समय के दौरान, सीएम को इकट्ठा करना और धारा 1.2 की तरह सीएम के साथ 1/3 एमईएफ T75 फ्लास्क तैयार करना सुविधाजनक है।

  1. 2 मिनट के लिए 1,000 x ग्राम पर सेंट्रलाइज माध्यमिक एंटीबॉडी प्रतिक्रियाएं।
  2. सुपरनैंट को त्यागें और 20 मिलीलीटर 20% एफबीएस/डीएमईएम-एफ12 (4 डिग्री सेल्सियस पर प्रीचिल्ड) में गोली को फिर से खर्च करके कोशिकाओं को दो बार धोएं और नियंत्रण के लिए 200 माइक्रोन करें।
  3. बर्फ पर प्रत्येक धोने और जगह ट्यूबों के बाद 2 मिनट के लिए 1,000 x ग्राम पर एक स्पिन प्रदर्शन करते हैं।
  4. 0.3 माइक्रोग्राम/एमएल पर प्रोपिडियम आयोडाइड (पीआई) के साथ पूरक 20% एफबीएस/डीएमईएम-एफ12 में सुपरनेटेंट और रिसिपेंड सेल छर्रों को त्यागें। सॉर्ट सैंपल के लिए 2-3 मिलीलीटर और नियंत्रण के लिए 300 माइक्रोन का उपयोग करें।

नोट: असंरंजित कोशिकाओं के साथ नियंत्रण ट्यूब में पीआई न जोड़ें।

  1. 35 माइक्रोम ढक्कन सेल छलनी के माध्यम से प्रत्येक व्यक्तिगत सेल निलंबन को मजबूर करने के लिए एक P1000 माइक्रोपिपेट का उपयोग करें, 5 मिलीलीटर ट्यूब पॉलीस्टीरिन राउंड बॉटम टेस्ट ट्यूब के साथ मिलकर।
  2. छलनी ढक्कन पर अवशिष्ट सेल निलंबन के माध्यम से बल के लिए 50 ग्राम/
  3. ट्यूबों के किनारों को टैप करके, और बर्फ पर रखें, प्रत्येक एकल कोशिका निलंबन को फिर से खर्च करें। आपकी कोशिकाएं अब FACS के लिए तैयार हैं। कृपया सीधे आगे बढ़ें।

4. 75 सेमी 2 (T75) फ्लास्क में TG30/GCTM-2 उप-उल्लंघन कोशिकाओं के बादFACS संस्कृति

  1. हमने पहले बताया है कि टीजी 30/जीसीटीएम-2 इम्यूनोप्रोफिलिंग 7 के लिए एक FACS मशीन कैसेस्थापितकी जाती है । प्रक्रिया व्यवहार्य एकल hESCs की वसूली की अनुमति देता है, MEFs से मुक्त है, और P4 के फाटकों के भीतर (TG30 Neg-GCTM-2Neg),P5(TG30 कम-GCTM-2कम),P6 (TG30मध्य-GCTM-2मध्य)और P7 (TG30Hi-GCTM-2Hi)-चित्रा 1Eदेखें । टीजी 30/जीसीटीएम-2 FACS के लिए FACS मशीन की स्थापना के रूप में हमारी पिछली रिपोर्ट में सेल घटाव अगले इस्तेमाल किया जा वसूली के लिए ।
  2. FACS मशीन से कोशिकाओं को इकट्ठा करने से पहले दो 5 मिलीलीटर पॉलीस्टीरिन राउंड बॉटम टेस्ट ट्यूब में से प्रत्येक में चरण 1.2 के रूप में तैयार 1 मिलीलीटर सीएम जोड़ें। बर्फ पर रखें।
  3. विभेदित पी 4 (TG30 Neg-GCTM-2Neg)और pluripotent P7 (TG30Hi-GCTM-2हाय)से प्रत्येक ४००,० कोशिकाओं को ठीक करें TG30/GCTM-2 FACS का उपयोग कर सेल घटाव ।
  4. 5 मिनट के लिए 1,000 x ग्राम पर संग्रह ट्यूबों को सेंट्रलाइज करें।
  5. सुपरनेटेंट को आकांक्षी करें। एक P1000 माइक्रोपिपेटर का उपयोग कर प्रत्येक सेल गोली को फिर से खर्च करने के लिए 1 मिलीलीटर आवश्यकता 37 डिग्री सेल्सियस/5% सीओ2 सेमी जोड़ें। सेमी के साथ एक पूर्व-समतुल्य 1/3 MEF T75 फ्लास्क पर प्रत्येक अंश के लिए कोशिकाओं को बीज (चरण 1.2 के अनुसार तैयार)
  6. एक सेल कल्चर इनक्यूबेटर में24 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस/5% सीओ 2 पर कल्चर ।
  7. सीएम दैनिक aspirate और हौसले से तैयार मुख्यमंत्री के साथ बदलें (के रूप में कदम १.२ में) लगभग दो सप्ताह के लिए । pluripotent P7 की संस्कृतियों(TG30 हाय-GCTM-2हाय)कोशिकाओं को एक सप्ताह के बाद मानव स्टेम की तरह कालोनियों दिखाने के लिए और 9-11 दिनों में ~८०% पूर्णिदान तक पहुंचने । P4 की संस्कृतियों (TG30 Neg-GCTM-2Neg)कोशिकाओं को ज्यादातर फाइब्रोब्लास्ट की तरह कोशिकाओं के एक लॉन के रूप में विकसित होता है कि 11-13 दिनों में योग्यता तक पहुंचता है । इस स्तर पर, यदि आवश्यक हो, P4 और P7 सेल संस्कृतियों TG30/GCTM-2 FACS के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है या तो P4 या P7 उपशवर्तन के लगातार पुनर्संस्कृति मध्यस्थता (आंकड़े 2 और 3देखें) ।

