Summary
我们在这里描述了使用pH敏感的绿色荧光蛋白变种，pHluorin，来研究在细胞表面贩运的轴向制导受体的间歇性时间动力学。pHluorin标记的受体在细胞培养和 体内都表达，使用小鸡胚胎的电波。
Abstract
在开发过程中，轴突制导受体在调节轴突对吸引力和排斥性暗示的敏感性方面起着至关重要的作用。事实上，激活制导受体是信号机制的第一步，允许轴尖，生长锥，对配体作出反应。因此，在细胞表面调节它们的可用性是参与设置生长锥敏感性的机制之一。我们在这里描述了一种方法，以精确可视化在体外和体内发育的小鸡脊髓的轴向导受体的间子-时间细胞表面动力学。我们利用绿色荧光蛋白 （GFP） 变种的 pH 依赖荧光特性，专门检测用于等离子膜的轴向制导受体的分数。我们首先描述了这种pH依赖结构的体外验证，我们进一步详细说明了它们在体内的使用，在小鸡脊髓和弦，以评估轴向导受体的兴趣的间断-时间动力学。
Introduction
在导航过程中，轴突集成了多个环境提示，引导他们朝着目标前进。这些线索激活轴龙终端表面的制导受体，即生长锥体，进而启动适当的信号通路。因此，受体细胞表面分布的时间和空间调节对于确定生长锥体1的灵敏度至关重要。在此背景下，中线交叉通过通信轴突是研究受体细胞表面水平调节的极好模型。在正在发育的脊髓中，小卖部轴突最初被吸引到穿过中线的腹腔底板上。穿越后，他们失去了对地板吸引器的响应，并获得对地板排斥反应，以便他们能够退出地板，导航到他们的最终目的地在神经系统的对立面2，3。调节生长锥表面的受体可用性是响应性切换到中线提示4，5的机制之一。因此，选择性地监测生长锥体等离子膜中的受体至关重要。我们在这里描述了一种基于绿色荧光蛋白（GFP）变种的pH依赖荧光特性的方法，以具体可视化在 体外 和 体外血浆膜的轴向导受体，在发育中的小鸡脊髓中。
罗斯曼和他的同事设计了点突变pH敏感变种的GFP，包括黄道pHluorin6。黄道磷脂素在接触酸性pH（<6）时具有无荧光特性，同时在中性pH处具有荧光。这允许区分细胞内酸性隔间（即内分泌体，贩运卵泡）与荧光受体中加入等离子膜的无荧光受体，从而暴露在细胞外中性pH7中。我们利用这一点来监测普莱辛A1的等离子膜本地化，这是一种轴向制导受体，对中线驱虫剂血红素3B5（图1A）的生长锥反应进行调停。我们在这里描述了pHluorin-plexinA1构造的体外特征，以及在发育中的小鸡脊髓中这种构造的ovo电波8-10，然后是低温剖腹产的微观分析，从而能够以空间和时间分辨率在体内跟随轴向受体动力学。
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Protocol
1. 克隆策略，以标记普莱辛A1受体与普洛林
- 选择适当的表达载体作为骨干（例如小鼠受体plexinA1表达载体，安德烈亚斯·普舍尔博士11的一种礼物）。
注意：此普莱辛A1向量设计为实现在等离子膜中高效插入HA-或VSV标记受体。 - 通过 PCR 放大黄道 pHluorin 编码序列，使用足够的质粒作为模板（例如，使用 pHluorin 标记的 GABA 受体，Jacob2博士的一种礼物）。如有必要，在引号的 5' 端添加一个限制站点，以方便骨干克隆步骤。
- 使用限制位点（如图 1B中描述的 NruI/Kpn2I 限制位点）在信号肽和受体编码序列之间插入 pHluorin 序列。
注意：由于确保受体正确定位的信号肽被切开，因此应将其放置在后。这保证了对信号肽的识别，并防止了普利林从利益受体的。 - 对获得的构造进行排序，以确保 PCR 不会引入突变。
2. 在 COS7 细胞中对 pHluorin 标记的受体 体外 特征
融合蛋白到达血浆膜的能力及其可逆的荧光损失，因为pH度降低，可以使用以下程序得到确认。
- 第1天。板 1.5 x 105 COS7 细胞在玻璃底 35 毫米盘在 2 毫升完整的杜尔贝科的修改鹰介质 （DMEM - 10% 胎儿牛血清 - 2 毫升 1 mM 丙酸钠 - 25 U/ml 青霉素/链霉素 - 2.5 微克/毫升安非他明 B - pH 7.4）。
