Summary
Vi beskriver användningen av monoklonala antikroppar TG30 (CD9) och GCTM-2 för kombinerad detektion av cell ytan antigener via fluorescens aktiverade cell sortering (FACS) för identifiering och berikning av levande mänskliga embryonala stamceller (hESC) med hjälp av positivt urval och även användning av negativa urval för att rensa hESCs från en blandad cell population.
Abstract
Mänskliga embryonala stamceller (hESC) kan självförnya på obestämd tid in vitro, och med lämpliga signaler kan induceras att differentiera till potentiellt alla somatiska celstammar. Differentierade hESC derivat kan potentiellt användas i transplantation terapier för att behandla en mängd olika cell-degenerativa sjukdomar. HESC-differentieringsprotokoll ger dock vanligtvis en blandning av differentierade mål- och off-target-celltyper samt återstående odifferentierade celler. För översättning av differentierade hESC-derivat från laboratoriet till kliniken är det viktigt att kunna skilja mellan odifferentierade (pluripotenta) och differentierade celler och generera metoder för att separera dessa populationer. Säker tillämpning av hESC-härledda somatiska celltyper kan endast uppnås med pluripotenta stamcellsfria populationer, eftersom resterande hESCs kan inducera tumörer som kallas teratomas efter transplantation. Mot denna ände beskriver vi här en metodik för att upptäcka pluripotens associerade cell ytan antigener med monoklonala antikroppar TG30 (CD9) och GCTM-2 via fluorescens aktiverad cell sortering (FACS) för identifiering av pluripotent TG30Hi-GCTM-2Hi hESCs med hjälp av positivt urval. Med hjälp av negativt urval med vår TG30/ GCTM-2 FACS-metodik kunde vi upptäcka och rensa odifferentierade hESCs i populationer som genomgår mycket tidig differentiering (TG30Neg-GCTM-2Neg). I en ytterligare studie, pluripotenta stamcellsfria prover av differentierade TG30Neg-GCTM-2Neg celler valda med hjälp av vår TG30/GCTM-2 FACS protokoll inte bilda teratomas en gång transplanteras till immun-komprometterade möss, stödja robustheten i vårt protokoll. Å andra sidan påverkade TG30/GCTM-2 FACS-medierad på varandra följande passande TG30Hi-GCTM-2Hi hESCs inte deras förmåga att förnya sig själv in vitro eller deras inneboende pluripotens. Egenskaperna hos vår TG30/GCTM-2 FACS-metod ger därför en känslig analys för att erhålla mycket berikade populationer av hPSC som indata för differentieringsanalyser och för att befria potentiellt tumörogena (eller kvarvarande) hESC från derivatcellpopulationer.
Introduction
HPSC (hPSC) omfattar mänskliga embryonala stamceller (hESC) och mänskliga inducerade pluripotenta stamceller (hIPSC). HPSC kan självförnya på obestämd tid under lämpliga kulturförhållanden utan att förlora sin förmåga som kallas "pluripotency". Pluripotens definieras som potentialen för en cell att differentiera till i huvudsak somatisk cell härstamning inklusive celler som är representativa för var och en av de tre embryonala könscellerna lager. Den anmärkningsvärda potentialen hos hPSC ger ett sätt för ett stort antal cellbaserade applikationer inklusive terapeutiska alternativ. Till exempel finns det störningar som involverar celldöd och degeneration, där normal funktionalitet hos celler i människokroppen äventyras, som vid hjärtsvikt, ryggmärgsskador, diabetes, Parkinsons sjukdom, vissa cancerformer och andra kliniska patologier. Patienter som lider av dessa tillstånd kan potentiellt behandlas genom transplantation av friska och funktionella somatiska celler som har härletts från hPSC i laboratoriet. De nuvarande hPSC-differentieringsprotokollen är dock inte 100% effektiva och ger en blandning av differentierade mål- och off-target-celltyper, liksom kvarvarande hPSCs som inte har genomgått differentiering, istället fortsätter att självförnya1-3. Förekomsten av även ett litet antal hPSC i ett urval av hPSC-härledda somatiska celler avsedda för transplantation till patienter utgör en allvarlig klinisk risk eftersom dessa celler av sin inneboende natur att bilda vävnader av alla tre embryonala könsceller lager, potentiellt kan bilda in vivo en typ av tumör som kallas teratom. Därför kan endast målcellspopulationer som är fast beslutna att vara fria från pluripotenta stamceller anses vara säkra för transplantation till patienter. Det finns flera metoder som rapporteras för att potentiellt åstadkomma rensning av kvarvarande hPSCs efter differentiering, (för granskning se Polanco och Laslett4). Vi har tidigare rapporterat användningen av monoklonala antikropparna TG30 (CD9) och GCTM-2 kopplade till fluorescensaktiverad cellsortering (FACS) för att identifiera pluripotenta stamceller och diskriminera dem från celler som genomgår tidigt differentieringsstadium i kulturer av hESClinjer 5-7.