Representative Results

एचईएससी-डेरिवेटिव जो pluripotent स्टेम सेल-मुक्त हैं, पी 4 (टीजी 30 एनईजी-जीसीटीएम-2एनईजी)उप-उल्लंघन से कोशिकाओं की लगातार पासिंग द्वारा प्राप्त किए जा सकते हैं।

पिछली रिपोर्टों में यह स्थापित किया गया है कि एचईएससी मानक संस्कृतियों में उपजनसंख्याओं का मिश्रण एक साथ मौजूद है जो बहुलपोता5,6,13से जुड़े जीनों की अभिव्यक्ति ढाल का प्रदर्शन करता है । टीजी 30 (सीडी 9) और जीसीटीएम-2 जैसे सेल सतह एंटीजन का संयुक्त पता लगाना प्लूइपेंट चरण में कोशिकाओं के कई सबसेट के भेदभाव और प्रारंभिक भेदभाव के विभिन्न चरणों में अनुमति देता है, जैसा कि स्टेम सेल मार्कर और वंश विशिष्ट प्रतिलेखन कारकों की उनकी अभिव्यक्ति द्वारा इंगित किया गयाहै 5,6,13। पिछली रिपोर्टों के साथ समझौते में, हम इस अध्ययन(चित्रा)के लिए इस्तेमाल किया HESC-MEL1 लाइन में P4 (TG30 Neg-GCTM-2Neg),P5 (TG30कम-GCTM-2कम),P6 (TG30मिड-GCTM-2मिड)और P7 (TG30Hi-GCTM-2Hi)कोशिकाओं के साथ भेदभाव करने में सक्षम थे । इस परिणाम के साथ, हम विभेदित P4 (TG30 Neg-GCTM-2Neg)कोशिकाओं और pluripotent P7 (TG30हाय-GCTM-2हाय)कोशिकाओं को नीचे वर्णित अध्ययनों में आगे की संस्कृति के लिए इकट्ठा करने के लिए रवाना हुए ।

हमने जांच की कि क्या एक नकारात्मक चयन दृष्टिकोण का उपयोग करके हम बहुत प्रारंभिक चरण के भेदभाव (TG30 Neg-GCTM-2Neg)के दौर से गुजर सेल आबादी से अविभेदित एचईसी शुद्ध करसकते हैं। हमने पी 4 (TG30Neg-GCTM-2Neg)कोशिकाओं की एक परिभाषित संख्या का उपयोग किया जो लगभग दो सप्ताह तक लगातार संस्कारी पोस्ट-FACS(चित्रा 2A)थे, और प्रत्येक मार्ग पर रिपीट करने से पहले TG30/GCTM-2 FACS का उपयोग करके पुनर्विश्लेषित किया गया । परिणामों से पता चला है कि P4-subfraction TG30Negके लिए समृद्ध-GCTM-2Neg लगातार पासेजिंग के बाद सेल प्रकार विभेदित, और P7 की एक छोटी सी उपस्थिति (TG30 हाय-GCTM-2हाय)प्रारंभिक मार्ग पर कोशिकाओं(चित्रा 2A,मार्ग 1) अंततः आगे पासेज के बाद गायब हो गया, pluripotent स्टेम सेल मुक्तनमूने (चित्रा 2,पैसेज 3) ।

