Die Bodenplatte ist eine wichtige Struktur der Entwicklung des Rückenmarks und bietet diffusionsfähige Signale an Vorläuferzellen und Neuronen differenzieren. Wir beschreiben eine Methode zur Bodenplatte konditionierten Medium zu produzieren, um es an die frische Rückenmarksgewebe anzuwenden und die Auswirkungen auf die Proteine von Interesse durch Biochemie beurteilen.
Während der Entwicklung Vorfahren und post-mitotischen Neuronen empfangen Signale von benachbarten Gebieten, die ihr Schicksal zu regulieren. Die Bodenplatte ist eine Gruppe von Gliazellen entlang der Ependymzellen Kanal in Bauchlage. Die Bodenplatte drückt Taste Morphogenen Beitrag zur Strukturierung der Zelllinien in das Rückenmark. In späteren Entwicklungsstadien, die Bodenplatte regelt die Navigation der Axone im Rückenmark, als ein Hindernis für die Überquerung des ipsilateralen Axone und Controlling Mittellinie Kreuzung von kommissuralen Axone 1 zu verhindern handeln. Diese Funktionen werden durch die Sekretion verschiedener Führungssignale erreicht. Einige dieser Hinweise dienen als Lockmittel und Repellentien für die wachsenden Axone während andere regeln Führung Rezeptoren und nachgeschalteten Signal, um die Empfindlichkeit der Axone zu den lokalen Führungssignale 2,3 modulieren. Hier beschreiben wir eine Methode, die die Untersuchung der Eigenschaften von Boden-Platte abgeleiteten Signale in einer Vielzahl von Ent erlaubtlopmental Zusammenhänge, bezogen auf die Produktion von Boden-Platte konditionierten Medium (FP cm) 4-6. Wir veranschaulichen dann die Verwendung dieses FP cm im Rahmen der Axon Führung. Zunächst wird das Rückenmark von Mausembryo bei E12.5 isoliert und der Boden-Platte herauspräpariert und in einem Plasma-Thrombin-Matrix (Abbildung 1) kultiviert. Zweite zwei Tage später, sind kommissuralen Gewebe aus E12.5 Embryonen seziert, zerrieben und mit der FP cm ausgesetzt. Drittens werden die Gewebe für die Western-Blot-Analyse der Kommissuren Marker verarbeitet.
Die Bodenplatte ist eine bekannte Muster Zentrum der Entwicklung von Rückenmark, spielen Schlüsselrollen in der Spezifikation von Vorläufern und postmitotische Zelllinien und Steuerung Axon Navigation 7,8. Die hier beschriebene FP cm erzeugen experimentelle Verfahren ermöglicht Forschern, die funktionellen Eigenschaften der Bodenplatte abgeleiteten Signale in einem verschiedenen Kontexten von Entwicklungsprozessen von Zelle Strukturierung und das Überleben zu Zelle und Axon Migration zu beurteilen.
Um die Verwendung solcher FP cm erläutern, werden dorsalen Rückenmarksgewebe enthält kommissuralen Neuronen seziert, dilacerated und mit der FP cm stimuliert. Die Gewebe können dann zur Western-Blot-Analyse verarbeitet. Dies ermöglicht die Untersuchung Bestimmungen des Axon Führung Maschinen durch Bodenplatte freigegeben Signale. Das Verfahren zur Behandlung von dilacerated frischem Gewebe hält den großen Vorteil der Erhaltung der Mikroumgebung der Zellen innerhalb the Gewebe. Somit werden die Auswirkungen der Behandlung von FP cm oder jede Behandlungsarten werden in einer physiologischen Weise als in Zell-und Gewebekulturbedingungen geprüft.
Die Produktion von Bodenplatte konditionierten Medium bietet eine effiziente und einfache Möglichkeit für die Beurteilung der biologischen Eigenschaften der Bodenplatte frei Signale.
Das Plasma-Thrombin-Matrix bietet eine hervorragende Voraussetzung für die Gewebeüberlebens. Dennoch könnte diese angereicherten Umgebung eine Beschränkung für einige Typen von Experimenten. So kann die Bodenplatte Gewebe auch in Agarose-Matrix kultiviert werden. Die Qualität der Bodenplatte konditionier…
The authors have nothing to disclose.
Wir danken Karine Kindbeiter, Muriel Bozon und Florie Reynaud für ihre Hilfe. Die Arbeit wird von CNRS, ANR YODA Programm und Labex DevWeCan unterstützt.
Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
REAGENTS REQUIRED | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
PBS | Invitrogen | 14190-094 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
HBSS, Ca2+/Mg2+– free | Invitrogen | 14170-088 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Glucose | Sigma | G-7021 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Neurobasal | Invitrogen | 21103-049 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Plasma | Sigma | P-3266 | 1mg/ml (Reconstitute in H2O and filtrate) | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Thrombin | Sigma | T-4648 | 10mg/ml(Reconstitute in H2O and filtrate) | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
B27 | Invitrogen | 17504-044 | 50X | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Hepes (260g/mol) | Sigma | H-7006 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
EDTA | Sigma | E-5513 | 0,5M pH8 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
MgCL2 | Euromedex | 2189 | 1M | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Glycerol | VWR | 24388.295 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
IGEPAL | Sigma | I-3021 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Complete Protease inhibitor Cocktail Tablets | Roche | 04 693 116 001 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sodium Orthovanadate (Na3VO4) | Sigma | S-6508 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
distilled H2O | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Table 1. Reagents required | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
TOOLS AND MATERIAL | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Surgical scissors | Fine Science Tools | 14002-12 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Adson forceps | Fine Science Tools | 11027-12 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Dumont #5 Fine Tips forceps | Fine Science Tools | 11254-20 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
micro knives | Fine Science Tools | 10136-14 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Table 2. Tools and material | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
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