En fördel med att använda antikroppar för att upptäcka cellytans antigener är att målcellerna vanligtvis är livskraftiga efter antikroppsbindning och/eller märkning. Därför kan målceller samlas in efter antikroppsmärkning och återkomma för expansion och ytterligare tillämpningar före transplantation. En varning för cellytans antigener uttryckta på hPSC är att de inte är exklusiva för pluripotentstadiet och i många fall återutförs tidsmässigt under utvecklingen och kommer därför att upptäckas i vissa differentierade celltyper. Om syftet är att använda antikroppar för att upptäcka mänskliga pluripotenta celler och rensa dem från ett prov av hPSC- härledda celler, bör därför utvalda antikroppar inte också reagera med antigener på de specifika differentierade celltyperna avsedda för transplantation. Tyvärr finns det ett begränsat antal antikroppar som detekterar cellytans markörer på levande hPSCs 4, vilket gör alternativen för val begränsade. Dessutom har några studier påpekat att detektion av en enda cell-ytmarkör inte är tillräckligt för att eliminera all hPSC, vilket tyder på att alla försök att eliminera alla hPSC pluripotenta subpopulationer bör förlita sig på metoder som använder två eller flera antikroppar som upptäcker olika epitoper uttryckta av hPSCs 9-10. Som nämnts ovan är endast hPSC-härledda celler som kan bestämmas som pluripotenta stamcellsfria cellpopulationer lämpliga för mänsklig transplantation. Att nå denna stränghetsnivå kan inte uppnås med ett enda pass genom en antikroppsmedierad cellsorteringsteknik. Rekultur av den berikade populationen av differentierade målceller och efterföljande omgångar av cellsortering kan krävas för att slutgiltigt erhålla pluripotenta stamcellsfria prover.
I vårt laboratorium har vi i stor utsträckning karakteriserat två hES cell-ytan antikroppar, TG30 (CD9) och GCTM-2, för påvisande av levande pluripotenta celler. Våra studier har visat att kombinerad detektion av både TG30 och GCTM-2 starkt korrelerar med uttrycket av kanoniska pluripotency-associerade gener i hESC linjer 5-7. TG30/GCTM-2 FACS immunoprofiling har konsekvent visat att hESC kulturer utgör en kvantitativ kontinuerlig lutning av TG30/GCTM-2 uttryck 5-7. Vi har godtyckligt etablerat fyra populationer (P) av celler inom denna TG30 / GCTM-2 lutning: P4 (TG30Neg-GCTM-2Neg), P5 (TG30Low-GCTM-2Low),P6 (TG30Mid-GCTM-2Mid) och P7 (TG30Hi-GCTM-2Hi) 5-7. Vår karakterisering av dessa P4-, P5-, P6- och P7-cellpopulationer har visat att P6- och P7-subfraktionerna uttrycker ett stort antal pluripotensrelaterade gener och effektivt bildar stamliknande kolonier när de återkom efter FACS 2-3. Å andra sidan uttrycker P4 -celler (TG30Neg-GCTM-2Neg)ett stort antal differentieringsmarkörer och utgör de spontant differentierade celltyper som vanligtvis förekommer i expanderande kulturer av hESC-linjer 5-6. Vi bestämde oss för att testa potentialiteten hos våra TG30/GCTM-2 FACS för selektiv eliminering av kvarvarande hPSCs efter tidig differentiering, och även för berikning av pluripotenta stamcellspopulationer. Protokollet som beskrivs nedan visar hur man samlar in och återkultur differentierade P4 -celler (TG30Neg-GCTM-2Neg)efter FACS för att utföra rensning av pluripotent P7 (TG30Hi-GCTM-2Hi). Dessutom förklarar vi också insamling och reculture av pluripotenta P7 (TG30Hi-GCTM-2Hi)celler för att få en berikad kultur av pluripotenta celler, som därefter kan användas som en definierad insatspopulation för att potentiellt öka effektiviteten och konsekvensen hos differentieringsanalyser.
Protocol
Följande protokoll utfördes med hESC-MEL111 standard bulkkulturer som tillhandahålls av StemCore-anläggningen vid Monash University (Melbourne). Denna cellinje odlas rutinmässigt på ett lager av mitotically inaktiverade mus embryonala fibroblaster (MEFs) i bFGF kompletteras hESC/KOSR media7 och upprätthålls med enzymatiska dissociation (Collagenase) varje 5-7 dagar8. hESC kulturer odlas till ~ 80% confluency i 75 cm2 (T75) flaskor används som insatspopulationer för detta protokoll. Alla cellmanipulationsförfaranden som beskrivs nedan bör utföras under aseptiska förhållanden i ett HEPA-filtrerat biosäkerhetsskåp av klass II.
Två dagar före utförandet av en TG30/GCTM-2 FACS-analys, bered T75-odlingsplattorna (beskrivna i avsnitt 1) som ska användas för återinrikning av celler som återvunnits efter FACS (beskrivs i avsnitt 4).
1. Sådd av mef och beredning av mef-konditionerat medium
1.1 DAG -2: Plätering av MEF i T75-flaskor
- Pipett 10 ml 0,1 % w/v gelatin i varje T75-kolv och luta för att täcka ytan jämnt.
- Inkubera i 30 minuter vid rumstemperatur i ett biosäkerhetsskåp.
- Aspirera gelatinlösning.
- Tillsätt 20 ml MEF-medium till kolven och förjämför till 37 °C/5 % CO2 i 30 minuter i en cellkulturinkubator.
- Plätera mitotiskt inaktiverade MIF på beredda kolvar med följande densitet. För 1/3 MEF-densitetsfrö 1,4 x 104 celler/cm2 (T75= 1 x 106 MEF). För mef-frö med full densitet 5,3 x 104 celler/cm2 (T75 = 4 x 106 MEF).
Obs: Vi använder rutinmässigt MEF: er som var mitotiskt inaktiverade γ-bestrålning. Ett protokoll för γ av γ-bestrålade MEF finns i Michalska12.
