Summary
ここでは、pH感受性緑色蛍光タンパク質変異体pHluorinを用いて、細胞表面における軸索誘導受容体の密売の時空間的ダイナミクスを研究する。pHluorinタグ付き受容体は、細胞培養と 生体内の両方で発現し、ひよこ胚のエレクトロポレーションを用いる。
Abstract
開発中、軸索誘導受容体は、魅力的で反発的な手がかりの両方に対する軸索感度を調節する上で重要な役割を果たす。実際に、ガイダンス受容体の活性化は、軸索先端、成長コーン、リガンドに応答することを可能にするシグナル伝達機構の第一段階である。したがって、細胞表面でのそれらの可用性の変調は、成長コーン感度の設定に関与するメカニズムの一つである。ここでは、発達中のひよこ脊髄におけるインビトロおよびインビボの両方の軸索誘導受容体の時空間的細胞表面ダイナミクスを正確に可視化する方法について述べている。緑色蛍光タンパク質(GFP)変異体のpH依存性蛍光性を利用して、細胞膜に取り組む軸索誘導受容体の割合を特異的に検出しました。我々は、まず、このようなpH依存性構造のインビトロ検証を記述し、さらに、関心のある軸索誘導受容体の時空間的ダイナミクスを評価するために、ひよこ脊髄における生体内でのそれらの使用をさらに詳述する。
Introduction
彼らのナビゲーション中に、軸索は彼らの目標に向かってそれらを導く複数の環境の手がかりを統合する。これらの手がかりは、軸索末端の表面で誘導受容体を活性化し、成長コーンは、今度は適切なシグナル伝達経路を開始する。したがって、受容体の細胞表面分布の時間的および空間的調節は、成長コーン1の感度を設定するために重要である。この文脈では、コミシャル軸索による正中線交差は、受容体細胞表面レベルの調節を調査するための優れたモデルである。発達中の脊髄では、コミシャル軸索は当初、正中線を横切る腹側床板に向かって引き付けられる。交差した後、床板の誘引物質への応答性を失い、床板を出て神経系2,3の反対側の最終目的地に向かってナビゲートできるように、床板忌避剤に対する応答を得る。成長コーン表面における受容体の利用可能性の調節は、正中のキューへの応答性の切り替えの基礎となるメカニズムの1つである 4,5.したがって、成長コーンの原形質膜に存在する受容体の選択的モニタリングが最も重要である。ここでは、現像するひよこ脊髄において、 生体外 および 生体内で血漿膜に対処される軸索誘導受容体を特異的に可視化する緑色蛍光タンパク質(GFP)変異体のpH依存性蛍光性に基づく方法について説明する。
Rothmanたちの研究グループは、ecliptic pHluorin6を含むGFPのpH感受性変異をポイント変異によって設計した。エクリプティックpHluorinは、中性pHで蛍光されながら酸性pH(<6)に曝露されると非蛍光であるという性質を有する。これにより、細胞内酸性コンパートメントに局在する非蛍光受容体(すなわち、内生小胞)を、細胞膜に取り込まれ、細胞外中性pH7に曝露される蛍光受容体から区別することができる。これを利用して、プレキシンA1の細胞膜局在を監視し、正中忌避セマフォリン3B5 に対する成長コーン応答を媒介する軸索誘導受容体である(図1A)。ここでは、pHluorin-plexinA1コンストラクトの インビトロ 特徴付けについて、発達中のひよこ脊髄におけるこの構造の ovo エレクトロポレーション8-10 と共に、空間および時間的解像度 の両方で生体内 の軸索誘導受容体ダイナミクスに従うことを可能にする極低温分析を行う。
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Protocol
1. プキシンA1受容体をpHluorinでタグ付けするクローニング戦略
- 適切な発現ベクターを骨格として選択する(例えばマウス受容体プレキシンA1発現ベクター、アンドレアス・プッシェル博士11の贈り物)。
注:このplexinA1ベクターは、効率的なHAタグ付き受容体挿入を実現するように設計されました。 - 適切なプラスミドをテンプレートとして用いたエクリプティックpHluorinコード配列をPCRにより増幅する(例えば、pHluorinタグ付きGABA A受容体、ヤコブ2博士の贈り物)。必要に応じて、バックボーンのクローニングステップを容易にするために、プライマーの5'末端に制限部位を追加します。
- 制限部位を用いてシグナルペプチドと受容体コード配列の間のフレーム内にpHluorin配列を挿入する(例えば図1Bに記載されているNruI/Kpn2I制限部位)。
注:受容体の正しい標的を保証するシグナルペプチドが切断されるため、pHluorinはその後に配置する必要があります。これはシグナルペプチドの認識を保証し、関心のある受容体からのpHluorinの切断を防ぐ。 - PCRによって突然変異が導入されないように得られた構成体を配列する。