- 第2天。变异细胞：
注意：细胞应为70-80%的汇流。- 准备 200 μl NaCl 150 mM 并添加 3 μg DNA，即矢量编码 pHluorin 标记受体。轻轻旋转并短暂地旋转。
注：图 1B显示了这些实验中使用的普洛林-普莱辛A1向量的地图。 - 添加 10 μl 的转染试剂（或使用的试剂的适当量）。漩涡立即。
- 在 Rt 孵化 10 分钟。
- 在细胞中加入200微克的转染试剂/DNA混合物。
- 轻轻移动板，实现混合的重新分区，并将细胞放回 37 °C 孵化器。
- 准备 200 μl NaCl 150 mM 并添加 3 μg DNA，即矢量编码 pHluorin 标记受体。轻轻旋转并短暂地旋转。
- 第3天。去除转染介质，并更换2毫升的新鲜完整的DMEM。
- 第4天。执行 COS7 普洛林 -普莱辛 A1 转感染细胞的活细胞成像：
- 准备两个 DMEM 完整介质的语法，并将 pH 分别调整到 3.5 和 9.5。
注意：对于一个 35 mm 板，执行实验需要 1.5 毫升的每个解决方案。 - 去除细胞介质，并将其替换为 1 毫升 DMEM 完整中等 pH 7.4。
- 用适当类型的管子准备一个 5 毫升注射器，以便在不打开显微镜室的情况下将各种组件直接注入细胞培养介质中。
- 使用允许维护 37 °C、5% CO2 潮湿工作气氛的模块。
注意：使用二氧化碳 室的另一种方法是使用 HEPES 缓冲介质（通常根据细胞类型在 10-25 mM 范围内）。 - 将细胞放在腔室中，并调整管子和注射器。
注意：显微镜应在录制过程中开始避免机械漂移之前进行平衡。 - 打开成像软件并选择多维采集程序。
- 查找具有 40 倍目标的转染性 COS7 单元，并在每个单元的软件中标记位置。
- 配置 Z 堆栈，以便进行 15μm 深度采集（在板中添加介质时，焦点可能会发生变化）。
- 为 GFP 过滤器和相位设置曝光。
- 配置收购时间。
注：对于整个实验的5个感兴趣的领域，每20秒收购10分钟应该足够。 - 开始获取，并在 DMEM pH 7.4 介质中拍摄 5 个控制图像。
- 暂停收购，注入 1.25 毫升 pH 3.5 完整 DMEM，以实现培养介质中的 pH5.5，标记软件中的事件并恢复获取 5 个时间点。
注意：绿色荧光应逐渐消失。 - 暂停收购，注入 1.2 毫升 pH 9.5 完整 DMEM，以实现培养介质中的 pH 7.4，标记软件中的事件并恢复获取 5 个时间点。
注意：绿色荧光应重新出现在等离子膜上。 - 分析图像。
图2 显示了通过使用 pHluorin-普莱辛 A1 构造的此类协议获得的具有代表性的图像。
- 准备两个 DMEM 完整介质的语法，并将 pH 分别调整到 3.5 和 9.5。
3. 在奥沃电波化的普洛林-普莱辛A1构造
- 电化前处理鸡蛋：
- 在孵化前一周，以 14 °C 的速度将受精卵存放在冰箱中。
- 在饱和湿度为 50-52 小时的孵化器中以 38.5 °C （101.3 °F） 孵化卵子，直到胚胎达到 HH1412阶段。
注意：卵子在孵化过程中必须水平放置，以便胚胎正确定位进行电波处理，漂浮在蛋黄顶部。HH14阶段适合在脊髓和多头根结节的分化神经元中获得质粒的表达，具有适当的存活率。
- 电波酸盐胚胎8-10：
- 准备电波：
- 准备浓度优于2微克/微克的无内毒素DNA质粒，以便能够根据所需的浓度稀释。
- 拉足够的玻璃毛细毛，注入不同的DNA溶液。
- 准备无菌PBS （-Ca2+; - Mg2+） - 100 U/ml 青霉素/链霉素，在 38.5 °C 下平衡。
- 消毒引擎盖、弯曲剪刀和细钳。
- 控制电极间距。
注意：一般使用电极之间的 4 mm 空间。
- 窗口鸡蛋13（图3A）：
- 使用弯曲的剪刀刺穿鸡蛋钝侧的壳。