pluripotent hESC कोशिकाओं के संवर्धन कोशिकाओं TG30 हाय-GCTM-2 हायकोशिकाओं के संग्रह से प्राप्त किया जा सकता है ।

इस परख का उपयोग करके पिछली टिप्पणियों के आधार पर, हम P7 (TG30Hi-GCTM-2Hi)कोशिकाओं को एकत्र करके pluripotent hESCs के संवर्धन की उम्मीद करेंगे जो एचएससी उपनिवेश ों का गठन करना चाहिए। इसलिए, हमने TG30/GCTM-2 FACS-मध्यस्थता करते हुए प्लेरिपोटेंटP7 (TG30 हाय-जीसीटीएम-2हाय)कोशिकाओं की लगातार पासिंग की । इन P7 संस्कृतियों में, TG30/GCTM-2 FACS इम्यूनोप्रोफिलिंग प्रत्येक मार्ग पर कोशिकाओं को replating से पहले किया गया था और केवल P7 (TG30 हाय-GCTM-2हाय)कोशिकाओं को पुनः रीकल्चर किया गया । इस तरह, हमने देखा कि अधिकांश कोशिकाएं प्लुरिपोटेंसी (पी 6 और पी 7) से जुड़े उप-उल्लंघनों में स्थित थीं, जो pluripotent कोशिकाओं के संवर्धन का संकेत देती हैं, जिसने पी 4 (टीजी 30 नेग-जीसीटीएम-2नेग)कोशिकाओं(चित्रा 3ए)का एक छोटा प्रतिशत उत्पन्न करने की क्षमता को भी बनाए रखा। इसके अलावा, P7 कोशिकाओं की संस्कृतियों ने पासएजिंग(चित्रा 3B)के दौरान बड़ी संख्या में एचएससी जैसी कॉलोनियों को दिखाया, जो प्लुरिपेंसी राज्य के रखरखाव का भी संकेत देता है।