2. COS7細胞におけるpHluorinタグ付き受容体 インビトロ の特徴
融合タンパク質がpHが低下するほどの蛍光の血漿膜に到達する能力および蛍光の可逆的損失が低下する能力は、以下の手順を用いて確認できる。
- 1日目。完全なダルベッコの修正されたイーグルミディアムの2mlのガラス底35mm皿の皿1.5 x 105 COS7細胞(DMEM - 10%胎児の牛血清 - 1 mMナトリウムピルビン酸 - 25 U /mlペニシリン/ストレトマイシン - 2.5 μg/mlアンホテリシンB - pH 7.4)。
- 2日目。トランスフェクト細胞:
注: セルは 70-80% コンフルエントである必要があります。- 200 μl NaCl 150 mMを準備し、3 μgのDNA すなわちpHluorinタグ付き受容体をコードするベクターを加えます。穏やかに渦を回転させ、短時間回転します。
注: これらの実験で使用した pHluorin-plexinA1 ベクターのマップを 図 1Bに示します。 - 10 μlのトランスフェクション試薬(または使用する試薬の適切な量)を加えます。すぐに渦。
- RTで10分インキュベート。
- 細胞に200μlのトランスフェクション試薬/DNAミックスを加えます。
- プレートを穏やかに移動して、ミックスの再パーティションを作成し、細胞を37°Cインキュベーターに戻します。
- 200 μl NaCl 150 mMを準備し、3 μgのDNA すなわちpHluorinタグ付き受容体をコードするベクターを加えます。穏やかに渦を回転させ、短時間回転します。
- 3日目。トランスフェクション培地を取り除き、2mlの新鮮な完全なDMEMで交換してください。
- 4日目。COS7 pHluorin-plexinA1 トランスフェクト細胞の生細胞イメージングを行う:
- DMEM完全培地の2つのアリコートを準備し、それぞれ3.5と9.5にpHを調整します。
注:1つの35 mmプレートでは、実験を行うために各溶液の1.5mlが必要です。 - 細胞培地を取り出し、1mlのDMEM完全培地pH 7.4で交換してください。
- 顕微鏡室を開かなくても細胞培養培地に直接様々な成分を注入するために、適切なタイプのチューブで5mlシリンジを調製します。
- 37°C、5%CO2湿気の多い作業雰囲気のメンテナンスが可能なモジュールを使用してください。
注:CO2 チャンバの使用に対する別のアプローチは、HEPES緩衝媒体(通常、細胞タイプに応じて10〜25 mMの範囲)を使用することです。 - チャンバーにセルを置き、チューブと注射器を調整します。
注:記録中の機械的なドリフトを避けるために、顕微鏡は開始する前に平衡化する必要があります。 - イメージングソフトウェアを開き、多次元取得プログラムを選択します。
- 40Xの目的を持つトランスフェクトされたCOS7細胞を見つけ、それぞれのソフトウェアで位置をマークします。
- Z スタックを設定して、15 μm の深度取得を行います(プレートにメディアを追加するとフォーカスが変わる可能性があります)。
- GFP フィルタとフェーズの露出を設定します。
- 取得タイミングを設定します。
注: 5 つの対象分野を含む実験全体では、10 分間 20 秒ごとに取得すれば十分です。 - 取得を開始し、DMEM pH 7.4培地で5つの制御画像を取ります。
- 一時停止取得、pH 3.5の1.25 mlを注入し、培地中で5.5のpHを達成し、ソフトウェアでイベントをマークし、さらに5つの時間ポイントの取得を再開する。
注:緑色蛍光は徐々に消えるはずです。 - 一時停止取得、pH 9.5完全DMEMの1.2 mlを注入して、培養培地中でpH 7.4を達成し、ソフトウェアでイベントをマークし、さらに5つの時間ポイントの取得を再開する。
注:緑色蛍光は、形質膜に再び現れるはずです。 - 画像を分析します。
図2 は、pHluorin-plexinA1コンストラクトを用いてこのようなプロトコルで得られた代表的な画像を示す。
- DMEM完全培地の2つのアリコートを準備し、それぞれ3.5と9.5にpHを調整します。
3. ovoでpHluorin-プレキジナ1コンストラクトのエレクトロポレーション
- エレクトロポレーション前の卵の取り扱い:
- 受精卵は、インキュベーションの1週間前まで14°Cの冷蔵庫に保管してください。
- 卵を38.5°C(101.3°F)で、胚がステージHH1412に達するまで50〜52時間飽和湿度のインキュベーターでインキュベートする。
