Summary
Vi beskriver bruken av monoklonale antistoffer TG30 (CD9) og GCTM-2 for kombinert påvisning av celleoverflateantigener via fluorescensaktivert cellesortering (FACS) for identifisering og berikelse av levende humane embryonale stamceller (hESC) ved hjelp av positiv seleksjon og også bruk av negativt utvalg for å rense hESCer fra en blandet cellepopulasjon.
Abstract
Humane embryonale stamceller (hESC) kan selvfornye på ubestemt tid in vitro, og med de riktige signalene kan induseres for å skille seg ut i potensielt alle somatiske celleavstamninger. Differensierte hESC-derivater kan potensielt brukes i transplantasjonsterapier for å behandle en rekke celledegenerasjonssykdommer. HESC-differensieringsprotokoller gir imidlertid vanligvis en blanding av differensierte mål- og off-target celletyper, samt gjenværende uavklarte celler. For oversettelse av differensierte hESC-derivater fra laboratoriet til klinikken er det viktig å kunne diskriminere mellom uavklarte (pluripotente) og differensierte celler, og generere metoder for å skille disse populasjonene. Sikker påføring av hESC-avledede somatiske celletyper kan bare oppnås med pluripotente stamcellefrie populasjoner, da gjenværende hESCer kan indusere svulster kjent som teratomer etter transplantasjon. Mot dette formål beskriver vi her en metodikk for å oppdage pluripotens assosierte celleoverflateantigener med monoklonale antistoffer TG30 (CD9) og GCTM-2 via fluorescensaktivert cellesortering (FACS) for identifisering av pluripotente TG30Hi-GCTM-2Hi hESCs ved hjelp av positiv seleksjon. Ved å bruke negativt utvalg med vår TG30/GCTM-2 FACS-metodikk, kunne vi oppdage og rense udifferensierte HESCer i populasjoner som gjennomgår svært tidlig differensiering (TG30Neg-GCTM-2Neg). I en videre studie dannet ikke pluripotente stamcellefrie prøver av differensiert TG30Neg-GCTM-2Neg-celler valgt ved hjelp av vår TG30/GCTM-2 FACS-protokoll teratomer en gang transplantert til immunkompenserte mus, og støttet robustheten i protokollen vår. På den annen side påvirket TG30/GCTM-2 FACS-mediert påfølgende passivitet av beriket pluripotent TG30Hi-GCTM-2Hi hESCs ikke deres evne til selvfornyelse i vitro eller deres iboende pluripotens. Derfor gir egenskapene til vår TG30 / GCTM-2 FACS-metodikk en sensitiv analyse for å oppnå svært berikede populasjoner av hPSC som innganger for differensieringsanalyser og for å kvitte seg med potensielt tumorigogene (eller gjenværende) hESC fra derivatcellepopulasjoner.
Introduction
HPSC (hPSC) inkluderer humane embryonale stamceller (hESC) og menneskeskapte pluripotente stamceller (hIPSC). HPSC kan fornye seg selv på ubestemt tid under passende kulturforhold uten å miste evnen kjent som "pluripotency". Pluripotens er definert som potensialet for en celle å skille seg ut i i hovedsak enhver somatisk cellelinje, inkludert celler som er representative for hvert av de tre embryonale bakteriecellelagene. Det bemerkelsesverdige potensialet til hPSC gir et middel for et stort utvalg av cellebaserte applikasjoner, inkludert terapeutiske alternativer. For eksempel er det lidelser som involverer celledød og degenerasjon, hvor normal funksjonalitet av celler i menneskekroppen er kompromittert, som i hjertesvikt, ryggskader, diabetes, Parkinsons sykdom, noen kreftformer og andre kliniske patologier. Pasienter som lider av disse tilstandene kan potensielt bli behandlet ved å transplantere sunne og funksjonelle somatiske celler som er avledet fra hPSC i laboratoriet. Imidlertid er de nåværende hPSC-differensieringsprotokollene ikke 100% effektive og gir en blanding av differensierte mål- og off-target celletyper, samt gjenværende hPSCer som ikke har gjennomgått differensiering, i stedet fortsetter å fornye1-3. Tilstedeværelsen av selv et lite antall hPSC i et utvalg av hPSC-avledede somatiske celler beregnet for transplantasjon til pasienter utgjør en alvorlig klinisk risiko som disse cellene av deres iboende natur for å danne vev av alle tre embryonale bakterielag, kan potensielt danne in vivo en type svulst kjent som en teratoma. Derfor kan bare målcellepopulasjoner som er fast bestemt på å være fri for pluripotente stamceller, betraktes som trygge for transplantasjon til pasienter. Det er flere tilnærminger rapportert for å potensielt utføre rensing av gjenværende hPSCer etter differensiering, (for gjennomgang se Polanco og Laslett4). Vi har tidligere rapportert bruken av monoklonale antistoffer TG30 (CD9) og GCTM-2 koblet til fluorescensaktivert cellesortering (FACS) for å identifisere pluripotente stamceller og diskriminere dem fra celler som gjennomgår tidlig stadium av differensiering i kulturer avhESC-linjer 5-7.