Figure 1
चित्रा 1. TG30/GCTM-2 FACS उप उल्लंघन प्राप्त करने के लिए प्रतिनिधि छंटाई रणनीति । (ए): अलग-अलग एचईएस सेल निलंबन को एकल कोशिकाओं और संभावित झुरमुट या डबल्स को ऊंचाई और क्षेत्र (एफएससी-एच और एफएससी-ए) के लिए आगे के तितर-बितर के साथ हल किया जाता है। (ख): एफएससी-ए और एसएससी-ए के साथ संभावित मलबे को हटा दिया जाता है, और केवल बरकरार कोशिकाओं को आगे हल किया जाता है। (ग): प्रोविडियम आयोडाइड (पीआई) फ्लोरेसेंस (एफएससी-ए और FL3-A) के आधार पर गैर-व्यवहार्य कोशिकाओं को बाहर रखा गया है। (घ): एमईएफ फीडर कोशिकाओं को माउस CD90.2-पीई (FL2-A और एसएससी-ए) की अभिव्यक्ति के आधार पर नकारात्मक चयन द्वारा बाहर किया गया था। (ई): एमईएफ फीडरों से मुक्त पृथक व्यवहार्य एचएससी अंश, अंततः पी 4 (टीजी 30 नेग-जीसीटीएम-2एनईजी),पी5 (टीजी 30कम-जीसीटीएम-2कम),पी 6 (टीजी 30मिड-जीसीटीएम-2मिड),और पी 7 (टीजी30हाय-जीसीटीएम-2एचआई)सबपॉपुलेशन में आंशिक है। नकारात्मक गेट (TG30 Neg-GCTM-2Neg,P4 नाम) अन दाग कोशिकाओं के लिए पृष्ठभूमि ऑटोफ्लोरेसेंस के अनुसार स्थापित किया गया था और यह भी आइसोटाइप नियंत्रण के लिए । (एफ): TG30/GCTM-2 प्रवाह साइटोमेट्री विश्लेषण के विशिष्ट विभिन्न गेटेड उपजनसंख्या का प्रतिशत। बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्रा 2। एनईएससी-एमई1 लाइन से अनायासविभेदित पी 4 (TG30 Neg-GCTM-2Neg)कोशिकाओं की लगातार संस्कृतियों के प्रतिनिधि। (ए): प्रतिनिधि TG30/GCTM-2 FACS भूखंडों कोशिकाओं के gated सबसेट दिखा (P4, P5, P6 और P7) TG30 और GCTM-2 सेल सतह मार्कर की पता चला अभिव्यक्ति के स्तर से भेदभाव किया । 400,000 एचएससी-डेरिवेटिव्स की प्रारंभिक आबादी पी 4 (टीजी 30एनईजी-जीसीटीएम-2एनईजी)इम्यूनोप्रोफिलिंग एचएसएससी-एमई1 लाइन की थोक संस्कृतियों से एकत्र की जाती है। इन P4 (TG30 Neg-GCTM-2Neg)कोशिकाओं को लगातार T75 फ्लास्क में एचएससी नवीकरण के लिए सहायक शर्तों में बाद FACS पारित कर रहे हैं, जब तक कि नरमी (11-13 दिन) तक पहुंचने । प्रत्येक मार्ग से पहले, TG30/GCTM-2 FACS केवल P4 (TG30 Neg-GCTM-2Neg)विभेदित सेल प्रकारों को इकट्ठा करने और पुनर्संस्कृति करने के लिए किया जाता है । (ख): विभेदित P4 के लॉन की विशिष्ट आकृतिविज्ञान (TG30 Neg-GCTM-2Neg)कोशिकाओं 14 दिनों के बाद । (ग): 14 दिनों के बाद देखी गई छिटपुट एचईएससी जैसी उपनिवेशों को केवल 1 मार्ग पर P4 (TG30 Neg-GCTM-2Neg)कोशिकाओं के लॉन के साथ देखा जाता है, जो पी 7 (TG30हाय-जीसीटीएम-2हाय)कोशिकाओं को दूषित करके उत्पन्न होने की संभावना है । स्केल बार = 200 माइक्रोन। बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 3
चित्र 3। P7 (TG30 हाय-GCTM-2हाय)एचएससी लाइनों से प्राप्त कोशिकाओं को लगातार अपने आंतरिक pluripotent गुणों को खोने के बिना पोस्ट-FACS पारित किया जा सकता है । प्रतिनिधि TG30/GCTM-2 FACS लगातार मार्ग के इम्यूनोप्रोफिलिंग, कोशिकाओं के भेदभाव सबसेट दिखा (P4, P5, P6, और P7) TG30 और GCTM-2 की अभिव्यक्ति के स्तर के अनुसार । (क): P7 (TG30 हाय-GCTM-2 हाय) विशेषताओंदिखा 400,000 कोशिकाओं की एकशुरुआतीआबादी hESC-MEL1 लाइन के थोक संस्कृतियों से प्राप्त किया जाता है। Pluripotent P7 (TG30 हाय-GCTM-2हाय)कोशिकाओं को लगातार बाद-FACS T75 फ्लास्क में hESC नवीकरण के लिए सहायक शर्तों में पारित कर रहे हैं, जब तक ~८०% पूर्णता (9-11 दिन) तक पहुंचने । TG30/GCTM-2 FACS इम्यूनोप्रोफिलिंग प्रत्येक मार्ग पर कोशिकाओं को replating से पहलेकिया जाता है और केवल theP7 (TG30 हाय-GCTM-2हाय)कोशिकाओं को पुनः र्ल्ड किया जाता है । परिणाम बताते हैं कि P7 (TG30 Hi-GCTM-2हाय)कोशिकाएं बाद में पासेजिंग के साथ अपनी बहुलोपंत विशेषताओं का संरक्षण करती हैं, (TG30हाय-जीसीटीएम-2हाय)अभिव्यक्ति के संरक्षण सहित, एचएसएससी जैसी कालोनियों का गठन (बीमें दिखाया गया) और प्रत्येक एफएएफएस ढाल में विभेदित पी 4 (टीजी 30एनईजी-जीसीटीएम-2एनईजी)के एक छोटे से अंश के पुनर्पूंजीकरण से अनुमानित होने के रूप में अंतर करने की क्षमता को बनाए रखना। स्केल बार = 200 माइक्रोन। बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें।

