Summary

Kultur von isolierten Bodenplatte Tissue und Produktion von konditioniertem Medium, um funktionelle Eigenschaften von Bodenplatte aufgelegt Signale beurteilen

Published: February 11, 2014
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Summary

Die Bodenplatte ist eine wichtige Struktur der Entwicklung des Rückenmarks und bietet diffusionsfähige Signale an Vorläuferzellen und Neuronen differenzieren. Wir beschreiben eine Methode zur Bodenplatte konditionierten Medium zu produzieren, um es an die frische Rückenmarksgewebe anzuwenden und die Auswirkungen auf die Proteine ​​von Interesse durch Biochemie beurteilen.

Abstract

Während der Entwicklung Vorfahren und post-mitotischen Neuronen empfangen Signale von benachbarten Gebieten, die ihr Schicksal zu regulieren. Die Bodenplatte ist eine Gruppe von Gliazellen entlang der Ependymzellen Kanal in Bauchlage. Die Bodenplatte drückt Taste Morphogenen Beitrag zur Strukturierung der Zelllinien in das Rückenmark. In späteren Entwicklungsstadien, die Bodenplatte regelt die Navigation der Axone im Rückenmark, als ein Hindernis für die Überquerung des ipsilateralen Axone und Controlling Mittellinie Kreuzung von kommissuralen Axone 1 zu verhindern handeln. Diese Funktionen werden durch die Sekretion verschiedener Führungssignale erreicht. Einige dieser Hinweise dienen als Lockmittel und Repellentien für die wachsenden Axone während andere regeln Führung Rezeptoren und nachgeschalteten Signal, um die Empfindlichkeit der Axone zu den lokalen Führungssignale 2,3 modulieren. Hier beschreiben wir eine Methode, die die Untersuchung der Eigenschaften von Boden-Platte abgeleiteten Signale in einer Vielzahl von Ent erlaubtlopmental Zusammenhänge, bezogen auf die Produktion von Boden-Platte konditionierten Medium (FP cm) 4-6. Wir veranschaulichen dann die Verwendung dieses FP cm im Rahmen der Axon Führung. Zunächst wird das Rückenmark von Mausembryo bei E12.5 isoliert und der Boden-Platte herauspräpariert und in einem Plasma-Thrombin-Matrix (Abbildung 1) kultiviert. Zweite zwei Tage später, sind kommissuralen Gewebe aus E12.5 Embryonen seziert, zerrieben und mit der FP cm ausgesetzt. Drittens werden die Gewebe für die Western-Blot-Analyse der Kommissuren Marker verarbeitet.

Introduction

Die Bodenplatte ist eine bekannte Muster Zentrum der Entwicklung von Rückenmark, spielen Schlüsselrollen in der Spezifikation von Vorläufern und postmitotische Zelllinien und Steuerung Axon Navigation 7,8. Die hier beschriebene FP cm erzeugen experimentelle Verfahren ermöglicht Forschern, die funktionellen Eigenschaften der Bodenplatte abgeleiteten Signale in einem verschiedenen Kontexten von Entwicklungsprozessen von Zelle Strukturierung und das Überleben zu Zelle und Axon Migration zu beurteilen.

Um die Verwendung solcher FP cm erläutern, werden dorsalen Rückenmarksgewebe enthält kommissuralen Neuronen seziert, dilacerated und mit der FP cm stimuliert. Die Gewebe können dann zur Western-Blot-Analyse verarbeitet. Dies ermöglicht die Untersuchung Bestimmungen des Axon Führung Maschinen durch Bodenplatte freigegeben Signale. Das Verfahren zur Behandlung von dilacerated frischem Gewebe hält den großen Vorteil der Erhaltung der Mikroumgebung der Zellen innerhalb the Gewebe. Somit werden die Auswirkungen der Behandlung von FP cm oder jede Behandlungsarten werden in einer physiologischen Weise als in Zell-und Gewebekulturbedingungen geprüft.