En fordel med å bruke antistoffer for å oppdage celleoverflateantigener er at målcellene vanligvis er levedyktige etter antistoffbinding og/eller merking. Derfor kan målceller samles etter antistoffmerking og recultured for ekspansjon og videre applikasjoner før transplantasjon. En advarsel for celleoverflateantigener uttrykt på hPSC er at de ikke er eksklusive for pluripotentstadiet og i mange tilfeller uttrykkes timelig under utvikling og vil derfor bli oppdaget i noen differensierte celletyper. Derfor, hvis målet er å bruke antistoffer for å oppdage menneskelige pluripotente celler og rense dem fra en prøve av hPSC-avledede celler, bør utvalgte antistoffer ikke også reagere med antigener på de spesifikke differensierte celletypene beregnet for transplantasjon. Dessverre er det begrenset antall antistoffer som oppdager celleoverflatemarkører på live hPSCs 4, noe som gjør begrensede alternativer for valg. I tillegg har noen få studier påpekt at påvisning av en enkelt celleoverflatemarkør ikke er tilstrekkelig til å eliminere alle hPSC, noe som tyder på at ethvert forsøk på å eliminere alle hPSC pluripotente subpopulations bør stole på metoder som bruker to eller flere antistoffer som oppdager forskjellige epitoper uttrykt av hPSCs 9-10. Som nevnt ovenfor er bare hPSC-avledede celler som kan bestemmes som pluripotente stamcellefrie cellepopulasjoner egnet for menneskelig transplantasjon. Å nå dette nivået av strenghet kan ikke oppnås med en enkelt pass gjennom en antistoffmediert celle sorteringsteknologi. Rekultur av den berikede populasjonen av differensierte målceller og påfølgende runder med cellesortering kan være nødvendig for å definitivt få pluripotente stamcellefrie prøver.
I vårt laboratorium har vi i stor grad karakterisert to hES celleoverflate antistoffer, TG30 (CD9) og GCTM-2, for påvisning av levende pluripotente celler. Våre studier har vist at kombinert deteksjon av både TG30 og GCTM-2 sterkt korrelerer med uttrykket av kanoniske pluripotensrelaterte gener i hESC-linjer 5-7. TG30/GCTM-2 FACS immunoprofilering har konsekvent vist at hESC-kulturer utgjør en kvantitativ kontinuerlig gradient av TG30/GCTM-2 uttrykk 5-7. Vi har vilkårlig etablert fire populasjoner (P) av celler i denne TG30 / GCTM-2 gradient: P4 (TG30Neg-GCTM-2Neg), P5 (TG30Low-GCTM-2Low), P6 (TG30Mid-GCTM-2Mid) og P7 (TG30Hi-GCTM-2Hi) 5-7. Vår karakterisering av disse P4-, P5-, P6- og P7-cellepopulasjonene har vist at P6- og P7-subfraksjonene uttrykker et stort antall pluripotensrelaterte gener og effektivt danner stammelignende kolonier når de rekultureres etter FACS 2-3. På den annen side uttrykker P4-celler (TG30Neg-GCTM-2Neg) et stort antall differensieringsmarkører og utgjør de spontant differensierte celletypene som vanligvis forekommer i ekspanderende kulturer av hESC-linjer 5-6. Vi bestemte oss for å teste potensialet i vår TG30 / GCTM-2 FACS for selektiv eliminering av gjenværende hPSCer etter tidlig stadiumdifferensiering, og også for berikelse av pluripotente stamcellepopulasjoner. Protokollen beskrevet nedenfor viser hvordan du samler inn og rekulturerer differensiert P4 (TG30Neg-GCTM-2Neg) celler etter FACS for å oppnå rensing av pluripotent P7 (TG30Hi-GCTM-2Hi). Videre forklarer vi også innsamling og rekultur av pluripotente P7 (TG30 Hi-GCTM-2Hi) celler for å oppnå en beriket kultur av pluripotente celler, som senere kan brukes som en definert inngangspopulasjon for potensielt å øke effektiviteten og konsistensen av differensieringsanalyser.
Protocol
Følgende protokoll ble utført ved hjelp av hESC-MEL111 standard bulkkulturer levert av StemCore-anlegget ved Monash University (Melbourne). Denne cellelinjen er rutinemessig dyrket på et lag av mitotically inaktivert mus embryonale fibroblaster (MEFs) i bFGF supplert hESC / KOSR media7 og opprettholdes med enzymatisk dissosiasjon (Collagenase) hver 5-7 dager8. hESC-kulturer vokst til ~ 80% samløp i 75 cm2 (T75) kolber brukes som inngangspopulasjoner for denne protokollen. Alle cellemanipuleringsprosedyrene beskrevet nedenfor bør utføres under aseptiske forhold i et HEPA-filtrert biosikkerhetsskap i klasse II.
To dager før du utfører en TG30/GCTM-2 FACS-analyse, klargjør du T75-kulturplatene (beskrevet i avsnitt 1) som skal brukes til rekultur av celler gjenvunnet etter FACS (beskrevet i avsnitt 4).
1. Såing av MEFer og forberedelse av MEF-betinget medium
1.1 DAG -2: Plating av MEF-er i T75-kolber
- Pipette 10 ml 0,1% m/v gelatin i hver T75-kolbe og vipp til kappeoverflaten jevnt.
- Inkuber i 30 min ved romtemperatur i et biosikkerhetsskap.
- Aspirer gelatinoppløsning.
- Tilsett 20 ml MEF-medium i kolben og pre-likevekt til 37 °C/5 % CO2 i 30 minutter i en inkubator for cellekultur.
- Plate mitotically inaktivert MEFs på forberedt kolbe (er) ved følgende tettheter. For 1/3 MEF tetthetsfrø 1,4 x 104 celler/cm2 (T75 = 1 x 106 MEF-er). For mef-frø med full tetthet 5,3 x 104 celler/cm2 (T75 = 4 x 106 MEF-er).