- Inkubera bestrålade MEF-kulturer vid 37 °C/5% CO2 över natten. 1/3 flaskorna kan inkuberas i 1-4 dagar utan MEF-medium byte. Dessa kolvar används för omcirning av post-FACS-celler (som i protokoll 4). Hela MEF-flaskor inkuberas över natten för att generera CM enligt nedan i steg 1.2.
1.2 DAG -1: Beredning av MEF-konditionerat medium (CM)
- Aspirera MEF-medium från full-MEF T75 flaskor.
- Tillsätt förjämfört 25 ml hESC/KOSR medium kompletterat med 5 ng/ml human FGF-2 per T75-kolv. Inkubera vid 37 °C/5% CO2 i 24 timmar.
- Samla MEF-konditionerat medium (CM) i ett sterilt vävnadskulturrör, komplettera CM med 10 ng/ml human FGF-2 och filtrera med ett 0,22 μm polyeterulfonfilter.
- Upprepa steg 1.2.2 och 1.2.3 dagligen om samma MEF-kultur i en vecka för att producera ytterligare CM.
På dagen för utförandet av en TG30/GCTM-2-analys, ersätt MEF-medium i 1/3 MEF T75-flaskor med CM och förjämvikt i minst 30 minuter innan du sår hESC- eller hESC-derivatceller som återvunnits från förfarandet enligt beskrivningen nedan. CM används antingen färskt eller förvaras vid 4 °C i upp till 2 veckor. CM används i detta protokoll som i våra händer det ökar livskraften hos cellerna post-FACS jämfört med icke-konditionerade medier (resultat visas inte).
2. Utföra en TG30/GCTM-2 FACS-analys: Dissociation av hESC BulkKulturer till enstaka celler
Obs: Prechill 20% FBS/DMEM-F12 medium vid 4 °C.
- Aspirera hESC/KOSR-mediet från två T75-flaskor med en odlad hESC-linje.
- Skölj cellerna i varje T75 med 10 ml DPBS och aspirera för att ta bort.
- Tillsätt 3 ml TrypLE Express dissociationslösning i varje T75-kolv. Inkubera vid 37 °C/5% CO2 i 5 min.
- Stöt på sidan av kolvarna för att få fullständig lossning av cellerna. Kontrollera under mikroskop. Om cellerna inte lätt lossar, inkubera i ytterligare 2-3 minuter vid 37 °C/5 % CO2.
- Tillsätt 10 ml 20 % FBS/DMEM-F12 (förvaras vid 4 °C) i varje T75-kolv. Använd en steril 10 ml pipett triturera försiktigt de dissocierade cellerna flera gånger mot kolvväggen för att uppnå en övervägande enkelcellig suspension.
- Placera en 70 μm cellsil på ett 50 ml sterilt polypropylenrör. Använd en steril 10 ml pipett för att tvinga hESC encellsupphängningar som poolas från de två T75-kolvarna genom silen.
- Kassera cellsilen, byt ut rörlocket och centrifugera den poolade hESC-fjädringen vid 1 000 x g i 2 minuter.
- Kassera supernatanten och tvätta cellerna genom att försiktigt återanvända pelleten i 10 ml 20% FBS/DMEM-F12 (förutbestämd vid 4 °C).
- Utför en andra centrifugering vid 1 000 x g i 2 min.
- Kassera supernatant, tillsätt 10 ml 20% FBS/DMEM-F12 (prechilled vid 4 °C) och triturera försiktigt till återanvända celler. Placera 50 ml-röret på is. Detta rör kommer att användas för det immunstainingförfarande för sortprov som beskrivs nedan.
- Ta 20 μl av hESC-encellsfjädringen (steg 2.10) för cellnummerräkning med hjälp av en hemotocytometer. Du bör förvänta dig en avkastning på 10-15 miljoner celler per T75-kolv.
FBS används i den här delen av protokollet för att öka cellens livskraft efter FACS.
3. Immunofluorescerande färgning av cellytans antigener TG30 och GCTM-2
- Alikvot 150 μl (~100 000 celler) av en hESC-encellsfjädring (från steg 2.11) till vart och ett av sex mikrocentrifugrör på 1,5 ml. Dessa sex alikvoter kommer att användas för de färgningskontroller som krävs för att kalibrera analysen på FACS-maskinen. Den återstående ~9 ml cellupphängningen kommer att vara ditt sorteringsprov där den dissocierade kulturen kommer att kostnadsbefrias för detektion av TG30 och GCTM-2, enligt tabellerna 1 och 2.
- Utför bindande reaktioner av primära antikroppar i 20% FBS/DMEM-F12. De slutliga reaktionsvolymerna bör vara ~9 ml för sorteringsprovet och 200 μl för kontrollerna. Inkludera isotypkontroller som primära antikroppar. Placera rören horisontellt på isen och blanda försiktigt i 30 minuter på en gungplattform.
- Centrifugera primära antikroppsreaktioner vid 1 000 x g i 2 min.
- Kassera supernatanten och tvätta cellerna genom att återanvända pelleten i 20 ml 20% FBS/DMEM-F12 (prechilled vid 4 °C) för sorteringsprovet och 200 μl för kontrollerna.
- Gör en andra snurr på 1000 x g i 2 min.
- Utför bindande reaktioner av sekundära antikroppar i 20% FBS/DMEM-F12. De slutliga reaktionsvolymerna bör vara 2,5 ml för sorteringsprovet och 200 μl för kontrollerna. Förbered reaktionsröret PE-anti-mouse CD90.2 i detta skede. Placera rören horisontellt på isen och blanda försiktigt i 30 minuter på en gungplattform.