- 使用 0.9 mm x 25 mm 针头和 5 毫升注射器取出 2 毫升白蛋白。垂直定向针头，以避免损坏蛋黄囊。
- 用胶带盖住蛋的顶部，以保持蛋壳的完整性。
- 使用弯曲的剪刀，刺穿胶带中间的外壳，以平衡从鸡蛋中取出 2 毫升白蛋白时的压力。然后，切开一个足够大的窗户，使胚胎可视化，并能够在上面工作。
- 添加±2毫升无菌温暖 PBS （ - Ca2 +; - Mg2+） - 100 U / ml 青霉素 / 链霉素，以避免胚胎脱水，使其更容易纵者接近。
- 注射DNA并电镀胚胎
- 将 PBS 中的质粒稀释 （-Ca2+; - Mg2+），浓度在 0.5-2 μg/μl 之间，并添加快速绿色染料以达到最终 0.025% 的浓度。将DNA混合物加载到毛细毛上。建议使用喷油器。
注意：检查毛细细纸的耐药性是否不是太大（这意味着注射胚胎时可能有困难）也不是太小（这意味着毛细细纸可能太大，可能会损坏胚胎）。此外，高于 2 μg/μl 的核酸浓度可能会导致非特定影响，需要控制。 - 用加载的毛细管刺穿蛋黄囊和神经管。以浅角进入神经管，用DNA混合物（图3B）填充从尾部到头部的流明。
注意：快速绿色允许控制注射的准确性。 - 快速将 4 mm 铂电极放置在神经管的两侧，达到您希望电波酸盐的水平，并在 31 V 处应用 3 个脉冲，以 500 毫秒间隔 （图 3C）进行 50 毫秒。
注意：避免将电极放在心脏或大型额外的胚胎血管上，以避免损坏发育中的胚胎。气泡应形成在电极上。 - 用针头，取出2毫升白蛋白，以降低壳中的水平。
- 用胶带密封窗户和钝边。
- 将鸡蛋放回38.5°C的孵化器中，直到它们达到所需的阶段。
- 将 PBS 中的质粒稀释 （-Ca2+; - Mg2+），浓度在 0.5-2 μg/μl 之间，并添加快速绿色染料以达到最终 0.025% 的浓度。将DNA混合物加载到毛细毛上。建议使用喷油器。
- 准备电波：
4. 胚胎嵌入和冷冻切除
- 电波化后48小时，小心收获电波胚胎（HH24阶段）。切掉胶带和一半的胆碱膜。为了防止胚胎沉入蛋黄中，在胚胎下放置一个绞盘，并切开胆碱膜的后半部分。
- 将胚胎转移到装满冰冷 PBS 的解剖盘中。
- 通过使用荧光立体显微镜在神经管中寻找荧光来检查电扩散效率。
注意：控制质粒编码 RFP 的共电化可能有助于可视化电波区。 - 使用微鳞片解剖胚胎，以选择脊髓的电波化区域。
- 将解剖胚胎转移到24井板，并固定在pH 7.4 4%甲醛（PFA） - 磷酸盐缓冲盐水（PBS），O/N在4°C。
注意：固定步骤对于使普洛林在其"活"构象中稳定至关重要，因此能够在固定/渗透组织中使用普洛林。虽然固定会大大减缓荧光的pH依赖性变化，但必须考虑到固定后仍可能发生构象/质子变化。因此，以下协议（嵌入、冷冻切除和观察）必须在固定步骤后 3 天内执行，所有缓冲器均位于 pH 7。如果不需要固定，建议对活组织部分进行观察。 - 取出 4% PFA 并在 pH 7.4 PBS 中清洗胚胎。
- 在PBS-15%蔗糖中孵育胚胎，并保持在4°C，直到胚胎下沉。
- 在pH 7.4 7.5%明胶中孵育固定胚胎-15%蔗糖在37°C下45分钟，使胚胎完全嵌入。
- 将嵌入模具嵌入冰上，加入 400μl 的 pH 7.4 7.5% 明胶 - 15% 蔗糖，以实现坚实的 2 mm 底座。
- 用切口吸气嵌入胚胎，并将胚胎放在固体明胶底座上。
- 用pH 7.4 7.5%明胶覆盖-15%蔗糖，并在明胶凝固之前用钳子定位胚胎。
- 一旦明胶是固体，准备一个-40°C异丙酚浴（使用干冰或液氮），并冻结明胶块5分钟。
- 将冷冻块保持在-80°C。
- 将冷冻块置于-20°C，1小时。
- 取出模具，用聚乙二醇介质固定夹头上的方块。
- 一旦块被紧紧固定，将夹头放在冷冻统计系统中。
注意：使用涂层滑梯避免染色过程中的组织损失。 - 执行连续冷冻剖腹产（通常执行 20μm 冷冻切除）。
- 让冷冻片在 RT 干燥 15 分钟。
注意：应保护冷冻检查免受不必要的光线照射，以避免 GFP 荧光漂白。