注:卵は卵の上部に浮かぶエレクトロポレーションのために胚が適切に配置されるように、インキュベーション中に水平に配置する必要があります。HH14段階は、適切な生存率を有する脊髄および後根神経節における分化ニューロンにおけるプラスミドの発現を得るのに適している。
- エレクトロポレート胚8-10:
- エレクトロポレーションを準備する:
- 2 μg/μlより優れた濃度の内毒素を含まないDNAプラスミドを調製し、所望の濃度として希釈できるようにします。
- 異なるDNA溶液を注入するのに十分なガラス毛細血管を引っ張ります。
- 滅菌PBS(-Ca2+;-Mg2+)-100 U/mlペニシリン/ストレプトマイシンを準備し、38.5°Cで平衡化する。
- フード、湾曲したはさみ、細かい鉗子を殺菌する。
- 電極間隔を制御します。
注:電極間の4mmのスペースは、一般的に使用されます。
- 卵13(図3A)を窓ます):
- 卵の鈍い側にシェルを突き刺すために湾曲したはさみを使用してください。
- 0.9 mm x 25 mm の針と 5 ml のシリンジを使用して 2 ml のアルブミンを取り除きます。卵黄嚢を傷つけないように、針を縦方向に向けます。
- 殻の完全性を維持するために、卵の上部をテープで覆います。
- 湾曲したはさみを使用して、卵から2mlの卵子を取り除くときの圧力を均等にするためにテープの中央にシェルを突き刺す。その後、胚を視覚化するのに十分な大きさの窓を切り、それに取り組むことができる。
- 胚の脱水を避け、マニピュレータにアクセスしやすくするために、〜2 mlの無菌温かいPBS(-Ca2+;-Mg2+)-100 U/mlペニシリン/ストレプトマイシンを加えます。
- DNAを注入し、胚を電気ポレートする
- PBSでプラスミドを希釈し(-Ca2+;-Mg2+)0.5~2 μg/μlの濃度にし、速い緑色の色素を加えて最終的な0.025%濃度に達します。DNAミックスを毛細血管にロードします。インジェクターの使用をお勧めします。
注: 毛細血管抵抗が大きすぎ(つまり、胚を注入するときに困難が発生する可能性があります)、または小さすぎる(毛細血管が大きすぎて胚に損傷を与える可能性があることを意味します)ことを確認してください。また、2μg/μlより高い核酸の濃度は、非特異的な効果を引き起こす可能性があり、制御する必要があります。 - 卵黄嚢と神経管を尾頭側に穿刺し、毛細管を積んだ状態で穿刺する。神経管を浅い角度で入れ、尾から頭部までの内腔をDNAミックスで満たす(図3B)。
注: [高速緑色]では、射出精度を制御できます。 - 4mmの白金電極を、電気ポレートしたいレベルで神経管の両側に素早く配置し、500ミリ秒間隔で31Vの3パルスを50msecに3パルスで3回塗布します(図3C)。
注:現像胚を損傷しないように、電極を心臓や大きな余分な胚容器に置かないようにしてください。電極に泡が形成されるはずです。 - 針で、シェル内のレベルを減少させるためにアルブミンの2 mlを除去します。
- 窓と鈍い側をテープで密閉して密封します。
- 卵が所望の段階になるまで、インキュベーターで38.5°Cに戻します。
- PBSでプラスミドを希釈し(-Ca2+;-Mg2+)0.5~2 μg/μlの濃度にし、速い緑色の色素を加えて最終的な0.025%濃度に達します。DNAミックスを毛細血管にロードします。インジェクターの使用をお勧めします。
- エレクトロポレーションを準備する:
4. 胚埋め込みと凍結切断
- エレクトロポレーション後48時間、エレクトロポレート胚を慎重に収穫する(HH24ステージ)。絨毛管内膜のテープと半分を切ります。胚が黄身に沈むのを防ぐために、胚の下にザルを置き、絨毛球膜の後半を切断する。
- 胚を氷冷PBSで満たされた解剖皿に移す。
- 蛍光ステレオ顕微鏡で神経管内の蛍光を探すことでエレクトロポレーション効率を確認します。
注: RFPをコードするコントロールプラスミドの共エレクトロポレーションは、電気ポポレート領域を可視化するのに役立つ場合があります。 - マイクロスカルプテルを使用して胚を解剖し、脊髄の電気泳動領域を選択する。
- 解剖した胚を24ウェルプレートに移し、pH 7.4 4%パラホルムアルデヒド(PFA)-リン酸緩衝液生理塩基(PBS)、O/Nを4°Cで固定する。
注: 固定ステップは、その「生きている」立体構造におけるpHluorinの安定化を可能にし、したがって、固定/透過組織でpHluorinを使用できるようにするために重要です。固定はpH依存的な蛍光変化を劇的に遅くするが、固定後も立体構造/プロトネーションの変化が起こり得ることを考慮する必要がある。したがって、以下のプロトコル(埋め込み、凍結切片および観察)は、固定ステップの3日以内に、すべてのバッファをpH7で行う必要がある。固定が必要ない場合は、生きた組織切片に対する観察を行うことを推奨する。 - 4%PFAを取り除き、pH 7.4 PBSで胚を洗浄します。