नमूना (प्रतिक्रिया की मात्रा) प्राथमिक एंटीबॉडी माध्यमिक एंटीबॉडी पीई चूहा विरोधी माउस सीडी90.2 बी प्रोपिडियम आयोडाइड सी
सॉर्ट सैंपल (प्राथमिक एबीएस के लिए ~ 9 मिलीलीटर, माध्यमिक एबीएस के लिए 2.5 मिलीलीटर) (TG30 + GCTM-2) क वायु सेना 488 बकरी विरोधी माउस IgG2a + वायु सेना 647 बकरी विरोधी माउस IgM + +
नियंत्रण-1: TG30 (200 μl) टीजी30 वायु सेना 488 बकरी विरोधी माउस IgG2a - +
नियंत्रण-2: जीसीटीएम-2 (200 माइक्रोन) जीसीटीएम-2 वायु सेना 647 बकरी विरोधी माउस IgM - +
नियंत्रण-3: एंटी-माउस सीडी 90.2 (200 माइक्रोल) - - + +
नियंत्रण-4: फिकोरीथ्रिन (पीई) (200 माइक्रोन) माउस IgG2a आइसोटाइप आर-फाइकोरेरिथ्रिन बकरी विरोधी माउस IgG2a - +
नियंत्रण-5: माउस इम्यूनोग्लोबुलिन आइसोटाइप (200 माइक्रोन) माउस IgG2a आइसोटाइप + आईजीएम आइसोटाइप वायु सेना 488 बकरी विरोधी माउस IgG2a + वायु सेना 647 बकरी विरोधी माउस IgM - +
नियंत्रण-6: अन दागित कोशिकाएं (200 माइक्रोल) - - - -

तालिका 1. FACS छंटाई के लिए नमूना और नियंत्रण सॉर्ट करें। क सॉर्ट सैंपल टीजी30 और जीसीटीएम-2 एंटीबॉडी के साथ एक साथ इम्यूनोडाटांड है। ख पीई-एंटी-माउस सीडी 90.2 का उपयोग माउस कोशिकाओं को पहचानने और FACS14के दौरान एचईएससी से एमईएफ को हटाने के लिए किया जाता है। ग 0.3 माइक्रोग्राम/मिलीलीटर की अंतिम एकाग्रता पर प्रोपिडियम आयोडाइड का उपयोग करके गैर-व्यवहार्य कोशिकाओं को बाहर रखा जाता है। रिएजेंट जोड़ा (+), प्रतिक्रिया ट्यूब के लिए नहीं जोड़ा (-) ।

प्रतिपिंड मेज़बान आइसोटाइप काम कमजोर पड़ने
TG30 (1.4 मिलीग्राम/मिलीलीटर) चूहा इग्जी2ए 1:1,000
जीसीटीएम-2 (हाइब्रिडोमा सुपरनैंट) चूहा आईजीएम 1:5 ~ 1:10 एक
वायु सेना 488 बकरी विरोधी माउस IgG2a बकरा पॉलीक्लोनल 1:500
वायु सेना 647 बकरी विरोधी माउस IgM बकरा पॉलीक्लोनल 1:500
आर-फाइकोरीथ्रिंरिन (पीई) बकरी विरोधी माउस IgG2a बकरा पॉलीक्लोनल 1:1,000
विरोधी माउस सीडी90.2 मूषक इग्जी2बी 1:100
शुद्ध माउस IgG2a, ο Isotype नियंत्रण चूहा इग्जी2ए 1:200
शुद्ध माउस आईजीएम, आइटोटाइप नियंत्रण चूहा आईजीएम 1:200