Merk: Vi bruker rutinemessig MEFer som ble mitotically inaktivert av γ-bestråling. En protokoll for fremstilling av γ bestrålede MEFer finnes i Michalska12.
- Inkuberte bestrålede MEF-kulturer ved 37 °C/5 % CO2 over natten. 1/3 kolber kan inkuberes i 1-4 dager uten MEF-middels endring. Disse kolbeene brukes til replating av post-FACS celler (som i protokoll 4). Full MEF-kolber inkuberes over natten for å generere CM som per nedenfor i trinn 1.2.
1.2 DAG -1: Fremstilling av MEF-betinget medium (CM)
- Aspirer MEF-medium fra full-MEF T75 kolber.
- Tilsett forhåndsoverveid 25 ml hESC/KOSR medium supplert med 5 ng/ml human FGF-2 per T75-kolbe. Inkuber ved 37 °C/5 % CO2 i 24 timer.
- Samle MEF-betinget medium (CM) i et sterilt vevskulturrør, supplere CM med 10 ng/ml humant FGF-2 og filtrer med et 0,22 μm polyethersulfonfilter.
- For å produsere ekstra CM, gjenta trinn 1.2.2 og 1.2.3 daglig på samme MEF-kultur i en uke.
På dagen for å utføre en TG30/GCTM-2-analyse, erstatt MEF-medium i 1/3 MEF T75-kolber med CM og pre-likevekt i minst 30 minutter før såing av hESC- eller hESC-derivatceller gjenvunnet fra prosedyren som beskrevet nedenfor. CM brukes enten friskt eller oppbevares ved 4 °C i opptil 2 uker. CM brukes i denne protokollen som i våre hender det øker levedyktigheten til cellene post-FACS sammenlignet med ikke-betingede medier (resultater ikke vist).
2. Utføre en TG30/GCTM-2 FACS-analyse: Dissosiasjon av hESC bulkkulturer i enkeltceller
Merk: Prechill 20% FBS / DMEM-F12 medium ved 4 °C.
- Aspirer hESC/KOSR-mediene fra to T75-kolber med en kultivert hESC-linje.
- Skyll cellene i hver T75 med 10 ml DPBS og aspirer for å fjerne.
- Tilsett 3 ml TrypLE Express dissosiasjonsløsning i hver T75-kolbe. Inkuber ved 37 °C/5 % CO2 i 5 minutter.
- Støt på siden av kolber for å oppnå fullstendig løsrivelse av cellene. Sjekk under mikroskop. Hvis cellene ikke løsner lett, inkuberer du i ytterligere 2-3 min ved 37 °C/5 % CO2.
- Tilsett 10 ml 20% FBS/DMEM-F12 (oppbevart ved 4 °C) i hver T75-kolbe. Ved hjelp av en steril 10 ml pipette triturerer forsiktig de dissosierte cellene flere ganger mot kolbeveggen for å oppnå en overveiende enkeltcellet suspensjon.
- Plasser en 70 μm cellesil på et 50 ml sterilt polypropylenrør. Bruk en steril 10 ml pipette for å tvinge hESC enkeltcellede suspensjoner samlet fra de to T75-kolbeene gjennom silen.
- Kast cellesilen, bytt ut rørlokket og sentrifuger den samlede hESC-fjæringen på 1000 x g i 2 minutter.
- Kast supernatant og vask cellene forsiktig ved å resuspendere pelletsen i 10 ml 20% FBS / DMEM-F12 (prechilled ved 4 °C).
- Utfør en andre sentrifugering på 1000 x g i 2 min.
- Kast supernatant, tilsett 10 ml 20% FBS/DMEM-F12 (prechilled ved 4 °C) og trianturer forsiktig til resuspendceller. Legg 50 ml-røret på isen. Dette røret vil bli brukt til sorter prøveimmuniseringsprosedyren som er beskrevet nedenfor.
- Ta 20 μl av hESC encellet suspensjon (trinn 2.10) for cellenummertelling ved hjelp av et hemotocytometer. Du bør forvente et utbytte på 10-15 millioner celler per T75 kolbe.
Merk: FBS brukes i denne delen av protokollen for å øke celle levedyktigheten etter FACS.
3. Immunfluorescent Farging av celleoverflateantigener TG30 og GCTM-2
- Aliquot 150 μl (~100,000 celler) av en hESC encellet suspensjon (fra trinn 2.11) i hver av seks mikrocentrifuge rør på 1,5 ml. Disse seks aliquots vil bli brukt for farging kontroller som kreves for å kalibrere analysen på FACS-maskinen. Den resterende cellefjæringen på ~ 9 ml vil være sorteringsprøven der den dissosierte kulturen vil bli kostnadsbelagt for påvisning av TG30 og GCTM-2, i henhold til tabell 1 og 2.
- Utfør bindende reaksjoner av primære antistoffer i 20% FBS/DMEM-F12. Endelige reaksjonsvolumer skal være ~9 ml for sortprøven og 200 μl for kontrollene. Inkluder isotypekontroller som primære antistoffer. Plasser rørene horisontalt på isen og bland forsiktig i 30 min på en gyngeplattform.
- Sentrifuger primære antistoffreaksjoner ved 1000 x g i 2 min.
- Kast supernatant og vask cellene ved å resuspendere pellet i 20 ml 20% FBS / DMEM-F12 (prechilled ved 4 °C) for Sort Sample og 200 μl for kontrollene.
- Utfør et nytt spinn på 1000 x g i 2 minutter.