- PBS-15%スクロースで胚をインキュベートし、胚が沈むまで4°Cに保ちます。
- 固定胚をpH 7.4 7.5%ゼラチン-15%スクロースを37°Cで45分間インキュベートし、胚が完全に埋め込まれるようにする。
- 氷の上に埋め込み金型を配置し、固体2ミリメートルベースを達成するためにpH 7.4 7.5%ゼラチン- 15%スクロースの400 μlを追加します。
- 埋め込まれた胚を切り取り先端で吸引し、固体ゼラチンベースに胚を置く。
- pH 7.4 7.5%ゼラチン- 15%スクロースで覆い、ゼラチンが固まる前に鉗子で胚を配置する。
- ゼラチンが固まったら、-40°Cのイソプロパノール浴(ドライアイスまたは液体窒素を使用)を準備し、ゼラチンブロックを5分間凍結します。
- 冷凍ブロックは-80°Cに保ちます。
- 冷凍ブロックを-20°Cに1時間置きます。
- モールドを取り外し、ブロックをポリエチレングリコール媒体でチャックに固定します。
- ブロックがしっかりと固定されたら、チャックをクライオスタットシステムに入れます。
注:染色中の組織の損失を避けるためにコーティングされたスライドを使用してください。 - シリアルクライオセクションを実行します(通常は20μmのクライオセクションが行われます)。
- 泣き切りはRTで15分間乾燥させます。
注: GFP 蛍光の漂白を避けるために、クライオセクションは不必要な光暴露から保護する必要があります。
5. クライオセクションの顕微鏡解析
- 10分間RTでpH 7.4 PBSで凍結切片を水分補給する。
注: 必要に応じて、核はHoechstで染色することができます。 - PBSで0.5 μg/mlのHoechst溶液を使用し、15分間凍結液をインキュベートします。
- スライド3xをpH 7.4 PBSで5分間リンスします。
- スライド取付けに進みます。O/Nを硬化させるpH 7.4(またはより基本的な)ポリビニルアルコール取り付け溶液を使用することができます:慎重にスライドとカバースリップの間の気泡の形成を避けるためにカバースリップを配置します。
- 取り付け媒体は、暗闇の中で4°CでO /Nを硬化させます。
- 反転共焦点顕微鏡を使用して、pHluorin-plexinA1融合タンパク質を正確に視覚化:最適なピンホールと光学分解能でZスタックを実行し、20X(NA 0.75)または40X(NA 1.3)レンズを使用します。
注: pHluorin は、GFP の検出に使用される同じパラメータ (つまり、509 nm の放出ピーク) で検出可能です 。波長励起および検出フィルタの設定は、イメージングソフトウェアによって最適に定義されます。Hoechstは425-460 nm(励起は405 nm)の間で検出され、GFPまたはpHluorinは485-545 nm(励起は473nm)の間で検出され、RFPは575-675 nm(励起は559nm)の間で検出される。
チクチの脊髄のpHluorin-plexinA1およびeGFP発現の代表的な画像を 図4に示す。
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Representative Results
図 1.A. 細胞内におけるpHluorin-plexinA1蛍光特性のスキーム。PHluorinは、pHが酸性(<6)である細胞内区画では、小胞や内生体の中などで酸性であり、pHが中性である細胞外媒体に曝露されると蛍光性を有する。これにより、pHluorin-plexinA1受容体の細胞表面プールのみを可視化することができます。B.pBK-CMV-pHluorin-プレキシンA1クローニング部位の地図。マウス受容体プレキシンA1発現ベクターは、骨格として使用した。このベクターは、細胞膜における効率的なVSVタグ付き受容体挿入を達成するように設計された。これを行うために、セマフォリン3aペプチドシグナルと切断部位は、VSVタグ付き受容体の上流に融合し、独自のシグナルペプチドと切断部位から切断した。PCRにより、NruI/Kpn2I制限部位を用いてVSVタグとPlxnA1の間のフレームにpHluorin配列を挿入した。単一の制限部位は、他の受容体のクローニング戦略を設計するために示される。このスキームは、バイオインフォマティクスソフトウェアから適応されています。