Obs: Under denna inkubationstid är det bekvämt att samla CM och förbereda 1/3 MEF T75 flaskor med CM enligt avsnitt 1.2.
- Centrifugera sekundära antikroppsreaktioner vid 1 000 x g i 2 min.
- Kassera supernatanten och tvätta cellerna TVÅ GÅNGER genom att återanvända pelleten i 20 ml 20% FBS/DMEM-F12 (prechilled vid 4 °C) för sorteringsprovet och 200 μl för kontrollerna.
- Gör en snurr på 1000 x g i 2 minuter efter varje tvätt och placera rör på is.
- Kassera supernatanter och återanvänd cellpellets i 20% FBS/DMEM-F12 kompletterat med propidiumid (PI) vid 0,3 μg/ml. Använd 2-3 ml för sorteringsprovet och 300 μl för kontrollerna.
Obs: Lägg INTE till PI i kontrollröret med obekarna celler.
- Använd en P1000 mikropipett för att tvinga varje enskild cellfjädring genom en 35 μm lockcellssil, tillsammans med 5 ml rörpolystyren runt bottenprovrör.
- Centrifugera vid 50 g/min för att tvinga igenom kvarvarande cellfjädring på sillocken.
- Återanvänd varje enskild cellupphängning genom att knacka på rörens sidor och placera på is. Dina celler är nu redo för FACS. Fortsätt genast.
4. Post-FACS-odling av TG30/GCTM-2 subfraktionsceller i 75 cm2 (T75) flaskor
- Vi har tidigare rapporterat hur man ställer in en FACS-maskin för TG30 / GCTM-2 immunoprofiling7. Förfarandet gör det möjligt att återställa livskraftiga en enda hESC, fria från MIF-fonder, och inom P4:s portar (TG30Neg-GCTM-2Neg),P5 (TG30Low-GCTM-2Low),P6 (TG30Mid-GCTM-2Mid)och P7 (TG30Hi-GCTM-2Hi) - se figur 1E. Ställ in FACS-maskinen för TG30/GCTM-2 FACS som i vår tidigare rapport för att återställa cellen som ska användas härnäst.
- Tillsätt 1 ml CM, beredd som i steg 1.2, till vart och ett av två 5 ml polystyren runda bottenprovrör innan du samlar celler från FACS-maskinen. Lägg på is.
- Återställ 400 000 celler vardera från differentierade P4 -celler (TG30Neg-GCTM-2Neg)och pluripotent P7 (TG30Hi-GCTM-2Hi)med hjälp av TG30/GCTM-2 FACS.
- Centrifugera uppsamlingsrören på 1000 x g i 5 min.
- Aspirera supernatanterna. Tillsätt 1 ml prequilibrated 37 °C/5% CO2 CM för att återanvända varje cellpellet med en P1000 mikropipettor. Kärnapa cellerna för varje fraktion på en förjämviktad 1/3 MEF T75-kolv med CM (beredd enligt steg 1.2)
- Kultur vid 37 °C/5% CO2 i 24 timmar i en cellkulturinkubator.
- Aspirera CM dagligen och ersätt med nylagad CM (som i steg 1.2) i cirka två veckor. Kulturer av pluripotenta P7 (TG30Hi-GCTM-2Hi)celler visar mänskliga stamliknande kolonier efter en vecka och når ~ 80% sammanflöde vid 9-11 dagar. Kulturer av P4 (TG30Neg-GCTM-2Neg)celler växer mestadels som en gräsmatta av fibroblastliknande celler som når sammanflöde vid 11-13 dagar. I detta skede kan P4- och P7-cellkulturer vid behov användas för TG30/GCTM-2 FACS medlad på varandra följande omstörtning av antingen P4- eller P7-subfraktioner (se figurerna 2 och 3).
Representative Results
hESC-derivat som är pluripotenta stamcellsfria kan erhållas genom på varandra följande växling av celler från subraktionen P4 (TG30Neg-GCTM-2Neg).
Tidigare rapporter har fastställt att i hESC standard kulturer en blandning av subpopulationer samexisterar uppvisar en uttrycksgradient av gener som är associerade med pluripotens5,6,13. Kombinerad påvisande av cellytans antigener som TG30 (CD9) och GCTM-2 möjliggör diskriminering av ett antal delmängder av celler i pluripotentstadiet och i olika stadier av tidig differentiering, vilket framgår av deras uttryck av stamcellsmarkörer och härstamningsspecifikatranskriptionsfaktorer 5,6,13. I enlighet med tidigare rapporter kunde vi diskriminera P4 (TG30Neg-GCTM-2Neg),P5 (TG30Low-GCTM-2Low),P6 (TG30Mid-GCTM-2Mid)och P7 (TG30Hi-GCTM-2Hi)celler i hESC-MEL1-linjen som används för denna studie (figur 1). Med detta resultat fortsatte vi att samla differentierade P4 (TG30Neg-GCTM-2Neg)celler och pluripotenta P7 (TG30Hi-GCTM-2Hi)celler för ytterligare kultur i studier som beskrivs nedan.
Vi undersökte om vi med hjälp av en negativ urvalsmetod kunde rensa odifferentierade hESCs från cellpopulationer som genomgår mycket tidig differentiering (TG30Neg-GCTM-2Neg). Vi använde ett definierat antal P4 (TG30Neg-GCTM-2Neg)celler som var på varandra följande odlade post-FACS (Figur 2A) i ungefär två veckor, och reanalyzed med TG30 / GCTM-2 FACS innan replating vid varje passage. Resultaten visade att P4-subfraction berikas för TG30Neg-GCTM-2Neg differentierade celltyper efter på varandra följande passaging, och en mindre förekomst av P7 (TG30Hi-GCTM-2Hi)celler vid den första passagen (Figur 2A, Passage 1) försvann så småningom efter ytterligare passaging, blir pluripotenta stamcellsfria prover (Figur 2A, Passage 3).