- Utfør bindende reaksjoner av sekundære antistoffer i 20% FBS/DMEM-F12. Endelige reaksjonsvolumer skal være 2,5 ml for sorteringsprøven og 200 μl for kontrollene. Klargjør PE-anti-mus CD90.2 reaksjonsrøret på dette stadiet. Plasser rørene horisontalt på isen og bland forsiktig i 30 min på en gyngeplattform.
Merk: I løpet av denne inkubasjonstiden er det praktisk å samle CM og forberede 1/3 MEF T75-kolber med CM som i avsnitt 1.2.
- Sentrifuge sekundære antistoffreaksjoner ved 1000 x g i 2 min.
- Kast supernatant og vask cellene TO GANGER ved å bruke pelletsen på nytt i 20 ml 20 % FBS/DMEM-F12 (forutbestemt ved 4 °C) for sorteringsprøven og 200 μl for kontrollene.
- Utfør et spinn på 1000 x g i 2 minutter etter hver vask og legg rør på is.
- Kast supernatanter og resuspendcellepellets i 20% FBS / DMEM-F12 supplert med propidiumjodid (PI) ved 0,3 μg / ml. Bruk 2-3 ml for sorter prøve og 300 μl for kontrollene.
Merk: IKKE legg PI til kontrollrøret med ubesatte celler.
- Bruk en P1000 mikropipette for å tvinge hver enkelt cellefjæring gjennom en 35 μm lokkcellesil, koblet til 5 ml rørpolystyren runde nedre reagensrør.
- Sentrifuge ved 50 g/min for å tvinge gjennom restcellefjæring på sillokkene.
- Resuspend hver enkelt celle suspensjon ved å trykke på sidene av rørene, og plasser på is. Cellene dine er nå klare for FACS. Fortsett med en gang.
4. Post-FACS Kultur av TG30/GCTM-2 Subfraksjonsceller i 75 cm2 (T75) Kolber
- Vi har tidligere rapportert hvordan du setter opp en FACS-maskin for TG30 / GCTM-2 immunoprofilering7. Prosedyren tillater gjenoppretting av levedyktige enkelt hESCer, fri for MEFer, og innenfor portene til P4 (TG30Neg-GCTM-2Neg), P5 (TG30Low-GCTM-2Low), P6 (TG30Mid-GCTM-2Mid) og P7 (TG30Hi-GCTM-2Hi) - se figur 1E. Sett opp FACS-maskinen for TG30/GCTM-2 FACS som i vår forrige rapport for å gjenopprette celledelfraksjonene som skal brukes videre.
- Tilsett 1 ml CM, fremstilt som i trinn 1.2, til hver av to 5 ml polystyren runde bunnreagensrør før du samler celler fra FACS-maskinen. Plasser på is.
- Gjenopprett 400 000 celler hver fra differensiert P4 (TG30Neg-GCTM-2Neg) og pluripotent P7 (TG30Hi-GCTM-2Hi) celledelbrudd ved hjelp av TG30/GCTM-2 FACS.
- Sentrifuger oppsamlingsrørene på 1000 x g i 5 min.
- Aspirer supernatantene. Tilsett 1 ml prequilibrated 37 °C/5% CO2 CM for å resuspendere hver cellepellet ved hjelp av en P1000 mikropipettor. Frø cellene for hver brøkdel på en forhåndslikevektet 1/3 MEF T75 kolbe med CM (tilberedt i henhold til trinn 1.2)
- Kultur ved 37 °C/5 % CO2 i 24 timer i en cellekulturinkubator.
- Aspirer CM daglig og erstatt med nytilberedt CM (som i trinn 1.2) i ca. to uker. Kulturer av pluripotente P7 (TG30Hi-GCTM-2Hi) celler viser menneskelige stammelignende kolonier etter en uke og når ~ 80% samløp på 9-11 dager. Kulturer av P4 (TG30Neg-GCTM-2Neg) celler vokser for det meste som en plen av fibroblastlignende celler som når samløp på 11-13 dager. På dette stadiet kan P4- og P7-cellekulturer om nødvendig brukes til TG30/GCTM-2 FACS mediert påfølgende rekultur av enten P4- eller P7-delfraksjoner (se figur 2 og 3).
Representative Results
hESC-derivater som er pluripotente stamcellefrie, kan oppnås ved påfølgende passaging av celler fra P4 (TG30Neg-GCTM-2Neg) subfraksjon.
Tidligere rapporter har fastslått at i hESC-standardkulturer sameksisterer en blanding av subpopulasjoner som viser en uttrykksgradient av gener forbundet med pluripotens5,6,13. Kombinert deteksjon av celleoverflateantigener som TG30 (CD9) og GCTM-2 muliggjør diskriminering av en rekke undergrupper av celler på pluripotentstadiet og på ulike stadier av tidlig differensiering, som angitt av deres uttrykk for stamcellemarkører og avstamningsspesifikke transkripsjonsfaktorer5,6,13. I samsvar med tidligere rapporter kunne vi diskriminere P4 (TG30Neg-GCTM-2Neg), P5 (TG30Low-GCTM-2Low), P6 (TG30Mid-GCTM-2Mid) og P7 (TG30Hi-GCTM-2Hi) celler i hESC-MEL1-linjen som brukes for denne studien (Figur 1). Med dette resultatet fortsatte vi å samle differensierte P4 (TG30Neg-GCTM-2Neg) celler og pluripotente P7 (TG30Hi-GCTM-2Hi) celler for videre kultur i studier beskrevet nedenfor.