図 2.pHluorin-plexinA1の特性評価は、COS7細胞におけるpH依存性蛍光特性を構築する。A.COS7細胞は、血漿膜におけるpHluorin-plexinA1蛍光の可視化を可能にする共焦点顕微鏡で観察された場合に、pHluorin-plexinA1構築物にトランスフェクトした。スケールバー:20μM. B. coイメージングを介して観察されたpH7.4培地で観察されたpH-plexinA1構築物にトランスフェクトしたCOS7細胞、pH5.5までの培養培地の酸性化後およびpH7.4の再生後の培養培地中での培養液。細胞の輪郭はGFP蛍光集録の点線で示される。スケールバー:10 μM.ここをクリックすると、より大きな画像が表示されます。
図 3. ovoエレクトロポレーション手順で。A.1. シェルの最も大きい側からのアルブミン除去。2. 卵の殻を窓にして胚にアクセスする。B.神経管のDNA/高速グリーン混合注入。C.神経管の両側に電極を配置し、心臓と大きな血管を避け、ひよこ胚のエレクトロポレーションを行う。
図 4.pHluorin-plexinA1エレクトロポレーション後のひよこ神経管凍結切片の顕微鏡分析eGFP(上部パネル)とpHluorin-plexinA1(下部パネル)の発現パターンを、電気ポレートしたひよこ脊髄の比較が示されている。拡大されたパネルは、eGFP(a)のびまん性細胞内局在と比較して、pHluorin-plexinA1(a')の膜蛍光を示す。PlexinA1に関して、拡大されたパネルは、この受容体が床板交差時の原形膜(b')で特異的に富化していることを示している。スケールバー:100 μM. FP:床プレート;前: 交差;ポスト: 交道後。ここをクリックすると、より大きな画像が表示されます。
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Discussion
このプロトコルは、細胞培養およびひよこ胚脊髄の発達コンテキストの両方において軸索誘導受容体のダイナミクスに従うステップバイステップの手順を提供する。
デノボpHluorin タグ付きタンパク質を設計するには、クローニング戦略に関して2つの点を考慮する必要があります。まず、pHluorinタグは、酸性のエンドーソームの内腔に曝され、その結果、細胞膜受容体プールを可視化するために細胞外コンパートメントに曝露されるべきである。したがって、受容体配列に関するpHluorin配列の正しい位置は、研究された受容体の種類(すなわち、受容体のN末端またはC末端部分が細胞外コンパートメントに曝露されているかどうか)に直接依存する。第二に、プロトコルで説明されているように、シグナルペプチドに対するpHluorin配列の位置は、pHluorinと目的の受容体との間のその後の切断を避けるように考慮されるべきである。
この技術の限界は、形質膜での活性化後の受容体の密売に関連している。一般的に、受容体は、機能的および物理的に異なる区画15から構成されるエンドサイトー経路を介して内部化され進行する。ATP駆動プロトンポンプにより、内因性は初期の子宮間体では6回前後、後期子宮体では5回前後、リソソームでは5未満であるが、これら2つの子宮内区画に蛍光を与える気限性では6.4前後、または7.0程度しか維持していない。この問題は、全内部反射蛍光(TIRF)顕微鏡16を用いてインビトロで解決することができる。この技術に内在する第2の制限は、比較的大きなサイズのために、pHluorinタグがタグ挿入部位に応じて受容体活性を破壊する可能性があることである。
その利点にもかかわらず, pHluorin は広く軸索のナビゲーション中に膜タンパク質のダイナミクスと調節を研究するために使用されていません。.精細な作品は、増殖コーン回転中のエキソシトーシスの時空間的ダイナミクスを研究するためにpHluorin を使用して、vitro17.本プロトコルでは、 インビボの軸索の形質膜における受容体の分布を調べるためにpHluorinを使用する方法を示す。pHluorinsは遺伝的にコードされているので、それらは インビボ 分析に特に適しています。我々は 、ovo エレクトロポレーションの後にひよこでその使用を記述しているが、このアプローチは、他の種で使用することができます。実際にエレクトロポレーションは、様々な動物モデル18,19で効率的に動作します。さらに、pHluorinsは 、C.エレガンス、 ショウジョウバエ、またはマウストランスジェニック動物20-23で正常に使用されている。
pH依存性変化はミリ秒範囲で起こるので、pHluorinsは、ライブイメージング6,24に特に適応される。PHluorin融合は、例えば、トランスジェニックマウス23からの嗅覚ニューロンにおけるシナプトブレビンエキソサイトーシスのin vivoダイナミクスを監視するために使用されている。pHluorin融合の生体内イメージングは、ライブイメージング(高速イメージングおよび低光毒性)に適合した共焦点顕微鏡がより効率的かつアクセス可能になる25と、かなりの約束を保持する。生体内でのライブイメージングは、光漂白後の蛍光回復(FRAP)と組み合わせることもでき、エキソサイトーシスまたは拡散をより直接的に26に評価することができる。