तालिका 2. FACS छंटाई के लिए एंटीबॉडी विवरण और कमजोर पड़ने। एचएससी की कोशिका सतह पर जीसीटीएम-2 की बेहद उच्च अभिव्यक्ति के कारण इस एंटीबॉडी के साथ संतृप्ति तक पहुंचना संभव नहीं है। जीसीटीएम-2 हाइब्रिडोमा सुपरनेट के प्रत्येक बैच को पैमाने में एचईसी के साथ समान परिणाम प्राप्त करने और धुंधला होने से बचने के लिए एक मानक नियंत्रण या पिछले बैच के खिलाफ टिटैप किया जाना चाहिए।

माध्यम का नाम संयोजन
एचईएससी/कोसर माध्यम Dulbecco के संशोधित ईगल माध्यम: पोषक तत्व मिश्रण एफ-12 (DMEM/F-12) 20% नॉकआउट सीरम रिप्लेसमेंट (KOSR), 2 mM GlutaMAX के साथ पूरक, 1% एमईएम गैरसैंण अमीनो एसिड, 0.1 mm 2-Mercaptoethanol, 10 एनजी/एमएल मानव फाइब्रोब्लास्ट ग्रोथ फैक्टर 2 (FGF-2) और पेन/स्ट्रीप 1x पर ।
एमईएफ माध्यम Dulbecco के संशोधित ईगल माध्यम, उच्च ग्लूकोज (DMEM) 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS), 2 mM GlutaMAX, और कलम के साथ पूरक/

तालिका 3. संस्कृति मीडिया की संरचना।

Discussion

नैदानिक संदर्भ में, विभेदित दैहिक कोशिका प्रकार प्रत्यारोपण और चिकित्सीय अनुप्रयोगों के लिए अंतिम वांछित उत्पाद हैं, और एचपीएससी प्रयोगशाला में उन दैहिक कोशिकाओं या उनके जनकों को उत्पन्न करने के लिए एक आत्म-नवीनीकरण और स्केलेबल स्रोत हैं। टेराटोमा गठन के लिए एक अंतर्निहित क्षमता के साथ अवशिष्ट अविभेदित एचएससी की उपस्थिति रोगियों में प्रत्यारोपण के लिए एचएसएससी-व्युत्पन्न दैहिक कोशिकाओं पर विचार करते समय एक सुरक्षा जोखिम है। इस और सेल थेरेपी के साथ जुड़े अन्य जोखिमों की समीक्षा के लिए कृपया शार्प एट अल देखें। 16 इसलिए, ऐसे अनुप्रयोगों को महसूस करने के लिए, यह जरूरी है कि शोधकर्ताओं का लक्ष्य लक्ष्य सेल आबादी उत्पन्न करना है जो भी पूर्णपोटेंट स्टेम सेल-मुक्त हैं। इस उद्देश्य के लिए, हम यहां प्रदर्शित करते हैं कि हमारे TG30/GCTM-2 FACS पद्धति काउपयोग करके एक अंतर कोशिका आबादी में pluripotent कोशिकाओं (TG30 Hi-GCTM-2हाय)की उपस्थिति के लिए निगरानी करना संभव है और व्यवहार्य एचईएससी-विभेदित डेरिवेटिव प्राप्त करते हैं जिन्हें समृद्ध और बाद-FACS के बाद पुनर्संस्कृति की जा सकती है । यद्यपि हमारे प्रोटोकॉल के एक पास के साथ 100% बहुल स्टेम सेल-मुक्त नमूने प्राप्त करना संभव नहीं है, समृद्ध एचएससी-डेरिवेटिव को पुनर्संस्कृत किया जा सकता है और लगातार पासिंग के बाद 100% दैहिक-सेल शुद्धता हासिल की जाती है। विस्तार के बाद FACS के लिए दैहिक कोशिकाओं की प्रदर्शित व्यवहार्यता भी संभावित प्रत्यारोपण चिकित्सा के लिए उपयुक्त कोशिकाओं की पर्याप्त संख्या के उत्पादन के लिए अनुमति देता है ।