Vi undersøkte om vi ved hjelp av en negativ seleksjonstilnærming kunne rense urealiserte HESCer fra cellepopulasjoner som gjennomgår svært tidlig differensiering (TG30Neg-GCTM-2Neg). Vi brukte et definert antall P4-celler (TG30Neg-GCTM-2Neg) som ble dyrket etter FACS (figur 2A) i omtrent to uker, og reanalysert ved hjelp av TG30/GCTM-2 FACS før replating ved hver passasje. Resultatene viste at P4-subfraksjonen beriket for TG30Neg-GCTM-2Neg differensierte celletyper etter påfølgende passivring, og en mindre tilstedeværelse av P7 (TG30Hi-GCTM-2Hi) celler ved første passasje (Figur 2A, Passasje 1) forsvant til slutt etter videre passiving, og ble pluripotente stamcellefrie prøver (Figur 2A, Passasje 3).
Berikelse av pluripotente hESC-celler kan oppnås vedinnsamling av cellene TG30 Hi-GCTM-2Hi-celler.
Basert på tidligere observasjoner ved hjelp av denne analysen, forventer vi en berikelse av pluripotente hESCer ved å samle P7 (TG30Hi-GCTM-2Hi) celler som skal danne hESC-kolonier. Derfor undersøkte vi også TG30/GCTM-2 FACS-mediert påfølgende passaging av pluripotente P7-celler (TG30Hi-GCTM-2Hi). I disse P7-kulturene ble TG30/GCTM-2 FACS immunprofilering utført før replating av celler vedhver passasje, og bare P7 (TG30 Hi-GCTM-2Hi)celler ble recultured. På denne måten observerte vi at flertallet av cellene var plassert i underbruddene forbundet med pluripotens (P6 og P7), noe som indikerer en berikelse av pluripotente celler som også opprettholdt en kapasitet til å skille og generere en liten prosentandel av P4 (TG30Neg-GCTM-2Neg) celler (Figur 3A). Videre viste kulturer av P7-celler et stort antall hESC-lignende kolonier under passivisering (figur 3B), som også indikerer vedlikehold av pluripotenstilstanden.
Figur 1. Representativ sorteringsstrategi for å oppnå TG30/GCTM-2 FACS-underfraksjoner. (A): Dissosierte hES-cellesuspensjoner sorteres som enkeltceller, og potensielle klumper eller dobler er inngjerdet med fremoverspredningen for høyde og areal (FSC-H og FSC-A). (B): Potensielt rusk fjernes med FSC-A og SSC-A, og bare intakte celler sorteres ytterligere. (F): Ikke-levedyktige celler er utelukket basert på propidiumjodid (PI) fluorescens (FSC-A og FL3-A). (D): MEF-materceller ble inngjerdet av negativt utvalg basert på uttrykk for mus CD90.2-PE (FL2-A og SSC-A). (E): Den isolerte levedyktige hESC-fraksjonen, fri for MEF-matere, er endelig fraksjonert i P4 (TG30Neg-GCTM-2Neg), P5 (TG30Low-GCTM-2Low), P6 (TG30Mid-GCTM-2Mid) og P7 (TG30Hi-GCTM-2Hi) underpopulasjoner. Den negative porten (TG30Neg-GCTM-2Neg, kalt P4) ble satt i henhold til bakgrunns autofluorescence for de unstained cellene og også til isotype kontroller. (F): Prosentandeler av de forskjellige inngjerdede subpopulasjonene som er typiske for en TG30/GCTM-2 strømningscytometrianalyse. Klikk her for å vise større figur.
Figur 2. Representative påfølgende kulturer av spontant differensierte P4 (TG30Neg-GCTM-2Neg) celler fra hESC-MEL1 linjen. (A): Representative TG30/GCTM-2 FACS-plott som viser inngjerdede delsett av celler (P4, P5, P6 og P7) diskriminert av nivået av påviste uttrykk for TG30- og GCTM-2-celleoverflatemarkører. En innledende befolkning på 400.000 hESC-derivater som viser P4 (TG30Neg-GCTM-2Neg) immunoprofilering er samlet inn fra bulkkulturer av hESC-MEL1-linjen. Disse P4-cellene (TG30Neg-GCTM-2Neg) passerer fortløpende etter FACS under forhold som støtter hESC-fornyelse i T75-kolber, til de når samløp (11-13 dager). Før hver passasje utføres TG30/GCTM-2 FACS for å samle inn og rekultur bare P4 (TG30Neg-GCTM-2Neg) differensierte celletyper. (B): Typisk morfologi av plenen av differensierte P4 (TG30Neg-GCTM-2Neg) celler etter 14 dager. (F): Sporadiske hESC-lignende kolonier sett etter 14 dager blandet med plenen av P4 (TG30Neg-GCTM-2Neg) celler ved passering 1 bare, er mest sannsynlig generert av forurensende P7 (TG30Hi-GCTM-2Hi) celler. Skalastang = 200 μm. Klikk her for å vise større figur.