Protocol

TAG 1 1. Dissektion der Spinal Cord Bodenplatte (FP) aus E12.5 Maus Embryonen Hinweis: Das gesamte Verfahren erfordert die Verwendung von sterilen Bedingungen. Es ist bevorzugt, die Dissektion unter einer Haube Dissektion durchführen, um eine Kontamination zu vermeiden. Die Oberfläche der Abzugshaube mit Ethanol gereinigt werden. Alle Dissektionsinstrumente sterilisiert und aufbewahrt werden in einer sterilen Petrischale. Die Flüssigkeiten (medium,…

Representative Results

Kommissur-Gewebe wurden durch das FP cm behandelt, und die Proben wurden zur Analyse der Rezeptorspiegel im Western-Blot bearbeitet. Die Anwendung der FP cm wurde gezeigt, um die Ebenen eines Führungs Rezeptor, PlexinA1, die die Empfindlichkeit des kommissuralen Axone der Mittellinie abweisend Semaphorin3B nach der Überquerung (Abbildung 2) vermittelt zu erhöhen. Dies zeigte, dass Signale, die von der FP veröffentlicht regulieren PlexinA1 Ebenen 4,6. <p class="jo…

Discussion

Die Produktion von Bodenplatte konditionierten Medium bietet eine effiziente und einfache Möglichkeit für die Beurteilung der biologischen Eigenschaften der Bodenplatte frei Signale.

Das Plasma-Thrombin-Matrix bietet eine hervorragende Voraussetzung für die Gewebeüberlebens. Dennoch könnte diese angereicherten Umgebung eine Beschränkung für einige Typen von Experimenten. So kann die Bodenplatte Gewebe auch in Agarose-Matrix kultiviert werden. Die Qualität der Bodenplatte konditionier…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Wir danken Karine Kindbeiter, Muriel Bozon und Florie Reynaud für ihre Hilfe. Die Arbeit wird von CNRS, ANR YODA Programm und Labex DevWeCan unterstützt.

Materials

Name of Reagent/Material Company Catalog Number Comments
REAGENTS REQUIRED
PBS Invitrogen 14190-094
HBSS, Ca2+/Mg2+– free Invitrogen 14170-088
Glucose Sigma G-7021
Neurobasal Invitrogen 21103-049
Plasma Sigma P-3266 1mg/ml (Reconstitute in H2O and filtrate)
Thrombin Sigma T-4648 10mg/ml(Reconstitute in H2O and filtrate)
B27 Invitrogen 17504-044 50X
Hepes (260g/mol) Sigma H-7006
EDTA Sigma E-5513 0,5M pH8
MgCL2 Euromedex 2189 1M
Glycerol VWR 24388.295
IGEPAL Sigma I-3021
Complete Protease inhibitor Cocktail Tablets Roche 04 693 116 001
Sodium Orthovanadate (Na3VO4) Sigma S-6508
distilled H2O
Table 1. Reagents required
TOOLS AND MATERIAL
Surgical scissors Fine Science Tools 14002-12
Adson forceps Fine Science Tools 11027-12
Dumont #5 Fine Tips forceps Fine Science Tools 11254-20
micro knives Fine Science Tools 10136-14
Table 2. Tools and material
Dissection and FP culture
Ethanol 70%
dissection hood
dissection microscope
Petri dishes
glass coverslips 18mm x 18mm
Bunsen gas burner
24 well plate
tissue culture incubator (37°C, 5% CO2, humidity controlled)
Centrifuge
RECIPES
FP culture media
Neurobasal
B27 1/50e dilution from stock
HBSS – Thrombin
HBSS 1 ml
Thrombin 10mg/ml 30 μl
Lysis Buffer pH7,4
Hepes (260 g/mol) 25mM
EDTA (pH8) 5mM
MgCL2 1mM
Glycerol 10%
IGEPAL (NP40) 0.10%
Protease Inhibitor Cocktail 1X
Sodium Orthovanadate 0,2M
H2O
Laemmli Buffer
Tris 0,5M, pH 6,8 375 mM
SDS 6%
Glycerol 60%
DTT 0,6M
Bromophenol blue
H2O

References

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Cite This Article
Charoy, C., Arbeille, E., Thoinet, K., Castellani, V. Culture of Isolated Floor Plate Tissue and Production of Conditioned Medium to Assess Functional Properties of Floor Plate-released Signals. J. Vis. Exp. (84), e50884, doi:10.3791/50884 (2014).

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