इस प्रायोगिक अध्ययन के उत्साहजनक परिणामों ने हमें कई मानव प्रेरित pluripotent स्टेम सेल (hiPSC) लाइनों15के साथ एक तुलनात्मक अध्ययन में हमारे TG30/GCTM-2 प्रोटोकॉल का उपयोग कर एक अधिक व्यापक जांच करने के लिए प्रेरित किया । उस अध्ययन में, हमने पाया कि हमारे TG30/GCTM-2 FACS प्रोटोकॉल का उपयोग कर प्राप्त pluripotent स्टेम सेल मुक्त नमूनों टेराटोमा उत्पन्न नहीं किया जब प्रतिरक्षा से वंचित चूहों में प्रत्यारोपित किया । इसलिए, हम आत्मविश्वास से कह सकते हैं कि इस इन विट्रो प्रोटोकॉल के उपयोग के साथ, प्रारंभिक चरण विभेदक कोशिका संस्कृतियों को pluripotent TG30 हाय-जीसीटीएम-2हाय कोशिकाओं से मुक्त होने के लिए निर्धारित वीवो मेंटेरेटामास विकसित नहीं करते हैं। यह दृढ़ता से हमारी परख की मजबूती का समर्थन करता है, नैदानिक अनुप्रयोगों में एचपीएससी-व्युत्पन्न कोशिकाओं के उपयोग से पहले टेराटोमा गठन के जोखिम को खत्म करने के लिए एक संभावित दृष्टिकोण प्रदान करता है।

इसके विपरीत, हम यह भी बताते है कि TG30/GCTM-2 FACS परख इन दो सतह एंटीजन (TG30 हाय-GCTM-2हाय)की अभिव्यक्ति के उच्च स्तर के साथ एक pluripotent सेल आबादी को पुनः प्राप्त करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । पिछले अध्ययनों से पता चला है कि TG30 हाय-GCTM-2हाय कोशिकाओं OCT4हाय अभिव्यक्ति के साथ सबसे अधिक संबंध प्रदर्शित करते है और hESC की तरह कालोनियों की सबसे अधिक संख्या के रूप में५,६,१३,१५। इसलिए हम कारण है कि pluripotency नेटवर्क TG30 हाय-GCTM-2हायव्यक्त कोशिकाओं में अपने अधिकतम स्तर पर सक्रिय है । हम मानते है कि हमारे TG30/GCTM-2 FACS प्रोटोकॉल काउपयोग कर और P7 (TG30 हाय-GCTM-2हाय)कोशिकाओं को पुनः प्राप्त करने के लिए समृद्ध लाइव hESC संस्कृतियों के बड़े पैमाने पर शुद्धि के लिए अनुमति दे सकता है, भेदभाव परख के लिए इनपुट के रूप में ।

अंत में, हम यहां एचएससी के शुद्ध और संवर्धन दोनों के लिए सतह एंटीजन TG30 और GCTM-2 की संयुक्त अभिव्यक्ति के आधार पर हमारे FACS परख की क्षमता प्रदर्शित करते हैं । एचपीएससी के निर्देशित भेदभाव के लिए प्रोटोकॉल के साथ भविष्य के अध्ययन भी इस क्षमता के बारे में जानकारीपूर्ण होने की संभावना है । हम जानते हैं कि कुछ परख में जहां विभेदित एचएससी-डेरिवेटिव टेम्पोरल एक्सप्रेस TG30 (CD9) या GCTM-2, इन दो एंटीबॉडी उचित या परख 6 में एक विशेष समय बिंदु पर एक विभेदितआबादीसे pluripotent कोशिकाओं शुद्ध करने के लिए पर्याप्त नहीं हो सकता है । इसलिए, उपन्यास एंटीबॉडी खोजने की एक आवश्यकता चल रही है जो कुछ विभेदित सेल प्रकारों के साथ क्रॉस-रिएक्शन की संभावित सीमा को दूर करने के लिए विशेष रूप से लाइव एचएससी को पहचानती है।