Figur 3. P7 (TG30Hi-GCTM-2Hi) celler avledet fra hESC linjer kan følges fortløpende post-FACS uten å miste sine iboende pluripotente egenskaper. Representant TG30/GCTM-2 FACS immunoprofilering av de ulike påfølgende passasjene, som viser de diskriminerte undergruppene av celler (P4, P5, P6 og P7) i henhold til uttrykksnivået til TG30 og GCTM-2. (A): En startpopulasjon på 400 000 celler som viser P7 (TG30Hi-GCTM-2Hi)egenskaper hentes fra bulkkulturer i hESC-MEL1-linjen. Pluripotente P7-celler (TG30Hi-GCTM-2Hi) passerer fortløpende etter FACS under forhold som støtter hESC-fornyelse i T75-kolber, til de når ~ 80% samløp (9-11 dager). TG30/GCTM-2 FACS immunoprofilering utføres før replating celler ved hver passasje og bareP7 (TG30 Hi-GCTM-2Hi) celler er recultured. Resultatene viser at P7 (TG30 Hi-GCTM-2Hi) celler sparer sine pluripotente egenskaper med etterfølgende passivring, inkludert bevaring av (TG30Hi-GCTM-2Hi) uttrykk, danner hESC-lignende kolonier (vist i B) og opprettholder evnen til å skille som kan utledes fra recapitulation av en liten brøkdel av differensiert P4 (TG30Neg-GCTM-2Neg) i hver av FACS gradienter. Skalastang = 200 μm. Klikk her for å vise større figur.
| Prøve (reaksjonsvolum) | Primært antistoff | Sekundært antistoff | PE Rat antimus CD90.2 b | Propidiumjodid c |
| Sorter prøve (~9 ml for primære ABer, 2,5 ml for sekundære ABer) | (TG30 + GCTM-2) a | AF 488 geit anti-mus IgG2a + AF 647 geit antimus IgM | + | + |
| Kontroll-1: TG30 (200 μl) | TG30 | AF 488 geit anti-mus IgG2a | - | + |
| Kontroll-2: GCTM-2 (200 μl) | GCTM-2 | AF 647 geit anti-mus IgM | - | + |
| Kontroll-3: Anti-mus CD90.2 (200 μl) | - | - | + | + |
| Kontroll-4: Phycoerythrin (PE) (200 μl) | Mus IgG2a isotype | R-phycoerythrin geit antimus IgG2a | - | + |
| Kontroll-5: Mus Immunoglobulin isotype (200 μl) | Mus IgG2a isotype + IgM isotype | AF 488 geit anti-mus IgG2a + AF 647 geit antimus IgM | - | + |
| Kontroll-6: Ikke-inngrodde celler (200 μl) | - | - | - | - |
Tabell 1. Sorter eksempel og kontroller for FACS-sortering. a Sorter prøven immunostert samtidig med TG30 og GCTM-2 antistoffer. b PE-antimus CD90.2 brukes til å gjenkjenne museceller og fjerne MEFer fra HESCer under FACS14. c Ikke-levedyktige celler utelukkes ved hjelp av propidiumjodid ved en endelig konsentrasjon på 0,3 μg/ml. Reagens lagt til (+), ikke lagt (-) til reaksjonsrøret.
| antistoff | vert | Isotype | Fortynning av arbeid |
| TG30 (1,4 mg/ml) | mus | IgG2a | 1:1,000 |
| GCTM-2 (hybridoma supernatant) | mus | Igm | 1:5 – 1:10 a |
| AF 488 geit anti-mus IgG2a | geit | Polyklonal | 1:500 |
| AF 647 geit anti-mus IgM | geit | Polyklonal | 1:500 |
| R-phycoerythrin (PE) geit antimus IgG2a | geit | Polyklonal | 1:1,000 |
| CD90.2 for antimus | rotte | IgG2b | 1:100 |
| Renset mus IgG2a, κ Isotype-kontroll | mus | IgG2a | 1:200 |
| Renset muse-IgM, κ Isotype-kontroll | mus | Igm | 1:200 |
Tabell 2. Antistoffdetaljer og fortynning for FACS-sortering. a På grunn av det ekstremt høye uttrykket for GCTM-2 på celleoverflaten av hESCer er det ikke mulig å nå metning med dette antistoffet. Hver batch av GCTM-2 hybridoma supernatant må titreres mot en standardkontroll eller en tidligere batch for å oppnå lignende resultater med hESCer i skala og for å unngå overfarging.
| Navn på medium | komposisjon |
| hESC/KOSR-medium | Dulbecco's Modified Eagle Medium:Næringsblanding F-12 (DMEM/F-12) supplert med 20% knockout serumerstatning (KOSR), 2 mM GlutaMAX, 1% MEM Nonessential Amino Syrer, 0,1 mM 2-Mercaptoethanol, 10 ng/ml human fibroblast vekstfaktor 2 (FGF-2) og Penn/Strep ved 1x. |
| MEF-medium | Dulbecco's Modified Eagle Medium, high glucose (DMEM) supplert med 10% Fetal Bovine Serum (FBS), 2 mM GlutaMAX og Pen / Strep ved 1x. |
Tabell 3. Sammensetning av kulturmedier.
Discussion
I klinisk sammenheng er differensierte somatiske celletyper det endelige ønskede produktet for transplantasjon og terapeutiske anvendelser, og hPSC er en selvfornyende og skalerbar kilde for å generere de somatiske cellene eller deres forfedre i laboratoriet. Tilstedeværelsen av gjenværende undifferentiated hESCs med et iboende potensial for teratomadannelse er en sikkerhetsrisiko når man vurderer hESC-avledede somatiske celler for transplantasjon til pasienter. For en gjennomgang av dette og andre risikoer forbundet med celleterapi, vennligst se Sharpe et al. 16 Derfor, for å realisere slike applikasjoner, er det viktig at forskere tar sikte på å generere målcellepopulasjoner som også er pluripotente stamcellefrie. Mot dette formål demonstrerer vi her at ved hjelp av vår TG30 / GCTM-2 FACS-metodikk er det mulig å overvåke for tilstedeværelsen av pluripotente celler (TG30Hi-GCTM-2Hi) i en differensierende cellepopulasjon og oppnå levedyktige hESC-differensierte derivater som kan berikes og rekultureres etter FACS. Selv om det ikke er mulig å få 100% pluripotente stamcellefrie prøver med en enkelt pass av vår protokoll, kan berikede hESC-derivater recultured og etter påfølgende passaging oppnås 100% somatisk celle renhet. Den demonstrerte levedyktigheten til somatiske celler for ekspansjon etter FACS muliggjør også potensielt produksjon av tilstrekkelig antall celler egnet for potensielle transplantasjonsterapier.