Berikning av pluripotenta hESC celler kan uppnås genom insamling av celler TG30Hi-GCTM-2Hi celler.
Baserat på tidigare observationer med denna analys, skulle vi förvänta oss en berikning av pluripotenta hESCs genom att samla P7 (TG30Hi-GCTM-2Hi)celler som bör bilda hESC kolonier. Därför undersökte vi också TG30/GCTM-2 FACS-medierad på varandra följande passaging av pluripotent P7 (TG30Hi-GCTM-2Hi)celler. I dessa P7 kulturer utfördes TG30/GCTM-2 FACS immunoprofiling innan omgivande celler vid varje passage och endast P7 (TG30Hi-GCTM-2Hi)celler återkom. På detta sätt observerade vi att majoriteten av cellerna var belägna i de subfractions som är associerade med pluripotens (P6 och P7), vilket indikerar en berikning av pluripotenta celler som också behöll en kapacitet att differentiera och generera en liten andel P4 (TG30Neg-GCTM-2Neg)celler (Figur 3A). Dessutom visade kulturer av P7-celler ett stort antal hESC-liknande kolonier under passaging (Figur 3B), vilket också indikerar underhåll av pluripotency-tillståndet.
Figur 1. Representativ sorteringsstrategi för att erhålla TG30/GCTM-2 FACS-subfraktioner. (A): Dissocierade hES-cellupphängningar sorteras som enstaka celler och potentiella klumpar eller dubblettar är inhägnade med den främre spridningen för höjd och område (FSC-H och FSC-A). B) I artikel 3.1 skall Potentiellt skräp avlägsnas med FSC-A och SSC-A, och endast intakta celler sorteras ytterligare. C) I artikel 3.1 skall Icke-avundsvärda celler är uteslutna baserat på propidiumididiodid (PI) fluorescens (FSC-A och FL3-A). D) I artikel 3.1 skall MEF-feedercellerna portades ut av negativ markering baserat på uttryck av mus-CD90.2-PE (FL2-A och SSC-A). E) I artikel 3.1 skall Den isolerade livskraftiga hESC-fraktionen, fri från MEF-matare, fraktioneras slutligen till P4 (TG30Neg-GCTM-2Neg),P5 (TG30Low-GCTM-2Low),P6 (TG30Mid-GCTM-2Mid)och P7 (TG30Hi-GCTM-2Hi)subpopulationer. Den negativa grinden (TG30Neg-GCTM-2Neg, kallad P4) sattes enligt bakgrunds autofluorescens för de obevakade cellerna och även till isotypkontroller. F) Jag är mycket bra på att se till att Procentandelar av de olika gated subpopulations som är typiska för en TG30/GCTM-2 flöde cytometri analys. Klicka här om du vill visa större bild.
Figur 2. Representativa på varandra följande kulturer av spontant differentierade P4 (TG30Neg-GCTM-2Neg)celler från hESC-MEL1 linjen. A): Representativa FACS-tomter TG30/GCTM-2 som visar gated-delmängder av celler (P4, P5, P6 och P7) som diskrimineras av nivån på detekterade uttrycket av TG30- och GCTM-2-cellytans markörer. En initial population på 400 000 hESC-derivat som uppvisar P4 (TG30Neg-GCTM-2Neg)immunoprofiling samlas in från bulkkulturer av hESC-MEL1-linjen. Dessa P4 (TG30Neg-GCTM-2Neg)celler är på varandra följande passage post-FACS under förhållanden som stöder hESC förnyelse i T75 flaskor, tills de når confluency (11-13 dagar). Före varje passage utförs TG30/GCTM-2 FACS för att samla in och återkultur endast P4 (TG30Neg-GCTM-2Neg)differentierade celltyper. B) I artikel 3.1 skall Typisk morfologi av gräsmattan av differentierade P4 (TG30Neg-GCTM-2Neg)celler efter 14 dagar. C) I artikel 3.1 skall Sporadiska hESC-liknande kolonier som ses efter 14 dagar intermingled med gräsmattan av P4 (TG30Neg-GCTM-2Neg)celler vid passage 1 endast, genereras sannolikt genom att förorena P7 (TG30Hi-GCTM-2Hi)celler. Skalstång = 200 μm. Klicka här om du vill visa större bild.
Figur 3. P7 -celler (TG30Hi-GCTM-2Hi)som härrör från hESC-linjer kan i följd passeras efter FACS utan att förlora sina inneboende pluripotenta egenskaper. Representativ TG30/GCTM-2 FACS immunoprofiling av de olika på varandra följande passagerna, som visar de diskriminerade delmängderna av celler (P4, P5, P6 och P7) enligt uttrycksnivån för TG30 och GCTM-2. a): En startpopulation på 400 000 celler som visar P7-egenskaper (TG30Hi-GCTM-2Hi)hämtas från bulkkulturer på hESC-MEL1-linjen. Pluripotenta P7 -celler (TG30Hi-GCTM-2Hi)är i följd passagerade post-FACS under förhållanden som stöder hESC-förnyelse i T75-flaskor, tills de når ~ 80% confluency (9-11 dagar). TG30/GCTM-2 FACS immunoprofiling utförs innan cellerna omfördelats vid varje passage och endast TG30Hi-GCTM-2Hi)celler återkom. Resultaten visar att P7-celler (TG30Hi-GCTM-2Hi)bevarar sina pluripotenta egenskaper med efterföljande passaging, inklusive bevarande av (TG30Hi-GCTM-2Hi)uttryck, bilda hESC-liknande kolonier (visas i B) och upprätthålla förmågan att skilja som kan härledas från rekapitulering av en liten del av differentierade P4 (TG30Neg-GCTM-2Neg)i var och en av FACS lutningar. Skalstång = 200 μm. Klicka här om du vill visa större bild.