Disclosures

खुलासा करने के लिए कुछ नहीं ।

Acknowledgments

हम ईएसएश विश्वविद्यालय में एफएनकोर सुविधा को एचएससी लाइनों के प्रावधान और FACS सेवाओं के लिए मोनाश विश्वविद्यालय में फ्लोकोर सुविधा के लिए धन्यवाद देते हैं । इस काम को ऑस्ट्रेलियन स्टेम सेल सेंटर, न्यू साउथ वेल्स और विक्टोरियन गवर्नमेंट स्टेम सेल रिसर्च ग्रांट प्रोग्राम से सभी को रिसर्च ग्रांट का समर्थन मिला । सभी स्टेम सेल विज्ञान, स्टेम सेल ऑस्ट्रेलिया में ऑस्ट्रेलियाई अनुसंधान परिषद (एआरसी) विशेष अनुसंधान पहल के एक साथी अन्वेषक है ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM/F-12 Life Technologies 11320082 Long Name: Dulbecco's Modified Eagle Medium:Nutrient Mixture F-12
KOSR Life Technologies 10828028 Long Name: Knockout Serum Replacement
GlutaMAX Life Technologies 35050061 Long Name: GlutaMAX supplement
Nonessential Amino Acids Life Technologies 11140050 Long Name: MEM Nonessential Amino Acids Solution
Mercaptoethanol Life Technologies 21985023 Long Name: 2-Mercaptoethanol
DPBS Life Technologies 14190250 Long Name: Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline, no calcium, no magnesium
TrypLE Express Life Technologies 12604039 Long Name: TrypLE Express (1x), no Phenol Red
AF-488 Life Technologies A21131 Long Name: Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG2a
AF-647 Life Technologies A21238 Long Name: Alexa Fluor 647 goat anti-mouse IgM
PE-anti IgG2a Life Technologies P21139 Long Name: R-Phycoerythrin Goat Anti-Mouse IgG2a (γ2a) Conjugate
DMEM Life Technologies 11965-092 Long Name: Dulbecco's Modified Eagle Medium, high glucose
Pen/Strep Life Technologies 15140-122 Long Name: Penicillin-Streptomycin, Liquid
Distilled Water Life Technologies 15230-089. Long Name: Sterile Distilled Water
PI SIGMA P4864 Long Name: Propidium iodide solution
FBS SIGMA 12203C Long Name: Fetal Bovine Serum
Gelatin SIGMA G-1890 Long Name: Gelatin from porcine skin
Human FGF-2 Millipore GF003AF-100UG Long Name: Fibroblast Growth Factor basic, human recombinant, animal-free
Filter 0.22 μm Millipore SCGPU02RE Long Name: Stericup-GP, 0.22 μm, polyethersulfone, 250 ml, radio-sterilized
70 μm Cell Strainer Becton Dickinson 352350 Long Name: Cell strainer with 70 μm Nylon mesh
35 μm Lid cell strainer, 5 ml tube Becton Dickinson 352235 Long Name: 5 ml polystyrene round bottom test tube, with a cell strainer cap (35 μm)
5 ml Polystyrene round bottom test tube Becton Dickinson 352054 Long Name: 5 ml polystyrene round bottom test tube, sterile
IgG2a Isotype Control Becton Dickinson 554126 Long Name: Purified Mouse IgG2a, κ Isotype Control
IgM Isotype Control Becton Dickinson 553472 Long Name: Purified Mouse IgM, κ Isotype Control
PE-CD90.2 Becton Dickinson 553014 Long Name: PE Rat Anti-Mouse CD90.2
8-peaks calibration Becton Dickinson 559123 Long Name: Rainbow Calibration Particles (8 peaks)
50 ml sterile Polypropylene tube Greiner Bio-One 227261 Long Name: 50 ml Polypropylene tube with conical bottom, Sterile
T75 flask Greiner Bio-One 658175 Long Name: CELLSTAR Filter Cap Cell Culture 75 cm2 Flasks
TG30 Merck Millipore MAB4427 Long Name: TG30 Antibody, clone TG30
GCTM-2 Merck Millipore MAB4346 Long Name: GCTM-2 is not commercially available but TG343 and equivalent monoclonal antibody is
Table 4. List of materials and reagent
FACS machine Becton Dickinson FACSVantage SE with FACSDiva option
Inverted microscope Olympus IX71
Table 5. List of equipment.

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References

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स्टेम सेल जीव विज्ञान अंक 82 स्टेम सेल सेल सतह एंटीजन एंटीबॉडी FACS मिटाने स्टेम सेल भेदभाव प्लूप्यूटेंसी टेराटोमा मानव भ्रूण स्टेम सेल (एचएससी)
मोनोक्लोनल एंटीबॉडी टीजी30 और जीसीटीएम-2 का उपयोग करके सेल सरफेस एंटीजन का पता लगाकर मानव भ्रूणस्टेम कोशिकाओं का संवर्धन और शुद्धीकरण
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