De oppmuntrende resultatene av denne pilotstudien fikk oss til å utføre en mer omfattende undersøkelse ved hjelp av vår TG30 / GCTM-2-protokoll i en komparativ studie med flere menneskeskapte pluripotente stamcellelinjer (hiPSC)15. I den studien fant vi ut at pluripotente stamcellefrie prøver oppnådd ved hjelp av vår TG30/GCTM-2 FACS-protokoll ikke genererte teratomer når de transplanteres til immunberømte mus. Derfor kan vi trygt si at med bruk av denne in vitro-protokollen utvikler tidlig stadium differensieringscellekulturer som er fast bestemt på å være fri for pluripotent TG30Hi-GCTM-2Hi-celler ikke utvikler teratomer in vivo. Dette støtter sterkt robustheten til analysen vår, og gir en potensiell tilnærming for å eliminere risikoen for teratomadannelse før bruk av hPSC-avledede celler i kliniske applikasjoner.
Omvendt viser vi også at TG30 / GCTM-2 FACS-analysen kan brukes til å hente en pluripotent cellepopulasjon med høyt uttrykksnivå av disse to overflateantigenene (TG30Hi-GCTM-2Hi). Tidligere studier har vist atTG30 Hi-GCTM-2Hi-celler har den høyeste korrelasjonen med OCT4hi expression og danner det høyeste antallet hESC-lignende kolonier5,6,13,15. Vi er derfor grunnen til at pluripotensnettverket aktiveres på sitt maksimale nivå i TG30Hi-GCTM-2Hi som uttrykker celler. Vi anser at bruk av våre TG30/GCTM-2 FACS-protokoll og henting av P7 (TG30Hi-GCTM-2Hi)kan muliggjøre storskala rensing av berikede levende hESC-kulturer, som innganger til differensieringsanalyser.
Til slutt demonstrerer vi her potensialet i våre FACS-analyser basert på det kombinerte uttrykket av overflateantigener TG30 og GCTM-2 for både rensing og berikelse av hESCs. Fremtidige studier med protokoller for rettet differensiering av hPSCer vil sannsynligvis også være informative med hensyn til dette potensialet. Vi er klar over at i noen analyser der differensierte hESC-derivater midlertidig uttrykker TG30 (CD9) eller GCTM-2, kan disse to antistoffene ikke være passende eller tilstrekkelige til å rense pluripotente celler fra en differensiert populasjon på et bestemt tidspunkt i analysen6. Derfor er det et løpende behov for å finne nye antistoffer som spesifikt gjenkjenner levende hESCer for å overvinne den mulige begrensningen av kryssreaksjon med noen differensierte celletyper.
Disclosures
Ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Vi takker StemCore-anlegget ved Monash University for levering av hESC-linjer og FlowCore-anlegget ved Monash University for FACS-tjenester. Dette arbeidet ble støttet av forskningsstipend fra Australian Stem Cell Centre, New South Wales og Victorian Government Stem Cell Research Grant Program til ALL. ALL er partneretterforsker av Australian Research Council (ARC) Special Research Initiative i Stem Cell Science, Stem Cells Australia.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM/F-12 | Life Technologies | 11320082 | Long Name: Dulbecco's Modified Eagle Medium:Nutrient Mixture F-12 |
| KOSR | Life Technologies | 10828028 | Long Name: Knockout Serum Replacement |
| GlutaMAX | Life Technologies | 35050061 | Long Name: GlutaMAX supplement |
| Nonessential Amino Acids | Life Technologies | 11140050 | Long Name: MEM Nonessential Amino Acids Solution |
| Mercaptoethanol | Life Technologies | 21985023 | Long Name: 2-Mercaptoethanol |
| DPBS | Life Technologies | 14190250 | Long Name: Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline, no calcium, no magnesium |
| TrypLE Express | Life Technologies | 12604039 | Long Name: TrypLE Express (1x), no Phenol Red |
| AF-488 | Life Technologies | A21131 | Long Name: Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG2a |
| AF-647 | Life Technologies | A21238 | Long Name: Alexa Fluor 647 goat anti-mouse IgM |
| PE-anti IgG2a | Life Technologies | P21139 | Long Name: R-Phycoerythrin Goat Anti-Mouse IgG2a (γ2a) Conjugate |
| DMEM | Life Technologies | 11965-092 | Long Name: Dulbecco's Modified Eagle Medium, high glucose |
| Pen/Strep | Life Technologies | 15140-122 | Long Name: Penicillin-Streptomycin, Liquid |
| Distilled Water | Life Technologies | 15230-089. | Long Name: Sterile Distilled Water |
| PI | SIGMA | P4864 | Long Name: Propidium iodide solution |
| FBS | SIGMA | 12203C | Long Name: Fetal Bovine Serum |
| Gelatin | SIGMA | G-1890 | Long Name: Gelatin from porcine skin |
| Human FGF-2 | Millipore | GF003AF-100UG | Long Name: Fibroblast Growth Factor basic, human recombinant, animal-free |
| Filter 0.22 μm | Millipore | SCGPU02RE | Long Name: Stericup-GP, 0.22 μm, polyethersulfone, 250 ml, radio-sterilized |