5. 冷冻剖腹产的微观分析
- 在RT的pH 7.4 PBS中补充水分，10分钟。
注意：如果需要，核可以沾染为霍赫斯特。 - 在 PBS 中使用 0.5 微克/毫升的 Hoechst 溶液，并孵育冷冻切片 15 分钟。
- 用pH 7.4 PBS冲洗幻灯片3次，5分钟。
- 继续滑动安装。可以使用 pH 7.4（或更基本的）聚乙烯醇安装溶液，使 O/N 变硬：小心定位盖片，以避免滑梯和盖片之间形成气泡。
- 让安装介质在黑暗中以 4 °C 变硬 O/N。
- 使用倒置的凸显微镜精确可视化 pHluorin-plexinA1 融合蛋白：以最佳针孔和光学分辨率执行 z 堆栈，并使用 20X （NA 0.75） 或 40X （NA 1.3） 镜头。
注意：pHluorin 可检测，其参数与用于检测 GFP 的参数相同（即 排放峰值为 509 nm）。波长激发和检测滤镜设置由成像软件进行最佳定义。在 425-460 nm（激发在 405 nm）之间检测到霍奇斯特，在 485-545 nm 之间检测到 GFP 或 pHluorin（激发在 473 nm 之间），在 575-675 nm 之间检测到 RFP（激发在 559 nm 之间）。
小鸡胚胎脊髓中普洛林-普莱辛A1和eGFP表达的代表图像显示在 图4中。
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Representative Results
图1。A. 在细胞环境中的普洛林-普莱辛A1荧光特性的方案。PHluorin 在 pH 是酸性 （<6） 的细胞内隔间中是无荧光的，例如在贩运静脉或内分泌体中，当暴露在 pH 是中性的细胞外介质中时，它是荧光的。这只能可视化普洛林-普莱辛A1受体的细胞表面池。B.pBK-CMV-普洛林-普莱辛A1克隆站点的地图。鼠标受体普莱辛A1表达载体被用作骨干。该载体的设计旨在实现在等离子膜上实现高效的 VSV 标记受体插入。为此，血红素 3a 肽信号和部位被融合在 VSV 标记受体上游，从其自身的信号肽和部位中消融。通过 PCR，使用 NruI/Kpn2I 限制站点，将普洛林序列插入 VSV 标签和 PlxnA1 编码序列之间的帧中。指定单一限制点用于设计其他受体的克隆策略。该计划采用生物信息学软件。
图2。普洛林-普莱辛A1的特征在COS7细胞中构建了pH依赖荧光特性。A.COS7细胞与普洛林-普莱辛A1构造一起传输，用共聚焦显微镜观察，使血浆膜上的普洛林-普莱辛A1荧光可视化。比例杆：20μM. B. COS7细胞与pHluorin-plexinA1构造一起传输，通过pH 7.4培养介质的实时成像观察，在培养介质酸化至pH 5.5后，在培养介质中恢复pH 7.4后观察到。细胞轮廓在 GFP 荧光采集时带有虚线指示。比例栏：10 μM.单击此处查看更大的图像。
图3。在卵子电化过程中。A.1. 白蛋白从壳的最大一侧移走。2. 通过窗口进入卵壳以进入胚胎。B.DNA/快速绿色混合注射在神经管中。C.将电极放在神经管的两侧，避开心脏和大血管，并电化小鸡胚胎。
图4。pHluorin-普莱辛A1电波后小鸡神经管冷冻的微观分析。显示了电镀小鸡脊髓中的 eGFP（上面板）和 pHluorin-plexinA1（下面板）表达模式之间的比较。与 eGFP （a） 的漫射亚细胞本地化相比，放大的面板显示 pHluorin-普莱辛 A1 （a'） 的膜荧光。关于plexinA1，扩大面板显示，这种受体是专门丰富在地板交叉（b'）的等离子膜，这不是eGFP的情况，在地板交叉前后均表示（b）。比例杆：100微米FP：地板：前：交叉前：帖子： 交叉后。单击此处查看更大的图像。
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Discussion
该协议提供了一个分步程序，以遵循轴向导受体在细胞培养和小鸡胚胎脊髓发育环境中的动态。