他のpH感受性変異体とその組み合わせの使用は、アプリケーションの範囲をさらに拡張することができます。異なるオルガネラにおける受容体の動的分布は、コンパートメント6,27のpHに従って蛍光を変化させるレシオメトリックpHluorinを用いて監視することができた。同様に、pH感受性蛍光タンパク質を膜タンパク質に加えて、その分光性pHluorinに融合させることで、その人身売買に関する重要な洞察を提供できる。さらに、pHtomato29 の最近のクローニングは、同時に2つの受容体のモニタリングを可能にする。これは、受容体複合体の形成に重要な洞察を提供することができます。pHluorinは、誘導キュー30をタグ付けするためにも使用することができるので、リガンドの二重イメージング、およびその受容体も実現可能である。
このプロトコルにおいて、融合タンパク質の発現速度は重要な点であり、特にプロモーターの強さ、融合タンパク質の安定性および細胞をトランスフェクトするために使用されるプラスミドの量に依存する。実際、過剰発現すると、細胞内小胞に融合タンパク質が蓄積し、蛍光の背景が現れる可能性があります。したがって、細胞表面におけるpHluorin融合タンパク質の精密な可視化を達成するために、いくつかの最適化が必要となる場合がある。さらに、固定組織におけるpHluorin-融合タンパク質の使用には、固定中および固定後に特に注意が必要です。実際、pHluorin融合タンパク質の立体構造の安定化は一時的なものでしかありません。したがって、pHはpHluorin信号の損失を防ぐために7を超えて保持されなければならない。さらに、観測は固定後すぐに行う必要があります。最適なタイミングは、特定のpHluorin融合タンパク質に従ってユーザーによって定義される必要があります。
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Disclosures
著者らは開示するものは何もない。
Acknowledgments
ホマイラ・ナワビ、フレデリック・モレット、イザベル・サニャスの助けに感謝します。この研究はCNRS、アソシエーション・フランセーズ・コントル・レ・ミオパシー(AFM)、ANRヤドル、ラベックス・デヴェーカン、ラベック・コルテックス、ERC YODAからV.C.;C.D-BとA.Jは、それぞれラ・リーグ・コントル・ル・ガンとラベックス・DevWeCanフェローシップによってサポートされています。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| COS7 cells | ATCC | CRL-1651 | |
| DMEM GlutaMAX | GIBCO | 61965-026 | |
| Sodium pyruvate | GIBCO | 11360-039 | |
| Amphotericin B | Sigma | A2942 | |
| Fetal bovine serum | GIBCO | 10270-106 | |
| Penicillin/Streptomycin | GIBCO | 15140-122 | |
| Exgen500 reagent | Euromedex Fermentas | ET0250 | |
| PBS -Ca2+ -Mg2+ | GIBCO | 14190-094 | |
| Fast green dye | Sigma | F7252 | |
| 32% Paraformaldehyde aqueous solution | Electron Microscopy | 15714-S | Dilute extemporaneously in PBS to achieve a 4% solution |
| Gelatin from cold water fish skin | Sigma | G7041 | |
| Sucrose | Sigma | S0389 | |
| Cryomount | Histolab | 00890 | |
| Hoechst 34580 | Invitrogen | H21486 | |
| Mowiol 4-88 | Fluka | 81381 | |
| Consumables | |||
| Bottom-glass 35 mm dish | MatTek | P35G-1.5-14-C | |
| 5 ml Syringe | Terumo | SS-05S | |
| Needles 0.9 mm x 25 mm | Terumo | NN-2025R | |