| 70 μm Cell Strainer | Becton Dickinson | 352350 | Long Name: Cell strainer with 70 μm Nylon mesh |
| 35 μm Lid cell strainer, 5 ml tube | Becton Dickinson | 352235 | Long Name: 5 ml polystyrene round bottom test tube, with a cell strainer cap (35 μm) |
| 5 ml Polystyrene round bottom test tube | Becton Dickinson | 352054 | Long Name: 5 ml polystyrene round bottom test tube, sterile |
| IgG2a Isotype Control | Becton Dickinson | 554126 | Long Name: Purified Mouse IgG2a, κ Isotype Control |
| IgM Isotype Control | Becton Dickinson | 553472 | Long Name: Purified Mouse IgM, κ Isotype Control |
| PE-CD90.2 | Becton Dickinson | 553014 | Long Name: PE Rat Anti-Mouse CD90.2 |
| 8-peaks calibration | Becton Dickinson | 559123 | Long Name: Rainbow Calibration Particles (8 peaks) |
| 50 ml sterile Polypropylene tube | Greiner Bio-One | 227261 | Long Name: 50 ml Polypropylene tube with conical bottom, Sterile |
| T75 flask | Greiner Bio-One | 658175 | Long Name: CELLSTAR Filter Cap Cell Culture 75 cm2 Flasks |
| TG30 | Merck Millipore | MAB4427 | Long Name: TG30 Antibody, clone TG30 |
| GCTM-2 | Merck Millipore | MAB4346 | Long Name: GCTM-2 is not commercially available but TG343 and equivalent monoclonal antibody is |
| Table 4. List of materials and reagent | |||
| FACS machine | Becton Dickinson | FACSVantage SE with FACSDiva option | |
| Inverted microscope | Olympus | IX71 | |
| Table 5. List of equipment. | |||
References
- Pera, M. F., Tam, P. P. Extrinsic regulation of pluripotent stem cells. Nature. 10 (7299), 713-720 (2010).
- Pistollato, F., Bremer-Hoffmann, S., Healy, L., Young, L., Stacey, G. Standardization of pluripotent stem cell cultures for toxicity testing. Expert Opin. Drug Metab. Toxicol. 8 (2), 239-257 (2012).
- Miura, K., Okada, Y., Aoi, T., Okada, A., Takahashi, K., Okita, K., Nakagawa, M., Koyanagi, M., Tanabe, K., Ohnuki, M., et al. Variation in the safety of induced pluripotent stem cell lines. Nat. Biotechnol. 27 (8), 743-745 (2009).
- Polanco, J. C., Laslett, A. L. Safety Assessment of Reprogrammed Cells Prior to Clinical Applications: Potential Approaches to Eliminate Teratoma Formation. Pluripotent Stem Cells. Lenka, N. , InTech. (2013).
- Laslett, A. L., Grimmond, S., et al. Transcriptional analysis of early lineage commitment in human embryonic stem cells. BMC Dev. Biol. 7, 12 (2007).
- Kolle, G., Ho, M., et al. Identification of human embryonic stem cell surface markers by combined membrane-polysome translation state array analysis and immunotranscriptional profiling. Stem Cells. 27, 2446-2456 (2009).
- Zhou, Q., Chy, H., Laslett, A. L. Preparation of defined human embryonic stem cell populations for transcriptional profiling. Current protocols in stem cell biology. Chapter 1, Unit1B 7 (2010).
- Stem Cell Protocols - WiCell. , WiCell. Available from: http://www.wicell.org/home/support/stem-cell-protocols/stem-cell-protocols.cmsx (2013).
- Fong, C. Y., Peh, G. S., Gauthaman, K. Separation of SSEA-4 and TRA-1-60 labelled undifferentiated human embryonic stem cells from a heterogeneous cell population using magnetic-activated cell sorting (MACS) and fluorescence-activated cell sorting (FACS). Stem Cell Rev. 5, 72-80 (2009).
- Schriebl, K., Satianegara, G., et al. Selective removal of undifferentiated human embryonic stem cells using magnetic activated cell sorting followed by a cytotoxic antibody. Tissue Eng. Part A. 18, 899-909 (2012).
- Adewumi, O., Aflatoonian, B., et al. Characterization of human embryonic stem cell lines by the International Stem Cell Initiative. Nat. Biotechnol. 25, 803-816 (2007).
- Michalska, A. E. Isolation and propagation of mouse embryonic fibroblasts and preparation of mouse embryonic feeder layer cells. Current protocols in stem cell biology. Chapter 1, Unit1C 3 (2007).
- Hough, S. R., Laslett, A. L., Grimmond, S. B., Kolle, G., Pera, M. F. A continuum of cell states spans pluripotency and lineage commitment in human embryonic stem cells. PLoS One. 4, e7708 (2009).
- Filipczyk, A. A., Laslett, A. L., Mummery, C., Pera, M. F. Differentiation is coupled to changes in the cell cycle regulatory apparatus of human embryonic stem cells. Stem Cell Res. 1, 45-60 (2007).
- Polanco, J. C., Ho, M. S. H., Wang, B., Zhou, Q., Wolvetang, E., Mason, E., Wells, C., Kolle, G., Grimmond, S. M., Bertoncello, I., O'Brien, C., Laslett, A. L. Identification of unsafe human IPSC lines using a robust surrogate assay for pluripotency. Stem Cells. 31 (8), 1498-1510 (2013).
- Sharpe, M. E., Morton, D., Rossi, A. Nonclinical safety strategies for stem cell therapies. Toxicol. Appl. Pharmacol. 262 (3), 223-231 (2012).