要设计一种 诺沃 普洛林标记蛋白，需要考虑两点关于克隆策略。首先，pHluorin 标签应暴露在酸性内生体的流明中，因此应暴露在细胞外隔间，以便可视化等离子膜受体池。因此，pHluorin序列对受体序列的正确定位直接取决于所研究的受体类型（即受体的N端或C端部分是否暴露在细胞外隔间中）。其次，正如协议中解释的那样，应考虑与信号肽相对的普洛林序列的位置，以避免随后的普洛林与利益受体之间的裂痕。
该技术的局限性与受体在等离子膜激活后贩运有关。通常，受体是内化和进步通过内分泌途径组成的功能和物理上不同的隔间15。由于ATP驱动的质子泵，内分泌体在早期内生体中保持酸性pH度约6，晚内生体保持约5，溶酶体低于5，但在回收内分泌体中仅保持6.4左右，在洞穴体中仅维持7.0左右，允许在这两个内分泌隔间中荧光。此问题可使用全内部反射荧光 （TIRF） 显微镜16在体外解决。此技术固有的第二个限制是，由于其相对较大的尺寸，pHluorin 标签可能会破坏受体活性，具体取决于标签插入站点。
尽管pHluorin具有其优点，但它尚未被广泛用于研究轴向导航过程中膜蛋白的动力学和调节。开创性的作品已经使用pHluorin来研究生长锥体在体外转动过程中的孢子-时间动力学。在本协议中，我们说明了如何利用pHluorin来研究体内轴突等离子膜受体的分布。由于pHluorins是基因编码的，它们特别适合体内分析。虽然我们描述它在卵子电波后在小鸡中的使用，这种方法可用于其他物种。事实上，电波在各种动物模型18，19中有效工作。此外，pHluorins已经成功地用于C.elegans，德罗索菲拉，或小鼠转基因动物20-23。
由于pH依赖性变化发生在毫秒范围内，pHluorins特别适合于6，24的实时成像。例如，普洛林融合已经被用来监测来自转基因小鼠23的嗅觉神经元的突触布雷文外渗透的体内动力学。在体内活成像的pHluorin融合具有相当大的希望，因为对活成像（快速成像和低光毒性）适应的共焦显微镜变得更加高效和可访问25。体内的活成像也可以与光漂白后荧光恢复（FRAP）相结合，以便更直接地评估外分泌或扩散。
使用其他pH敏感变种及其组合可以进一步扩大应用范围。不同细胞器中受体的动态分布可以通过使用比例倍洛林来监测，该比例法根据6，27隔间的pH值改变荧光。同样，在融合到黄道蛋白的膜蛋白中加入pH-不敏感的荧光蛋白，可以为其贩运提供重要的见解。此外，最近克隆的pHtomato29将能同时监测两个受体。这可以为受体复合物的形成提供重要的见解。由于pHluorin也可用于标记制导线索30，双成像的配体，其受体也是可行的。
在此协议中，融合蛋白的表达速率是一个关键点，尤其取决于促进者的力量、融合蛋白的稳定性和用于变菌细胞的质粒数量。事实上，当过度表达时，融合蛋白可能会积聚在细胞内的网状网状物中，并可能出现荧光背景。因此，可能需要进行几次优化，以实现细胞表面的 pHluorin 融合蛋白的精确可视化。此外，在固定组织中使用普洛林融合蛋白需要在固定期间和固定后进行特别护理。事实上，普洛林融合蛋白的构象稳定可能只是暂时的。因此，pH值必须保持在 7 以上，以防止失去普洛林信号。此外，必须在固定后不久进行观察。用户可能需要根据其特定的普洛林融合蛋白来定义最佳时间。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
我们感谢霍迈拉·纳瓦比、弗雷德里克·莫雷特和伊莎贝尔·三亚的帮助。这项工作得到了 CNRS、协会特许经营协会（AFM）、ANR YADDLE、拉贝克斯·德维坎、拉贝克斯·皮层、ERC YODA 到 V .C的支持;C.D-B和A.J分别得到拉利格癌症和拉贝克斯·德韦坎奖学金的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| COS7 cells | ATCC | CRL-1651 | |
| DMEM GlutaMAX | GIBCO | 61965-026 | |