| Capillaries | CML | PP230PO | capillaries are stretched manually in the flame |
| Superfrost Plus Slides | Thermo Scientific | 4951PLUS | |
| Material | |||
| Curved scissors | FST | 129-10 | |
| Microscalpel | FST | 10316-14 | |
| Forceps | FST | Dumont #5 REF#11254 | |
| Equipment/software | |||
| Time lapse microscope | Zeiss | Observer 1 | |
| Temp module S | PECON for Zeiss | ||
| CO2 module S | PECON for Zeiss | ||
| Metamorph software | Metamorph | ||
| Eggs incubator | Sanyo | MIR154 | |
| Electroporator apparatus | Nepa Gene CO., LTD | CUY21 | |
| Electrodes | Nepa Gene CO., LTD | CUY611P7-4 | 4 mm platinum electrodes |
| Fluorescence stereomicroscope | LEICA | MZ10F | |
| Cryostat | MICROM | HM550 | |
| Confocal microscope | Olympus | FV1000, X81 | |
| Fluoview software | Olympus | ||
| CLC Main Workbench software | CLC Bio |
References
- Winckler, B., Mellman, I. Trafficking guidance receptors. Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 2, (2010).
- Jacob, T. C., et al. J. Neurosci. 25, 10469-10478 (2005).
- Nawabi, H., Castellani, V. Axonal commissures in the central nervous system: how to cross the midline. Cell Mol. Life Sci. 68, 2539-2553 (2011).
- Keleman, K., Ribeiro, C., Dickson, B. J. Comm function in commissural axon guidance: cell-autonomous sorting of Robo in vivo. Nat. Neurosci. 8, 156-163 (2005).
- Nawabi, H., et al. A midline switch of receptor processing regulates commissural axon guidance in vertebrates. Genes Dev. 24, 396-410 (2010).
- Miesenbock, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins. Nature. 394, 192-195 (1998).
- Miesenbock, G. Synapto-pHluorins: genetically encoded reporters of synaptic transmission. Cold Spring Harb. Protoc.. 2012, 213-217 (2012).
- Avraham, O., Zisman, S., Hadas, Y., Vald, L., Klar, A. Deciphering axonal pathways of genetically defined groups of neurons in the chick neural tube utilizing in ovo electroporation. J. Vis. Exp. (39), 1792-17 (2010).
- Blank, M. C., Chizhikov, V., Millen, K. J. In ovo electroporations of HH stage 10 chicken embryos. J. Vis. Exp. (9), (2007).