| Prov (reaktionsvolymer) | Primär antikropp | Sekundär antikropp | PE Råtta Anti-Mouse CD90.2 b | Propidium Iodide c |
| Sorteringsprov (~9 ml för primära ABs, 2,5 ml för sekundära ABs) | (TG30 + GCTM-2) a (på alla) | AF 488 get antimus IgG2a + AF 647 get antimus IgM | + | + |
| Kontroll-1: TG30 (200 μl) | TG30 (TG30) | AF 488 get antimus IgG2a | - | + |
| Kontroll-2: GCTM-2 (200 μl) | GCTM-2 (på 2) | AF 647 get antimus IgM | - | + |
| Kontroll-3: Antimus-CD90.2 (200 μl) | - | - | + | + |
| Kontroll-4: Fykoerythrin (PE) (200 μl) | Mus IgG2a isotyp | R-phycoerythrin get antimus IgG2a | - | + |
| Kontroll-5: Mus immunoglobulin isotyp (200 μl) | Mus IgG2a isotyp + IgM isotyp | AF 488 get antimus IgG2a + AF 647 get antimus IgM | - | + |
| Kontroll-6: Obekreade celler (200 μl) | - | - | - | - |
Tabell 1. Sortera exempel och kontroller för FACS-sortering. a (på alla) Sorteringsprovet är immunostained samtidigt med TG30 och GCTM-2 antikroppar. b PE-anti-mouse CD90.2 används för att känna igen musceller och ta bort MEF från hESCs under FACS14. c (på) Icke-avundsvärda celler är uteslutna med propidiumidid vid en slutlig koncentration på 0,3 μg/ml. Reagens tillsatt (+), inte tillsatt (-) i reaktionsröret.
| antikropp | värd | Isotyp | Arbetsutspädning |
| TG30 (1,4 mg/ml) | mus | IgG2a (på andra) | 1:1,000 |
| GCTM-2 (supernatant för hybridom) | mus | Igm | 1:5 ~ 1:10 a |
| AF 488 get antimus IgG2a | get | Polyklonal | 1:500 |
| AF 647 get antimus IgM | get | Polyklonal | 1:500 |
| R-phycoerythrin (PE) get antimus IgG2a | get | Polyklonal | 1:1,000 |
| Antimus-CD90.2 | råtta | IgG2b (IgG2b) | 1:100 |
| Renad mus IgG2a, κ Isotyp kontroll | mus | IgG2a (på andra) | 1:200 |
| Renad mus IgM, κ Isotyp kontroll | mus | Igm | 1:200 |
Tabell 2. Antikroppsdetaljer och utspädningar för FACS-sortering. a På grund av det extremt höga uttrycket av GCTM-2 på hESCs cellyta är det inte möjligt att nå mättnad med denna antikropp. Varje parti GCTM-2 hybridoma supernatant måste titreras mot en standardkontroll eller ett tidigare parti för att uppnå liknande resultat med hESCs i skala och för att undvika överfärgning.
| Namn på medium | sammansättning |
| hESC/KOSR-medium | Dulbeccos modifierade örnmedium: Näringsblandning F-12 (DMEM/F-12) kompletterad med 20% Knockout Serum Replacement (KOSR), 2 mM GlutaMAX, 1% MEM Icke nödvändiga aminosyror, 0,1 mM 2-Mercaptoethanol, 10 ng/ml human fibroblast tillväxtfaktor 2 (FGF-2) och Penna/Strep vid 1x. |
| MEF-medium | Dulbecco's Modified Eagle Medium, hög glukos (DMEM) kompletterad med 10% Fetala nötkreatur serum (FBS), 2 mM GlutaMAX och Penna / Strep vid 1x. |
Tabell 3. Sammansättning av kulturmedier.
Discussion
I det kliniska sammanhanget är differentierade somatiska celltyper den slutliga önskade produkten för transplantation och terapeutiska tillämpningar, och hPSC är en självförnyande och skalbar källa för att generera dessa somatiska celler eller deras förfäder i laboratoriet. Förekomsten av resterande odifferentierade hESCs med en inneboende potential för teratoma bildandet är en säkerhetsrisk när man överväger hESC-härledda somatiska celler för transplantation till patienter. För en genomgång av denna och andra risker i samband med cellterapi, se Sharpe et al. 16 För att förverkliga sådana tillämpningar är det därför absolut nödvändigt att forskare strävar efter att generera målcellspopulationer som också är pluripotenta stamcellsfria. Mot denna punkt visar vi här att med hjälp av vår TG30 / GCTM-2 FACS-metodik är det möjligt att övervaka för närvaron av pluripotenta celler (TG30Hi-GCTM-2Hi) i en differentierande cellpopulation och få livskraftiga hESC-differentierade derivat som kan berikas och återkultureras efter FACS. Även om det inte är möjligt att få 100% pluripotenta stamcellsfria prover med ett enda pass av vårt protokoll, kan berikade hESC-derivat återkultureras och efter på varandra följande passaging uppnås 100% somatisk cell renhet. Den påvisade livskraften hos somatiska celler för expansion efter FACS möjliggör också potentiellt produktion av tillräckligt antal celler som är lämpliga för potentiella transplantationsbehandlingar.