| Sodium pyruvate | GIBCO | 11360-039 | |
| Amphotericin B | Sigma | A2942 | |
| Fetal bovine serum | GIBCO | 10270-106 | |
| Penicillin/Streptomycin | GIBCO | 15140-122 | |
| Exgen500 reagent | Euromedex Fermentas | ET0250 | |
| PBS -Ca2+ -Mg2+ | GIBCO | 14190-094 | |
| Fast green dye | Sigma | F7252 | |
| 32% Paraformaldehyde aqueous solution | Electron Microscopy | 15714-S | Dilute extemporaneously in PBS to achieve a 4% solution |
| Gelatin from cold water fish skin | Sigma | G7041 | |
| Sucrose | Sigma | S0389 | |
| Cryomount | Histolab | 00890 | |
| Hoechst 34580 | Invitrogen | H21486 | |
| Mowiol 4-88 | Fluka | 81381 | |
| Consumables | |||
| Bottom-glass 35 mm dish | MatTek | P35G-1.5-14-C | |
| 5 ml Syringe | Terumo | SS-05S | |
| Needles 0.9 mm x 25 mm | Terumo | NN-2025R | |
| Capillaries | CML | PP230PO | capillaries are stretched manually in the flame |
| Superfrost Plus Slides | Thermo Scientific | 4951PLUS | |
| Material | |||
| Curved scissors | FST | 129-10 | |
| Microscalpel | FST | 10316-14 | |
| Forceps | FST | Dumont #5 REF#11254 | |
| Equipment/software | |||
| Time lapse microscope | Zeiss | Observer 1 | |
| Temp module S | PECON for Zeiss | ||
| CO2 module S | PECON for Zeiss | ||
| Metamorph software | Metamorph | ||
| Eggs incubator | Sanyo | MIR154 | |
| Electroporator apparatus | Nepa Gene CO., LTD | CUY21 | |
| Electrodes | Nepa Gene CO., LTD | CUY611P7-4 | 4 mm platinum electrodes |
| Fluorescence stereomicroscope | LEICA | MZ10F | |
| Cryostat | MICROM | HM550 | |
| Confocal microscope | Olympus | FV1000, X81 | |
| Fluoview software | Olympus | ||
| CLC Main Workbench software | CLC Bio |
References
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