- Wilson, N. H., Stoeckli, E. T. In ovo electroporation of miRNA-based plasmids in the developing neural tube and assessment of phenotypes by DiI injection in open-book preparations. J. Vis. Exp. (68), (2012).
- Rohm, B., Ottemeyer, A., Lohrum, M., Puschel, A. W. Plexin/neuropilin complexes mediate repulsion by the axonal guidance signal semaphorin 3A. Mech. Dev. 93, 95-104 (2000).
- Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. 1951. Dev. Dyn.. 195, 231-272 (1992).
- Korn, M. J., Cramer, K. S. Windowing chicken eggs for developmental studies. J. Vis. Exp. (8), (2007).
- Alberts, P., et al. Cdc42 and actin control polarized expression of TI-VAMP vesicles to neuronal growth cones and their fusion with the plasma membrane. Mol. Biol. Cell. 17, 1194-1203 (2006).
- Perret, E., Lakkaraju, A., Deborde, S., Schreiner, R., Rodriguez-Boulan, E. Evolving endosomes: how many varieties and why. Curr. Opin. Cell Biol. 17, 423-434 (2005).
- Li, Y., et al. Imaging pHluorin-tagged receptor insertion to the plasma membrane in primary cultured mouse neurons. J. Vis. Exp. (69), (2012).
- Tojima, T., Itofusa, R., Kamiguchi, H. Asymmetric clathrin-mediated endocytosis drives repulsive growth cone guidance. Neuron. 66, 370-377 (2010).
- Matsui, A., Yoshida, A. C., Kubota, M., Ogawa, M., Shimogori, T. Mouse in utero electroporation: controlled spatiotemporal gene transfection. J. Vis. Exp. (54), 3024-30 (2011).
- Falk, J., et al. Electroporation of cDNA/Morpholinos to targeted areas of embryonic CNS in Xenopus. BMC Dev. Biol. 7 (107), (2007).
- Holzhausen, L. C., Lewis, A. A., Cheong, K. K., Brockerhoff, S. E. Differential role for synaptojanin 1 in rod and cone photoreceptors. J. Comp. Neurol. 517, 633-644 (2009).
- Shang, Y., Claridge-Chang, A., Sjulson, L., Pypaert, M., Miesenbock, G. Excitatory local circuits and their implications for olfactory processing in the fly antennal lobe. Cell. 128, 601-612 (2007).
- Dittman, J. S., Kaplan, J. M. Factors regulating the abundance and localization of synaptobrevin in the plasma membrane. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 11399-11404 (2006).
- Bozza, T., McGann, J. P., Mombaerts, P., Wachowiak, M. In vivo imaging of neuronal activity by targeted expression of a genetically encoded probe in the mouse. Neuron. 42, 9-21 (2004).
- Sankaranarayanan, S., Ryan, T. A. Real-time measurements of vesicle-SNARE recycling in synapses of the central nervous system. Nat. Cell. Biol. 2, 197-204 (2000).
- Stark, D. A., Kasemeier-Kulesa, J. C., Kulesa, P. M. Photoactivation cell labeling for cell tracing in avian development. CSH Protoc.. 2008, (2008).
- Hildick, K. L., Gonzalez-Gonzalez, I. M., Jaskolski, F., Henley, J. M. Lateral diffusion and exocytosis of membrane proteins in cultured neurons assessed using fluorescence recovery and fluorescence-loss photobleaching. J. Vis. Exp. (60), (2012).
- Hanson, G. T., et al. Green fluorescent protein variants as ratiometric dual emission pH sensors. 1. Structural characterization and preliminary application. Biochemistry. 41, 15477-15488 (2002).
- Rose, T., Schoenenberger, P., Jezek, K., Oertner, T. G. Developmental refinement of vesicle cycling at schaffer collateral synapses. Neuron. 77, 1109-1121 (2013).
- Li, Y., Tsien, R. W. pHTomato, a red, genetically encoded indicator that enables multiplex interrogation of synaptic activity. Nat. Neurosci. 15, 1047-1053 (2012).
- de Wit, J., Toonen, R. F., Verhage, M. Matrix-dependent local retention of secretory vesicle cargo in cortical neurons. J. Neurosci. 29, 23-37 (2009).