De uppmuntrande resultaten av denna pilotstudie fick oss att utföra en mer omfattande undersökning med hjälp av vårt TG30/GCTM-2-protokoll i en jämförande studie med flera mänskliga inducerade pluripotenta stamcellslinjer (hiPSC)15. I den studien fann vi att pluripotenta stamcellsfria prover som erhållits med hjälp av vårt TG30/ GCTM-2 FACS-protokoll inte genererade teratomas när de transplanterades till immunsvaga möss. Därför kan vi med säkerhet säga att med hjälp av detta in vitro-protokoll utvecklar tidiga differentieringscellkulturer som är fast beslutna att vara fria från pluripotenta TG30Hi-GCTM-2Hi-celler inte teratomas in vivo. Detta stöder starkt robustheten i vår analys, vilket ger en potentiell metod för att eliminera risken för teratoma bildas före användning av hPSC-härledda celler i kliniska applikationer.
Omvänt visar vi också att TG30/ GCTM-2 FACS-analysen kan användas för att hämta en pluripotent cellpopulation med hög uttrycksnivå för dessa två ytantigener (TG30Hi-GCTM-2Hi). Tidigare studier har visat att TG30Hi-GCTM-2Hi celler uppvisar den högsta korrelationen med OCT4hi uttryck och utgör det högsta antalet hESC-liknande kolonier5,6,13,15. Vi resonerar därför att pluripotency nätverket aktiveras på sina maximala nivåer i TG30Hi-GCTM-2Hi uttrycker celler. Vi anser att användning av våra TG30/GCTM-2 FACS-protokoll och hämtning av P7-celler (TG30Hi-GCTM-2Hi)skulle kunna möjliggöra storskalig rening av berikade levande hESC-kulturer, som indata till differentieringsanalyser.
Sammanfattningsvis visar vi här potentialiteten hos våra FACS-analyser baserat på det kombinerade uttrycket av ytantigener TG30 och GCTM-2 för både rening och berikning av hESCs. Framtida studier med protokoll för riktad differentiering av hPSCs kommer sannolikt också att vara informativa när det gäller denna potential. Vi är medvetna om att i vissa analyser där differentierade hESC-derivat temporalt uttrycker TG30 (CD9) eller GCTM-2, dessa två antikroppar kanske inte är lämpliga eller tillräckliga för att rensa pluripotenta celler från en differentierad population vid en viss tidpunkt i analysen6. Därför finns det ett pågående behov av att hitta nya antikroppar som specifikt känner igen levande hESCs för att övervinna den möjliga begränsningen av korsreaktion med vissa differentierade celltyper.
Disclosures
Inget att avslöja.
Acknowledgments
Vi tackar StemCore-anläggningen vid Monash University för tillhandahållandet av hESC-linjer och FlowCore-anläggningen vid Monash University för FACS-tjänster. Detta arbete stöddes av forskningsanslag från Australian Stem Cell Centre, New South Wales och Victorian Government Stem Cell Research Grant Program to ALL. ALL är partnerutredare för Australian Research Council (ARC) Special Research Initiative in Stem Cell Science, Stem Cells Australia.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM/F-12 | Life Technologies | 11320082 | Long Name: Dulbecco's Modified Eagle Medium:Nutrient Mixture F-12 |
| KOSR | Life Technologies | 10828028 | Long Name: Knockout Serum Replacement |
| GlutaMAX | Life Technologies | 35050061 | Long Name: GlutaMAX supplement |
| Nonessential Amino Acids | Life Technologies | 11140050 | Long Name: MEM Nonessential Amino Acids Solution |
| Mercaptoethanol | Life Technologies | 21985023 | Long Name: 2-Mercaptoethanol |
| DPBS | Life Technologies | 14190250 | Long Name: Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline, no calcium, no magnesium |
| TrypLE Express | Life Technologies | 12604039 | Long Name: TrypLE Express (1x), no Phenol Red |
| AF-488 | Life Technologies | A21131 | Long Name: Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG2a |
| AF-647 | Life Technologies | A21238 | Long Name: Alexa Fluor 647 goat anti-mouse IgM |
| PE-anti IgG2a | Life Technologies | P21139 | Long Name: R-Phycoerythrin Goat Anti-Mouse IgG2a (γ2a) Conjugate |
| DMEM | Life Technologies | 11965-092 | Long Name: Dulbecco's Modified Eagle Medium, high glucose |
| Pen/Strep | Life Technologies | 15140-122 | Long Name: Penicillin-Streptomycin, Liquid |
| Distilled Water | Life Technologies | 15230-089. | Long Name: Sterile Distilled Water |
| PI | SIGMA | P4864 | Long Name: Propidium iodide solution |
| FBS | SIGMA | 12203C | Long Name: Fetal Bovine Serum |
| Gelatin | SIGMA | G-1890 | Long Name: Gelatin from porcine skin |
| Human FGF-2 | Millipore | GF003AF-100UG | Long Name: Fibroblast Growth Factor basic, human recombinant, animal-free |
| Filter 0.22 μm | Millipore | SCGPU02RE | Long Name: Stericup-GP, 0.22 μm, polyethersulfone, 250 ml, radio-sterilized |
| 70 μm Cell Strainer | Becton Dickinson | 352350 | Long Name: Cell strainer with 70 μm Nylon mesh |
| 35 μm Lid cell strainer, 5 ml tube | Becton Dickinson | 352235 | Long Name: 5 ml polystyrene round bottom test tube, with a cell strainer cap (35 μm) |
| 5 ml Polystyrene round bottom test tube | Becton Dickinson | 352054 | Long Name: 5 ml polystyrene round bottom test tube, sterile |
| IgG2a Isotype Control | Becton Dickinson | 554126 | Long Name: Purified Mouse IgG2a, κ Isotype Control |
| IgM Isotype Control | Becton Dickinson | 553472 | Long Name: Purified Mouse IgM, κ Isotype Control |
| PE-CD90.2 | Becton Dickinson | 553014 | Long Name: PE Rat Anti-Mouse CD90.2 |
| 8-peaks calibration | Becton Dickinson | 559123 | Long Name: Rainbow Calibration Particles (8 peaks) |
| 50 ml sterile Polypropylene tube | Greiner Bio-One | 227261 | Long Name: 50 ml Polypropylene tube with conical bottom, Sterile |
| T75 flask | Greiner Bio-One | 658175 | Long Name: CELLSTAR Filter Cap Cell Culture 75 cm2 Flasks |
| TG30 | Merck Millipore | MAB4427 | Long Name: TG30 Antibody, clone TG30 |
| GCTM-2 | Merck Millipore | MAB4346 | Long Name: GCTM-2 is not commercially available but TG343 and equivalent monoclonal antibody is |
| Table 4. List of materials and reagent | |||
| FACS machine | Becton Dickinson | FACSVantage SE with FACSDiva option | |
| Inverted microscope | Olympus | IX71 | |
| Table 5. List of equipment. | |||
References
- Pera, M. F., Tam, P. P. Extrinsic regulation of pluripotent stem cells. Nature. 10 (7299), 713-720 (2010).
- Pistollato, F., Bremer-Hoffmann, S., Healy, L., Young, L., Stacey, G. Standardization of pluripotent stem cell cultures for toxicity testing. Expert Opin. Drug Metab. Toxicol. 8 (2), 239-257 (2012).
- Miura, K., Okada, Y., Aoi, T., Okada, A., Takahashi, K., Okita, K., Nakagawa, M., Koyanagi, M., Tanabe, K., Ohnuki, M., et al. Variation in the safety of induced pluripotent stem cell lines. Nat. Biotechnol. 27 (8), 743-745 (2009).
- Polanco, J. C., Laslett, A. L. Safety Assessment of Reprogrammed Cells Prior to Clinical Applications: Potential Approaches to Eliminate Teratoma Formation. Pluripotent Stem Cells. Lenka, N. , InTech. (2013).
- Laslett, A. L., Grimmond, S., et al. Transcriptional analysis of early lineage commitment in human embryonic stem cells. BMC Dev. Biol. 7, 12 (2007).
- Kolle, G., Ho, M., et al. Identification of human embryonic stem cell surface markers by combined membrane-polysome translation state array analysis and immunotranscriptional profiling. Stem Cells. 27, 2446-2456 (2009).
- Zhou, Q., Chy, H., Laslett, A. L. Preparation of defined human embryonic stem cell populations for transcriptional profiling. Current protocols in stem cell biology. Chapter 1, Unit1B 7 (2010).
- Stem Cell Protocols - WiCell. , WiCell. Available from: http://www.wicell.org/home/support/stem-cell-protocols/stem-cell-protocols.cmsx (2013).
- Fong, C. Y., Peh, G. S., Gauthaman, K. Separation of SSEA-4 and TRA-1-60 labelled undifferentiated human embryonic stem cells from a heterogeneous cell population using magnetic-activated cell sorting (MACS) and fluorescence-activated cell sorting (FACS). Stem Cell Rev. 5, 72-80 (2009).
- Schriebl, K., Satianegara, G., et al. Selective removal of undifferentiated human embryonic stem cells using magnetic activated cell sorting followed by a cytotoxic antibody. Tissue Eng. Part A. 18, 899-909 (2012).
- Adewumi, O., Aflatoonian, B., et al. Characterization of human embryonic stem cell lines by the International Stem Cell Initiative. Nat. Biotechnol. 25, 803-816 (2007).
- Michalska, A. E. Isolation and propagation of mouse embryonic fibroblasts and preparation of mouse embryonic feeder layer cells. Current protocols in stem cell biology. Chapter 1, Unit1C 3 (2007).
- Hough, S. R., Laslett, A. L., Grimmond, S. B., Kolle, G., Pera, M. F. A continuum of cell states spans pluripotency and lineage commitment in human embryonic stem cells. PLoS One. 4, e7708 (2009).
- Filipczyk, A. A., Laslett, A. L., Mummery, C., Pera, M. F. Differentiation is coupled to changes in the cell cycle regulatory apparatus of human embryonic stem cells. Stem Cell Res. 1, 45-60 (2007).
- Polanco, J. C., Ho, M. S. H., Wang, B., Zhou, Q., Wolvetang, E., Mason, E., Wells, C., Kolle, G., Grimmond, S. M., Bertoncello, I., O'Brien, C., Laslett, A. L. Identification of unsafe human IPSC lines using a robust surrogate assay for pluripotency. Stem Cells. 31 (8), 1498-1510 (2013).
- Sharpe, M. E., Morton, D., Rossi, A. Nonclinical safety strategies for stem cell therapies. Toxicol. Appl. Pharmacol. 262 (3), 223-231 (2012).
